劉楚麗 魯海龍 陳虹瑾 孫洪濤 馬榮

摘要：【目的】明確引起野杏穿孔病的嗜果刀孢菌（Wilsonomyces carpophilus）在致病過程中主要酶的種類及活性?！痉椒ā客ㄟ^3，5-二硝基水楊酸（DNS）法開展了細胞壁降解酶的種類及其活性的測定，并分析了野杏葉片受嗜果刀孢菌侵染后抗氧化酶活性的變化?！窘Y果】首次發(fā)現嗜果刀孢菌在體外不同誘導物培養(yǎng)條件下均可產生木聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）等6 種細胞壁降解酶，且酶活性呈顯著差異。嗜果刀孢菌侵染野杏葉片后產生的細胞壁降解酶中PG和PMG酶活性最高，羧甲基纖維素酶活性最低；過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）3 種抗氧化酶活性隨嗜果刀孢菌侵染時間的延長呈先上升后下降趨勢。【結論】首次明確果膠酶在嗜果刀孢菌致病過程中起重要作用，野杏葉片受嗜果刀孢菌危害后體內抗氧化酶活性升高。

關鍵詞：野杏；穿孔?。皇裙舵呔?；細胞壁降解酶；抗氧化酶

中圖分類號：S662.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）04-0747-10

野杏（Prunus armeniaca）是世界上廣泛栽培杏的起源物種，也是我國新疆特色果樹的重要種質資源，具有極高的科研價值、生態(tài)價值及應用價值[1]。近年來，穿孔病的發(fā)生已成為威脅野杏健康生長的重要影響因子，其中以嗜果刀孢菌（Wilsonomycescarpophilus）引起的穿孔病最為嚴重。該病原菌具有潛伏侵染的特性，主要危害核果類植物的葉片和果實，也可危害嫩枝、休眠芽及花萼，嚴重影響植株生長和果品質量[2-4]。目前，國內外關于嗜果刀孢菌的研究多集中在病原菌的種類和防治方面，少數學者研究了該菌的流行病學、真菌寄主范圍、遺傳多樣性及次生代謝產物等[3-11]。關于嗜果刀孢菌引起的穿孔病致病機制的研究很少，尚未有嗜果刀孢菌致病過程中產生的酶的種類及活性的相關研究。

病原菌與寄主的相互作用是一個十分復雜的過程，病原菌產生對寄主正常生理活動有影響的代謝產物。酶、毒素和生長調節(jié)物質是國內外科研工作者研究最多的病原物主要的三大致病因子[12]。研究發(fā)現植物在受到病原物侵染后，膜系統(tǒng)受到傷害，細胞膜透性增強，過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶會參與植物的防御，這些指標被作為植物抗病性鑒定的重要生理指標[13]。此外，宿主細胞壁是阻止病原真菌侵入的一道屏障。病原真菌入侵時通過分泌多種細胞壁降解酶，降解組成宿主細胞壁的各種多糖物質，從而破壞細胞壁和胞間層，或導致細胞分離，組織潰散[14]。Adaskaveg[15]證實了扁桃穿孔病病原菌（W.carpophilus）在侵入寄主的過程中先破壞細胞壁，在一定程度上加速了病原菌侵入。Chiu 等[16]的研究表明，果膠酶在褐腐菌（Monilinia fructicola）致病過程中發(fā)揮了重要的作用。王鵬程等[17]也證實了細胞壁降解酶在棗黑斑病菌（Alternaria sp.）侵入棗果過程中的作用。然而不同的病原菌所分泌的細胞壁降解酶種類是不同的，并且不同的降解酶在致病過程中發(fā)揮的作用也不同。目前關于嗜果刀孢菌（W. carpophilus）在危害野杏穿孔病的過程中產生的細胞壁降解酶的種類及其活性變化等研究未見報道，以及嗜果刀孢菌侵染過程中寄主體內抗氧化酶的生理指標是如何變化的尚不清楚。

筆者在本研究中通過嗜果刀孢菌活體外誘導培養(yǎng)和接種野杏葉片后，采用3，5- 二硝基水楊酸（DNS）法和考馬斯亮藍（Bradford）法測定嗜果刀孢菌在野杏葉片內外產生的細胞壁降解酶活性，分析比較其變化趨勢。研究結果為深入了解其致病機制提供理論依據及對開展穿孔病的預防和控制等工作具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：嗜果刀孢菌菌株XJAU-Y046-7m2 源自天山野果林野杏葉片，種類鑒定由前期研究完成[18]。供試寄主：栽植于新疆農業(yè)大學試驗地的2～3 a（年）的野杏。

1.2 方法

1.2.1 嗜果刀孢菌體外細胞壁降解酶的提取 以Czaper 液體培養(yǎng)基（KNO3 2.0 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 ·7 H2O 0.5 g）為基礎培養(yǎng)基，分別添加10 g 不同誘導物至錐形瓶中，主要有蔗糖、果膠、微晶纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、濾紙粉、脫脂棉屑、野杏葉片，最后用蒸餾水定容至1 L。通過磷酸將培養(yǎng)基的pH 調至5.0，于121 ℃高溫滅菌20 min。

將PDA平板上純化培養(yǎng)10 d 的嗜果刀孢菌，用直徑0.5 cm 打孔器選取菌落生長一致的菌餅，選取5 個菌餅置于盛有100 mL上述培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶內，25 ℃下振蕩培養(yǎng)7 d 后過濾去除菌絲，4 ℃ 10 000 r·min-1 離心30 min，棄去沉淀，留上清液（粗酶液）備用[17，19]。

1.2.2 嗜果刀孢菌產生的細胞壁降解酶的活性測定 參考Douaiher 等[20]和Siah 等[21]的研究方法測定羧甲基纖維素酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性。利用DNS比色法，在分光光度計540 nm處測定反應混合物吸光值，根據酶反應所釋放的還原糖含量計算上述酶活性。酶活性單位為50 ℃下每分鐘每毫升酶液（每毫克蛋白）催化底物產生1 μmol還原糖所需酶量，根據D-半乳糖醛酸標準曲線計算生成的還原糖。

果膠甲基反式消除酶（PMTE）的活性測定：在232 nm處測定反應混合物吸光值，30 ℃下每分鐘每毫升酶液催化底物釋放1 μmol 不飽和醛酸為一個酶活單位（U·mL-1）。酶蛋白濃度測定按照Bradford的方法，用考馬斯亮藍G-250 顯色，在595 nm 比色測定，用牛血清做標準曲線。

1.2.3 嗜果刀孢菌產生細胞壁降解酶對野杏葉片的降解作用 采用離體針刺法，將1.2.2 中得到的經7 種誘導物誘導的酶液各2 mL，分別滴加在無菌的棉球上，使棉球完全潤濕。取野杏葉片，用滅菌后的3 號昆蟲針在葉片的左右兩側對稱針刺大小一致的傷口，右邊接種以酶液潤濕的棉花，左邊以煮沸滅活的酶液為對照處理，每個處理3 次重復。25 ℃左右光照條件下培養(yǎng)，7 d 后觀察葉片變化情況。

1.2.4 嗜果刀孢菌在野杏葉片內產生細胞壁降解酶的提取 將PDA 平板上純化培養(yǎng)10 d 的嗜果刀孢菌，用直徑0.5 cm打孔器選取菌落生長一致的菌餅，接種至健康的野杏葉片上，以接種空白培養(yǎng)基作為對照，于接種后2、4、6、8、10、12、14、16 d 分別取樣。稱取葉片1 g，放入研缽中，冰浴研磨，加入5 mL1 mol ·L- 1 NaCl 提取液（20 mmol ·L- 1 Tris-HCl 緩沖液，pH 值7.4），4 ℃、5000 r · min-1下離心15 min，取上清液（粗酶液）備用，4 ℃保存。

1.2.5 野杏葉片中抗氧化酶的提取及活性測定 葉片的接種方法同1.2.4，于接種后1、3、5、10、15 d分別取樣。稱取1 g 野杏葉片，剪碎放入研缽中，加適量磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿，4 ℃，12 000 r ·min-1，冷凍離心30 min，取上清液為提取粗酶液。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[22]、SOD活性測定采用四唑氮藍還原法[23]、CAT活性測定參照高俊鳳[24]的方法，酶活性根據公式計算，每個處理3 次重復。酶活性= ▲OD ×V0.01×Vt ×w ×t。

式中：0.01為酶活性單位；V是提取酶液的體積；Vt 為測定時酶液用量；w表示用于提取酶的葉片質量；t 為▲OD 變化所用時間；酶活性單位為U/ （鮮質量·時間）。

1.3 數據處理

將測定的全部數據采用Excel 2010 進行處理和分析，計算3 次重復的平均值，利用IBM SPSS Statistics22.0 統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，采用Duncan檢驗法進行多重比較及差異顯著性分析，使用Origin2018 64Bit軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 嗜果刀孢菌在不同外源誘導物下產生細胞壁降解酶的種類

嗜果刀孢菌在7 種不同外源誘導物培養(yǎng)基上均能產生羧甲基纖維素酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基反式消除酶（PMTE），且酶活性呈現顯著性差異（表1）。6 種酶中PG 酶活性最高，其次為PMG、木聚糖酶、Cx、β-葡萄糖苷酶，而PMTE酶活性最低，其中PG、PMG、PMTE 屬于果膠酶，木聚糖酶、Cx、β-葡萄糖苷酶為纖維素酶。嗜果刀孢菌在分別以蔗糖、果膠、羧甲基纖維、微晶纖維素、濾紙粉、脫脂棉屑、野杏葉片為誘導物的培養(yǎng)基中，產生的PG酶活性依次為：（1397.175±34.450）、（1 585.614 ± 0.779）、（563.215 ± 9.290（552.313±20.763）、（519.350 ± 24.951）、（561.917 ± 8.366）、（600.072±5.850）U·mL-1；產生的PMG酶活性依次為（1 061.566±15.658）、（426.168±1.189）（128.715±4.69（125.081±1.579）、（121.188±2.125）、（140.395±0）、（165.053±2.993）U·mL-1；產生的PMTE酶活性依次為（13.127±5.636）、（5.211±1.745）、（8.510±2.285）、（21.703 ± 8.025）、（16.426 ± 4.120）、（2.573 ± 1.143）、（21.703±1.745）U·mL-1。PG、PMG、分別在果膠、蔗糖誘導培養(yǎng)基中酶活性最高，果膠、蔗糖為PG、PMG的最佳誘導物。

2.2 嗜果刀孢菌體外誘導產生細胞壁降解酶的降解作用

將添加不同誘導物蔗糖、果膠、微晶纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、濾紙粉、脫脂棉屑、野杏葉片誘導產生的細胞壁降解酶液分別接種于野杏葉片后呈現不同程度的降解，對照葉片無癥狀。不同誘導物誘導產生的酶液接種至葉片2 d 后接種點出現黃褐色斑點，7 d 后出現黑褐色病斑（圖1）。由病斑直徑顯著性分析可知（表2），以野杏葉片誘導產生的酶液降解野杏葉片的能力最強，發(fā)病病斑最大，其次是以蔗糖、果膠誘導產生的酶液，而以微晶纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、濾紙粉、脫脂棉誘導產生的酶液作用于葉片后呈現的病斑較小，降解能力弱。

2.3 嗜果刀孢菌侵染野杏葉片后細胞壁降解酶的活性變化

2.3.1 纖維素酶活性變化 野杏葉片接種嗜果刀孢菌2 d 后出現黃褐色小圓斑，隨后病斑不斷擴展。野杏葉片接種病菌后Cx 酶活性在2～4 d 呈急劇上升、4～8 d 波動上升、8～16 d 急劇下降的趨勢，酶活性在接種后的第4 天和第8 天出現峰值（49.031、51.626 U·mL-1），依次為對照組的1.313 倍和2.096 倍，酶活性在接種第14 天時急劇下降至40.465 U·mL-1。對照組Cx 酶活性呈現先上升再逐漸下降最后緩慢上升，且處理組Cx酶活性始終高于對照組酶活性（圖2-A）。

受嗜果刀孢菌侵染后野杏葉片內的β-葡萄糖苷酶活性在2～4 d 呈急劇升高、4～12 d 波動下降、12～16 d 緩慢上升的趨勢，接種第4 天酶活性達55.519 U·mL-1為最高峰，為對照組的1.862 倍，隨后在接種第12 天酶活性急劇下降至33.717 U·mL-1。對照組β-葡萄糖苷酶活性隨接種時間的增加呈緩慢波動上升的趨勢（圖2-B）。

木聚糖酶活性變化為2～8 d 呈急劇升高、8～12 d后急劇下降、14～16 d波動下降的趨勢，接種第8天達到高峰，酶活性為116.516 U·mL-1，為對照組的2.014倍，在接種第12天時酶活性急劇下降至88.743 U·mL-1，12 d 后變化較平緩。對照組木聚糖酶活性呈先上升隨后緩慢下降的趨勢，且變化趨勢沒有處理組明顯（圖2-C）。

2.3.2 果膠酶活性變化 PG 酶活性在接種2～6 d短時間內急劇上升，隨后在6～8 d 急劇下降，8～16 d 變化逐漸穩(wěn)定，接種6 d 時達到高峰，酶活性為1 784.435 U·mL-1，為對照組的2.309 倍，隨后在接種第8 天時酶活性急劇下降至632.776 U·mL-1，隨后酶活性變化逐漸穩(wěn)定。對照組PG 酶活性在接種后變化趨勢平緩，PG 酶活性明顯低于處理組（圖3-A）。

PMG酶活性在接種病菌后2～6 d 急劇上升，6～8 d 急劇下降，8～16 d 逐漸平穩(wěn)，接種第6 天時達到高峰，酶活性為530.511 U·mL-1，為對照組的1.981 倍，在接種第8 天時酶活性急劇下降至216.186 U·mL-1，隨后酶活性變化穩(wěn)定。對照組PMG酶活性在接種后有緩慢上升的趨勢，但其變化明顯小于處理組（圖3-B）。

PMTE酶活性在接種病菌后2～8 d 急劇升高，8～16 d急劇下降。接種第8天時酶活性達130.549 U·mL-1為最高峰，為對照組的3.003 倍，隨后酶活性急劇下降，16 d 下降至19.724 U·mL-1 。對照組PMTE酶活性在接種后呈緩慢上升的趨勢，隨后逐漸下降，其PMTE酶活性明顯低于處理組（圖3-C）。

2.4 嗜果刀孢菌侵染野杏后葉片內抗氧化酶的活性變化

野杏葉片受嗜果刀孢菌侵染后，POD活性隨著侵染時間的增加呈上升趨勢，在接種第5天時達到高峰，酶活性為323.889 U · mg- 1 · min- 1，為對照組的5.949 倍。對照組的POD活性隨著時間的增加呈下降趨勢（圖4-A）。CAT活性動態(tài)變化呈1～5 d急劇上升、5～15 d 波動下降的趨勢，接種第5 天后CAT活性達到高峰，為81.111 U·mg-1 ·min-1，為對照組的1.497倍，接種15 d后酶活性為72.778 U·mg-1·min-1。對照組的CAT 活性隨著時間的增加呈緩慢上升趨勢，但其酶活性變化明顯小于處理組（圖4-B）。SOD活性動態(tài)變化為1～3 d 呈緩慢下降、5～10 d 急劇上升、10～15 d 緩慢下降的趨勢，接種第10 天時酶活性達最高峰，為228.675 U·mg-1 ·min-1，為對照組的1.85 倍。對照組的SOD活性隨病菌危害時間的增加呈下降趨勢（圖4-C）。

3 討論

國內外學者研究發(fā)現細胞壁降解酶是病原菌致病過程中產生的關鍵酶。目前尚無嗜果刀孢菌致病過程中產生的酶的種類和活性的研究，筆者在本研究中初步明確嗜果刀孢菌產生的纖維素酶和果膠酶是引起穿孔病發(fā)生的重要致病因子。李寶聚等[19] 發(fā)現黃瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）在不同底物改良的Czaper 液體培養(yǎng)基中和罹病黃瓜組織中均能產生羧甲基纖維素酶（Cx）及果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）。陳曉林等[25]的研究得出蘋果樹腐爛病菌（Valsa ceratosperma）在培養(yǎng)基誘導和病組織侵染中均能產生β-葡萄糖苷酶、Cx、PG、PMG 和木聚糖酶，并且木聚糖酶活性高于其他種類。李沅澤等[26]測得蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria doyhide）在不同誘導培養(yǎng)基上均可產生PG、PMG、內切-4-1，4-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和濾紙酶（FPA），但是在發(fā)病蘋果枝條中未檢測到上述細胞壁降解酶。張大智等[27]測得杧果細菌性角斑病菌（Xanthomonascampestris pv. mangiferaeindicae）在羧甲基纖維素鈉和柑橘果膠誘導培養(yǎng)基和感病杧果葉片中均可分泌Cx、β-glucosidase、PG、PMG、PMTE和PGTE 等細胞壁降解酶，且Cx 和PMG 的活性高于PMTE 和PGTE。金勤等[28]研究得出膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosorioide）在體外產生的PMG 活性遠高于Cx 和漆酶。研究測得嗜果刀孢菌在寄主體內外均可產生Cx、木聚糖酶、PG、PMG、β-葡萄糖苷酶和PMTE 等6 種細胞壁降解酶，在寄主體內外酶活性最高的均為果膠酶中的PMG 和PG，纖維素酶活性最低，表明果膠酶在嗜果刀孢菌致病過程中起到了較為關鍵的作用。前人的研究表明不同種類的病菌分泌的細胞壁降解酶是不同的，在致病過程中起關鍵作用的降解酶也不同。通過將嗜果刀孢菌接種到野杏葉片上發(fā)現，在接種第4 天時PG 和PMG 的活性達到高峰，顯著高于其他5 種細胞壁降解酶活性，木聚糖酶和PMTE 的活性在接種后8 d 達到高峰。表明果膠酶中的PMG 和PG 在嗜果刀孢菌致病過程中分泌最早且果膠酶比纖維素酶對野杏葉片致病作用明顯。筆者研究發(fā)現野杏葉片接種病菌后細胞壁降解酶均表現出起伏變化，是否為野杏葉片的免疫對抗作用有待進一步研究。

在植物與病原物長期協(xié)同進化過程中，植物形成了一系列復雜的防御酶體系抵御病原物的入侵[29]。植物體內的POD、CAT、SOD等是防御酶系統(tǒng)中的關鍵保護酶，可清除植物細胞內產生的O2- .和H2O2 等活性氧物質，以此抵御病原菌入侵的危害[30]。金勤等[28]的研究得出油茶受到炭疽病菌的侵染后，植株體內的POD、PPO 等防御酶的活性顯著升高。韓彥卿等[31]的研究證實白發(fā)病菌（Sclerosporagraminicola）侵染抗病品種后CAT、POD、SOD酶活性升高，且遠遠高于感病品種，相反在感病品種中這幾種酶活性顯著下降，表明POD等防御酶在抵御病原菌和保護植物細胞免受傷害過程中發(fā)揮重要抗病作用。筆者研究發(fā)現野杏葉片接種嗜果刀孢菌后，POD、CAT、SOD 活性均有所升高，野杏葉片的POD等抗氧化酶活性升高，表明野杏葉片在受到嗜果刀孢菌侵染后，會通過調節(jié)自身的抗氧化酶系統(tǒng)減輕植物體內活性氧產生的危害。

嗜果刀孢菌可危害杏（P. armeniaca）、扁桃（Amygdalus communis）、稠李（Padus avium）、西洋梨（Pyrus communis）、蘋果（Malus domestica）和冬青櫟（Quercus ilex）等多種寄主植物[32]，其在不同寄主上產生的酶類及活性變化是否存在差異，以及嗜果刀孢菌在致病過程中是否會產生其他種細胞壁降解酶如漆酶和PGTE 等，還需進一步研究。植物病原菌侵入寄主是一個復雜的過程，除了能向外分泌細胞壁降解酶外，往往還可以產生毒素和激素等致病因子。由于病原菌致病過程中的機制是非常復雜的，關鍵致病因子與不同致病因子間如何協(xié)調作用等，有待深入研究。

4 結論

筆者在本研究中首次發(fā)現嗜果刀孢菌在野杏葉片內外均可產生多聚半乳糖醛酸酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶和果膠甲基反式消除酶等6 種細胞壁降解酶，在野杏葉片內外酶活性最高的均為果膠酶中的PMG和PG，纖維素酶活性最低。嗜果刀孢菌細胞壁降解酶在野杏葉片致病過程中的動態(tài)變化表明果膠酶中的PMG和PG在嗜果刀孢菌致病過程中分泌最早，且果膠酶比纖維素酶對野杏葉片致病作用明顯。野杏葉片受嗜果刀孢菌危害后，POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性升高。

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