HPLC-ELSD測(cè)定黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷的含量

鄭燕　湯麗昌　程妮婭

摘 要：目的：高效液相色譜法測(cè)定黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷的含量。方法：采用Waters XBridge-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（35∶65，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，載氣流速為1.6 L·min-1。結(jié)果：黃芪甲苷在0.020 06～0.501 50 mg·mL-1（r=0.999 6）呈良好線性關(guān)

系，黃芪甲苷加樣回收率為95.7%（RSD=7.6%）、99.5%（RSD=5.3%）、100.5%（RSD=2.3%）。結(jié)論：該法操作簡便﹑結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：黃芪甲苷；黃芪阿膠口服液；高效液相色譜法

Determination of Astragaloside IV in Huangqi Ejiao Oral Liquid by HPLC-ELSD

ZHENG Yan， TANG Lichang， CHENG Niya

（Beihai Institute for Food and Drug Control， Beihai 536000， China）

Abstract： Objective： To determination of astragaloside IV in Huangqi Ejiao oral liquid by high performance liquid chromatography. Method： The Waters XBridge-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） with acetonitrile-water （35∶65， V/V） as mobile phase at a flow of 1.0 mL·min-1， the column temperature of 30 ℃ and carrier gas flow rate of 1.6 L·min-1. Result： The astragaloside IV showed a good linear relationship between 0.020 06～0.501 50 mg·mL-1 （r=0.999 6）. The recovery rate of astragaloside IV was 95.7% （RSD=7.6%）， 99.5% （RSD=5.3%）， 100.5% （RSD=2.3%）. Conclusion： The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the determination of astragaloside IV in Huangqi Ejiao

oral solution.

Keywords： astragaloside IV; Huangqi Ejiao oral liquid; high performance liquid chromatography

黃芪阿膠口服液是以黃芪、阿膠、熟地黃、當(dāng)歸、黨參和葡萄糖酸亞鐵為主要成分加工成的口服液，它具有改善營養(yǎng)性貧血的功效。黃芪阿膠口服液中黃芪為改善營養(yǎng)性貧血的主要功效來源，黃芪中主要成分是黃芪甲苷，黃芪甲苷的含量對(duì)于臨床用藥的安全性及其活性有較大的指導(dǎo)意義[1-2]。

黃芪中黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為質(zhì)量控制成分，其中黃芪甲苷含量指標(biāo)低限是毛蕊異黃酮葡萄糖苷的4倍[3]。因此，采用高效液相色譜法對(duì)黃芪阿膠口服液中含量較高的黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定研究，可為黃芪阿膠口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3批黃芪阿膠口服液，均為市售品（批號(hào)分別為20220602、20220102、20211102）。

1.2 試劑與儀器

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201515，供實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)用），中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；正丁醇為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；氨水為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；水為超純水，密理博純水儀制備；0.45 μm針筒式微孔濾膜過濾器，天津市科藝隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1260II高效液相色譜儀（配蒸發(fā)光檢測(cè)器），安捷倫科技有限公司；HH-6恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；XS205DU萬分之一電子天平，梅特勒有限公司；CPX5800H-C超聲波清洗儀，上海科導(dǎo)儀器有限公司；Simplicity純水儀，美國密理博。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品50.15 mg，置于50 mL

棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含有黃芪甲苷1.003 mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，該溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。

1.3.2 供試品溶液制備

取批號(hào)為20220602的黃芪阿膠口服液10支，取其內(nèi)容物混合，精密量取20 mL置于分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次30 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至

5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，備用。

1.3.3 樣品含量測(cè)定

分別取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋成系列濃度的溶液及3批供試品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)行峰面積數(shù)據(jù)采集，以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)數(shù)方程計(jì)算含量。

1.3.4 色譜條件

Waters XBridge-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（35∶65，V/V），等比例洗脫，流速為1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.5 檢測(cè)器條件

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；蒸發(fā)溫度：90 ℃；漂移管溫度：75 ℃；氣體流速：1.6 L·min-1。

1.3.6 方法學(xué)考察驗(yàn)證

（1）線性關(guān)系考察試驗(yàn)。吸取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋成系列濃度的溶液，精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（黃

芪甲苷質(zhì)量濃度為1.015 mg·mL-1） 5 mL、2 mL，置100 mL棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，精密吸取對(duì)照品溶液（黃芪甲苷質(zhì)量濃度為1.015 mg·mL-1）5 mL、2 mL、1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，制得0.020 06 mg·mL-1、0.050 15 mg·mL-1、0.100 30 mg·mL-1、0.200 60 mg·mL-1和0.501 50 mg·mL-1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液。按“1.3.4、1.3.5”優(yōu)化得到的儀器條件，分別注入20 μL對(duì)照品待測(cè)液，記錄峰面積。以峰面積（mV）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)數(shù)方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

（2）精密度考察試驗(yàn)。精密吸?。?）步驟下所得0.100 30 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下優(yōu)化得到的儀器條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，分別測(cè)其峰面積，并計(jì)算RSD。

（3）穩(wěn)定性考察試驗(yàn)。取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）制備所得供試品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h進(jìn)樣20 μL，記錄黃芪甲苷峰面積，并計(jì)算RSD。

（4）重復(fù)性考察試驗(yàn)。按照“1.3.2”項(xiàng)下，取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）平行制備供試品溶液6份，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，記錄黃芪甲苷峰面積，并計(jì)算RSD。

（5）加標(biāo)回收考察試驗(yàn)。精密量取0.05 mL、

0.10 mL、0.20 mL黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各3份，氮?dú)獯蹈?，分別精密加入混合后的樣品溶液（批號(hào)：20220602）各20 mL。按“1.3.2”項(xiàng)下的制樣方法制備，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，記錄黃芪甲苷峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖分析

取制備好的對(duì)照品溶液、樣品溶液分別注入液相色譜儀，在“1.3.4、1.3.5”條件下進(jìn)樣分析，對(duì)照品色譜圖結(jié)果見圖1，供試品色譜圖結(jié)果見圖2。由供試品色譜圖結(jié)果可以看出，黃芪甲苷峰不受其他成分干擾，其分離度良好，分離度＞24，理論塔板數(shù)均＞12 000。

2.2 樣品含量測(cè)定

精密量取混合后的3批樣品各20 mL，按“1.3.2”步驟的制樣方法制備供試品溶液，然后按“1.3.4、1.3.5”條件進(jìn)行測(cè)定，將所測(cè)得的黃芪甲苷峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，計(jì)算。各樣品黃芪甲苷含量見表1。

2.3 方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系結(jié)果

對(duì)黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍進(jìn)行考察，以峰面積Y（mV）的對(duì)數(shù)值與對(duì)照品待測(cè)液濃度X（mg·mL-1）的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為lgY=4.29+1.77 lgX，相關(guān)系數(shù)r為0.999 6。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.020 06～0.501 50 mg·mL-1線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

2.3.2 精密度考察結(jié)果

精密吸取1.3.6（1）步驟下所得0.100 30 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下優(yōu)化得到的儀器條件，連續(xù)進(jìn)樣針，記錄其峰面積為302.81、299.50、303.48、306.51、313.94和312.60，計(jì)算峰面積RSD為1.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）按照“1.3.2”制備供試品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h進(jìn)樣20 μL，含量測(cè)定結(jié)果為0.013 48 mg·mL-1、0.013 61 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 57 mg·mL-1、0.013 47 mg·mL-1和0.013 49 mg·mL-1，計(jì)算RSD為0.8%，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性考察結(jié)果

按照“1.3.2”取同一批號(hào)（批號(hào)：20220602）平行制備供試品溶液6份，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，含量測(cè)定結(jié)果為分別為0.013 52 mg·mL-1、0.013 60 mg·mL-1、0.013 71 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 16 mg·mL-1和0.013 76 mg·mL-1，計(jì)算RSD為1.7%，結(jié)果表明此分析方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加標(biāo)回收考察結(jié)果

精密量取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（1.015 mg·mL-1）各3份，氮?dú)獯蹈?，分別精密加入混合后的樣品溶液（批號(hào)：20220602）各20 mL。按“1.3.2”項(xiàng)下的制樣方法制備，按“1.3.4、1.3.5”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)樣，每個(gè)樣品進(jìn)兩針，記錄黃芪甲苷峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，測(cè)定方法可靠、符合分析測(cè)試要求。

3 結(jié)論與討論

采用2020版《中華人民共和國藥典》[3]方法測(cè)定黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷發(fā)現(xiàn)，由于該產(chǎn)品是糖漿劑，含有大量蔗糖，受其影響即便優(yōu)化色譜柱、流動(dòng)相及流動(dòng)相比例也無法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分與其他成分的有效分離。因此，采取正丁醇液萃取除去糖分及部分極性較強(qiáng)的其他成分[4-5]，優(yōu)選合適的色譜柱、流動(dòng)相及其比例，再次測(cè)定所得色譜峰型較好，且能和其他成分實(shí)現(xiàn)完全分離，所得色譜峰理論塔板數(shù)高。對(duì)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示蒸發(fā)溫度為90 ℃、漂移管溫度為75 ℃時(shí)響應(yīng)值最高。

本研究所采用的方法所用儀器較為常見，可普遍適用于各生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)控、產(chǎn)品檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)。本法分析時(shí)間較短，線性、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均良好，回收率符合檢測(cè)要求，可為含黃芪甲苷保健食品的質(zhì)量控制提供理論參考。

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123-125.

作者簡介：鄭燕（1992—），女，廣西北海人，本科，助理工程師。研究方向：食品、藥品、生物制劑等質(zhì)量控制及方法研究。