王曉旭，鮑坤，徐超，王凱英，楊鎰峰，劉志杰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

魏氏梭菌病（Clostridial gastroenteritis, Clostridial toxicosis）又稱魏氏梭菌中毒癥（Clostridial toxicosis）或產(chǎn)氣莢膜梭菌性腸炎（Clostridial gastroenteritis），是由梭菌屬產(chǎn)氣莢膜梭菌類細(xì)菌引起的多種動(dòng)物共患的一種劇烈腹瀉為特征的急性、致死性腸毒血癥疾病，該病常突然發(fā)病死亡，沒有任何癥狀，以小腸部分壞死、消化道出血和全身實(shí)質(zhì)器官病變?yōu)樘卣鱗1,2]。近年來，該病的發(fā)病率逐年上升，給養(yǎng)鹿業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。正常情況下進(jìn)入健康梅花鹿消化道的魏氏梭菌很少，產(chǎn)生少量毒素，隨糞便排出體外而不表現(xiàn)致病[6,7]。當(dāng)梅花鹿采食了被該菌芽孢污染的飼草和飲水時(shí)可引發(fā)該病。梅花鹿采食大量高蛋白飼料、冰凍的青儲飼料、飼料組成突然改變或被大量芽孢污染的青草，瘤胃微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡被打亂，飼料在瘤胃內(nèi)過度發(fā)酵，大量未消化好的飼料進(jìn)入腸道，致使魏氏梭菌過度繁殖，產(chǎn)生大量毒素，機(jī)體不能及時(shí)排除，吸收入血，引起中毒。2015 年3 月至2020 年7 月，吉林省、黑龍江省、遼寧省和內(nèi)蒙古等梅花鹿養(yǎng)殖場大批梅花鹿發(fā)生腹瀉并死亡，經(jīng)過臨床癥狀、病理變化和病原學(xué)等方面診斷，確定是魏氏梭菌引起的腹瀉和死亡，篩選分離菌株的敏感藥物，經(jīng)過治療后腹瀉得到了治愈，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 樣品采集

無菌采取死亡梅花鹿腸道內(nèi)容物，帶回實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 主要試劑

Ex Taq DNA 聚合酶、pMD18-T 載體、E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自AXYGEN 公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；革蘭氏染色液購于天根生化科技（北京）有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧培養(yǎng)罐購于三菱瓦斯化學(xué)株式會社。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c 小鼠購于蘇州西山生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

通過詢問畜主了解梅花鹿發(fā)病經(jīng)過、飼養(yǎng)管理、用藥和免疫等情況。

2.2 臨床癥狀和病理變化

通過臨床癥狀和病理剖檢，了解梅花鹿的臨床癥狀和病理變化，并初步得出診斷結(jié)果。

2.3 腸內(nèi)容物涂片和鏡檢

2.4 細(xì)菌分離鑒定與主要毒素基因擴(kuò)增

無菌取腸道內(nèi)容物，接菌環(huán)挑取內(nèi)容物于胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃培養(yǎng)24~72 h，挑取可疑菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基。根據(jù)GenBank 已發(fā)表的細(xì)菌16S rRNA 基因和5 種主要毒素基因序列，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)一對通用引物和特異引物，引物序列，見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸50s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

2.5 動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)

將16 株純化的菌株接種液體培養(yǎng)基，37 ℃，培養(yǎng)48h，BalB/c小鼠腹腔注射分離菌株，每株菌株接種6 只小鼠，菌液濃度均調(diào)整為1 109cfu/mL，每只小鼠注射300L 菌液，連續(xù)觀察3 d，記錄小鼠死亡情況，陰性組小鼠注射300L 生理鹽水，空白組無任何處理。

2.6 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）推薦的方法進(jìn)行。試驗(yàn)所選擇藥物包括下列抗生素：卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、左氧氟沙星、菌必治、強(qiáng)力霉素、氯霉素、阿莫西林、鏈霉素、阿米卡星和慶大霉素。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥狀

發(fā)病梅花鹿的特點(diǎn)，發(fā)病急，死亡快，最急病程僅幾個(gè)小時(shí)就死亡。很少見到明顯癥狀，一般發(fā)病十幾個(gè)小時(shí)左右死亡，個(gè)別延遲到3 d左右。病程長的病鹿可見食欲減退或廢絕，精神萎靡，離群單獨(dú)活動(dòng)，呼吸困難，鼻鏡干燥，口流涎，反芻停止；病鹿腹圍增大，體溫升高到41 ℃左右，病危期眼臉腫脹，可視黏膜發(fā)紺；糞便帶血，運(yùn)步拘緊，臨死時(shí)呈現(xiàn)角弓反張；肛門周圍常常被血液污染，含有大量黏液，呈醬紅色，并有腥臭味；死前口吐白沫，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，后肢麻痹，昏迷倒地，見圖1。

圖1 梅花鹿的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of sika deer

圖2 梅花鹿的病理變化Fig.2 Pathological changes of sika deer

圖3 細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 Bacterial Gram staining results

圖4 分離菌株16 S rRNA 基因PCR 鑒定結(jié)果Fig.4 16S rRNA gene amplification results of the isolated strain

圖5 分離菌株Alpha 毒素基因PCR 鑒定結(jié)果Fig.5 Alpha toxin gene amplification results of the isolated strain

3.2 病理變化

病鹿口角和鼻孔有少量泡沫，腹圍明顯腫大；個(gè)別病鹿皮下見有膠樣浸潤；腹腔剖檢后，有多量紅黃色腹水流出；腸系膜淋巴結(jié)、大網(wǎng)膜、胃腸漿膜明顯充血和出血，呈黑紅色；網(wǎng)胃、瓣胃等輕微出血，皺胃胃底和幽門部黏膜脫落，呈紫紅色，有大面積出血斑，嚴(yán)重者呈壞死狀態(tài)；小腸剖開有大量紅紫色“醬油樣”黏液流出；腎臟稍大，變軟；肝臟腫大，呈暗紅色，質(zhì)脆；脾臟顯著腫大，呈暗黑色。

3.3 腸內(nèi)容物涂片鏡檢

死于腸毒血癥的鹿，一般很少能于臟器中分離到細(xì)菌，通常采集回腸內(nèi)容物或出現(xiàn)明顯病變的空腸內(nèi)容物涂片鏡檢，革蘭氏染色后，可見陽性粗短桿菌，兩端鈍圓。

3.4 細(xì)菌鑒定與毒素基因擴(kuò)增

以提取細(xì)菌基因組為模板，采用T1、T2 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖電泳可見約780 bp 處有一條特異的條帶，與預(yù)計(jì)產(chǎn)物片段大小相符，且無雜帶。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株與GenBank中魏氏梭菌16S rRNA 同源性為98%，確定分離菌株為魏氏梭菌。使用魏氏梭菌的5 種主要毒素基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖電泳可見約500 bp 處有一條特異的條帶，序列結(jié)果與GenBank 中α毒素基因同源性為98%，確定分離菌為A 型魏氏梭菌。

3.5 細(xì)菌毒理試驗(yàn)

攻毒小鼠在48 h內(nèi)死亡。死亡小鼠剖檢可見腸黏膜有大量出血點(diǎn)，心內(nèi)膜有出血點(diǎn)，脾臟和肝臟均腫大、出血。將小鼠內(nèi)臟無菌涂板進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，鑒定結(jié)果為分離菌株和攻毒菌株相同，確定攻毒菌株為魏氏梭菌。

3.6 藥敏試驗(yàn)

分離菌株對阿莫西林、左氧氟沙星、氧氟沙星和菌必治高度敏感，對氟苯尼考、卡那霉素、鏈霉素、強(qiáng)力霉素和氯霉素中度敏感，對慶大霉素、新霉素和阿米卡星有耐藥性，見表2。

表2 藥敏試驗(yàn)抑菌圈實(shí)驗(yàn)Table 2 Drug sensitivity test bacteriostatic zone test

4 防治

4.1 治療

絕大部分病鹿的病程非常短，出現(xiàn)癥狀到死亡僅僅幾分鐘或幾十分鐘。雖然對某些菌株篩選出了敏感藥物，但往往來不及治療病鹿就已經(jīng)死亡。對病情較長和受威脅的鹿群可采取抑菌消炎和對癥療法?？勺⑸浯髣┝炕前奉愃幬锖颓嗝顾兀⒉捎媒舛?、強(qiáng)心和補(bǔ)液治療。

4.2 預(yù)防

可選用魏巴氏二聯(lián)苗，鹿皮肌肉注射5 mL，免疫期6 個(gè)月。當(dāng)發(fā)生本病時(shí)，病鹿馬上進(jìn)行隔離治療，未發(fā)病的鹿進(jìn)行緊急免疫，免疫劑量加倍。對鹿舍及周邊地區(qū)進(jìn)行噴霧消毒，如果氣溫過低可使用火堿和生石灰消毒。飼具用消毒液浸泡消毒，防止該病的蔓延，減少該病帶來的損失。

5 討論

魏氏梭菌感染主要包括外源性感染和內(nèi)源性感染兩種途徑。外源性感染主要是鹿采食了被魏氏梭菌芽胞污染的飼料和飲水，內(nèi)源性感染與應(yīng)激有關(guān)，如飼料或天氣突然改變，加之梅花鹿攝入被魏氏梭菌芽孢污染的飲水或飼料，其腸道會發(fā)生相應(yīng)病理變化，如消化障礙、代謝紊亂，魏氏梭菌就會大量繁殖，繁殖過程中產(chǎn)生大量有害代謝產(chǎn)物和外毒素。同時(shí)病鹿腸道內(nèi)的魏氏梭菌會隨糞便排出體外，在環(huán)境中形成芽孢，這些芽孢被其他鹿誤食，會引發(fā)更多鹿感染發(fā)病[8]。研究表明，魏氏梭菌產(chǎn)生的 毒素對小腸黏膜有非常強(qiáng)的損傷作用，胰蛋白酶可以滅活魏氏梭菌產(chǎn)生的 毒素[9]。但是當(dāng)梅花鹿突然采食大量含有胰蛋白酶抑制劑的飼料，如大豆、花生和甘薯時(shí)[10,11]，會導(dǎo)致鹿腸道內(nèi)的蛋白酶的分泌量減少，不能滅活 毒素，使其在腸道內(nèi)大量蓄積，并粘附在腸黏膜的上皮細(xì)胞上，妨礙營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸。同時(shí)由于毒素的作用，導(dǎo)致腸壁的通透性增加，使大量的毒素和細(xì)菌有機(jī)會進(jìn)入血液循環(huán)，引起毒血癥或敗血癥，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)全身器官衰竭，造成死亡。

在臨床樣品采集過程中，我們發(fā)現(xiàn)魏氏梭菌病有明顯的季節(jié)性，每年的2~5 月和11~12 月是該病的高發(fā)季節(jié)，尤其是3~4 月份冰雪融化、青草萌芽的時(shí)候。吉林省幾個(gè)養(yǎng)殖場都是這個(gè)時(shí)期頻繁發(fā)病，我們調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這幾個(gè)養(yǎng)殖場的共同之處是梅花鹿都是半舍飼半放牧的狀態(tài)，因此，推測可能是在放牧過程中梅花鹿采食了受魏氏梭菌芽孢污染的冰凍青嫩飼料，腸道正常的消化和免疫機(jī)能受到干擾和破壞，菌群失調(diào)，魏氏梭菌大量繁殖產(chǎn)生毒素引發(fā)的疾病[12]。其他養(yǎng)殖場發(fā)病可能與采食大量含有胰蛋白酶抑制劑飼料有關(guān)，經(jīng)飼養(yǎng)員詢問，這幾個(gè)養(yǎng)殖場都飼喂了大量豆渣、酒糟和花生餅等飼料，這些飼料含有胰蛋白酶抑制劑，會導(dǎo)致蛋白酶分泌不足，魏氏梭菌產(chǎn)生的毒素不能被蛋白酶滅活，在體內(nèi)大量蓄積，最終引發(fā)疾病。

發(fā)病梅花鹿主要臨床癥狀為食欲減退或廢絕，精神萎靡，離群單獨(dú)活動(dòng)；糞便帶血，呈番茄汁樣，肛門周圍常常被血液污染；眼臉腫脹，可視黏膜發(fā)紺。剖檢可見整個(gè)腸道出血嚴(yán)重，剖開小腸有大量紅紫色“醬油樣”黏液流出；肝臟腫大，呈暗紅色，質(zhì)脆；腎臟稍大，變軟。分離得到的菌株，其菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果與以往報(bào)道的魏氏梭菌相符[3]。對16S rRNA 基因及毒素基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株與GenBank 中魏氏梭菌16S rRNA 同源性為98%，將分離得到的魏氏梭菌接種小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在較短時(shí)間內(nèi)全部死亡，且從小鼠體內(nèi)分離到相同病原，綜合以上結(jié)果分析確定這些鹿場是魏氏梭菌引發(fā)的疾病。

本試驗(yàn)雖然做了藥敏試驗(yàn)，也篩選出來敏感藥物，但是魏氏梭菌引起的疾病病程短、死亡快，往往來不及使用藥物治療，因此加強(qiáng)飼養(yǎng)管理及接種疫苗，可能是春秋有效預(yù)防魏氏梭菌病發(fā)生的必要手段。