龔 宏,易善萍,聶顯雙,劉 政,李謝雨,楊 立,程寅勝,張 義,伍 濤

(1 長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北荊州,434025;2 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所,武漢,430064;3 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院,武漢,430070)

蛋白質(zhì)是生物重要組成部分和功能單位,深入探究蛋白互作機(jī)制將為了解蛋白質(zhì)的功能提供重要信息[1]。酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白互作的有效分子生物學(xué)方法,在檢測(cè)蛋白之間互作和篩選未知互作蛋白方面得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。例如,前人構(gòu)建了海島棉纖維均一化酵母cDNA文庫(kù),篩選到了4個(gè)可以與GbTCP5互作的蛋白[4]。郭振華等構(gòu)建了桃酵母雙雜交cDNA文庫(kù),篩選出了26個(gè)與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子PpARF4互作的蛋白[5]。程寅勝等利用碭山酥梨cDNA文庫(kù)篩選獲得了13個(gè)與梨糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白PbTMT4潛在互作的蛋白[6]。這些研究促進(jìn)了相關(guān)基因功能機(jī)制的解析,而構(gòu)建高質(zhì)量酵母雙雜交文庫(kù)是開(kāi)展相關(guān)研究的前提。

梨是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水果,提高光合作用效率以增加干物質(zhì)積累是提升梨產(chǎn)量和品質(zhì)的有效技術(shù)途徑[7-8]。本課題組前期利用生理測(cè)定和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析的方法,挖掘出了與梨樹(shù)光合作用密切相關(guān)的關(guān)鍵基因PpPRR5,并通過(guò)瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化的方法驗(yàn)證其具有光合作用的功能,然而其調(diào)制機(jī)制尚不明晰[9-10]。PpPRR5同源基因AtPRR5被報(bào)道是擬南芥?zhèn)螒?yīng)答調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一[11-12],PR(Pseudo-Receiver)結(jié)構(gòu)域和CCT(CONSTANS,CONSTANS-LIKE和TOC1)結(jié)構(gòu)域分別位于該家族N端和C端[11-13]。AtPRR5能與其他家族成員協(xié)同調(diào)控?cái)M南芥生物鐘節(jié)律[13]。在調(diào)控機(jī)制方面,AtPRR5的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平并不完全同步;在光形態(tài)建成早期階段,AtZTL蛋白通過(guò)結(jié)合AtPRR5的PR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)其泛素化降解;AtZTL的LOV結(jié)構(gòu)域可以被藍(lán)光誘導(dǎo)發(fā)生構(gòu)象變化,使AtZTL與AtGI互作利于增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性,阻止AtZTL對(duì)AtTOC1、AtPRR5的泛素化降解[14]。此外,AtPRR蛋白(AtPRR9、AtPRR7和AtPRR5)通過(guò)與AtBBX19發(fā)生蛋白水平上的互作,進(jìn)而調(diào)控AtCCA1、AtLHY和AtRVE8啟動(dòng)子[15]。通過(guò)酵母雙雜交挖掘與PpPRR5互作的蛋白,也將有助于進(jìn)一步解析調(diào)控靶基因的分子機(jī)制,闡明其調(diào)控光合作用的分子機(jī)理。因此,本研究以“圓黃”梨(PyruspyrifoliaNakai cv. Wonhwang)葉片和果肉為材料,構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù),旨在為后續(xù)利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出關(guān)鍵基因的互作蛋白,為深入明晰調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材

1.1.1 植物材料 本研究材料以湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所展示園中的“圓黃”梨樹(shù)(6年生成年樹(shù))為研究試材,采集成熟葉片和果肉組織(盛花后約140天)樣品后液氮速凍,置于-80 ℃冰箱中保存。

1.1.2 試劑與藥品 cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(貨號(hào):630490)、Taq DNA Polymerase(貨號(hào):639141)和T4 DNA Ligase(貨號(hào):2011A)購(gòu)自于Clontech公司。Tris(貨號(hào):T8060)購(gòu)自于Solarbio公司;凝膠回收試劑盒(貨號(hào):9762)購(gòu)自于Fermentas公司。DEPC(貨號(hào):ST036)購(gòu)自于碧云天公司。RNase H(貨號(hào):2158-1)購(gòu)自于TAKARA公司;DMSO(貨號(hào):D8418)購(gòu)自于Sigma公司,異丙醇等其他試劑均為分析純,購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA抽提和雙鏈cDNA的合成 取“圓黃”梨葉片和果肉組織研磨成粉末狀后等質(zhì)量混合,利用Trizol法提取總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDorp 2000檢測(cè)所提取總RNA,并檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。對(duì)總RNA進(jìn)行純化處理,采用SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒中提供的5’-和3’-PCR primer,通過(guò)LD-PCR(Long-distance-PCR)方法合成雙鏈cDNA,使用試劑盒中的CHROMA SPIN Columns + TE-400柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),純化cDNA的長(zhǎng)度范圍為500～2 000 bp,具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。

1.2.2 梨cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 將pGADT7載體線性化,并與梨dscDNA進(jìn)行同源同組反應(yīng)。取連接產(chǎn)物加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,通過(guò)電轉(zhuǎn)化后涂布于LB(氨芐抗性)平板上,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后收集菌體,加入適量甘油后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 梨cDNA文庫(kù)質(zhì)量鑒定 取10 μL文庫(kù)構(gòu)建菌液,按102、104、106倍逐級(jí)稀釋,取100 μL涂布氨芐抗性的LB固體平板,37 ℃倒置培養(yǎng)16 h,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算文庫(kù)滴度。

文庫(kù)滴度cfu/mL=克隆數(shù)目/鋪板體積mL×稀釋倍數(shù)。

隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化后的平板上的單克隆20個(gè),液體搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定,鑒定文庫(kù)插入片段的大小和陽(yáng)性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA和雙鏈cDNA質(zhì)量檢測(cè)

梨果肉和葉片組織等質(zhì)量混合后提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示,RNA主帶清晰,完整性好,無(wú)降解。其中A260/A280=1.86,濃度為0.122 8 μg/μL,表明所提取的RNA含量和純度滿足酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的建庫(kù)要求。

注:M:DL2000 DNA ladder Marker;1:總RNA

雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖2所示,未純化的雙鏈cDNA主要集中在500～2 500 bp。經(jīng)純化柱純化后的雙鏈cDNA,主要分布集中在600～1 500 bp。說(shuō)明純化后的雙鏈cDNA較為集中,分布均勻完整,多態(tài)性較好(見(jiàn)圖3)。

注:M:DL2000 DNA ladder Marker;1:LD-PCR產(chǎn)物

注:M:DL2000 DNA ladder Marker;1:純化后的cDNA

2.2 cDNA文庫(kù)滴度測(cè)定及陽(yáng)性率檢測(cè)

梨cDNA文庫(kù)滴度鑒定結(jié)果如圖4所示,根據(jù)文庫(kù)滴度計(jì)算公式可得文庫(kù)滴度為1.76×108cfu/mL≥1×107cfu/mL,說(shuō)明所構(gòu)建的梨cDNA文庫(kù)所包含的基因信息較完整,文庫(kù)質(zhì)量較好,覆蓋度較廣。

圖4 梨cDNA文庫(kù)滴度鑒定

為檢測(cè)文庫(kù)重組序列的完整性,對(duì)在平板上隨機(jī)挑選20個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶大小主要分布在600～1 500 bp,表明所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)空載率低,cDNA重組序列的完整性較好(見(jiàn)圖5)。

注:M:DL2000 DNA ladder Marker;1-20:PCR產(chǎn)物;+:陽(yáng)性對(duì)照(以pGADT7-T為模板PCR);-:陰性對(duì)照(以水為模板PCR)。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用[16]。例如,通過(guò)構(gòu)建草莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的酵母雙雜交cDNA文庫(kù),篩選出13個(gè)與促分裂原活化蛋白激酶FvM4K1互作的蛋白,進(jìn)一步明晰了FvM4K1參與調(diào)控草莓果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)理[17]。利用已構(gòu)建的花生葉片的cDNA文庫(kù),篩選出5個(gè)與AhCaM互作的蛋白,初步提出了AhCaM提高抗逆性的可能分子機(jī)制[18]。張竹君等[19]成功構(gòu)建了干旱脅迫誘導(dǎo)的高質(zhì)量月季cDNA文庫(kù),并利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到了7個(gè)與RhRD22相互作用的蛋白。本研究以成熟時(shí)期“圓黃”梨的葉片和果肉組織為試材,構(gòu)建梨的酵母雙雜cDNA文庫(kù)。高純度、完整性好的mRNA是構(gòu)建cDNA文庫(kù)的關(guān)鍵,并且直接影響著文庫(kù)的質(zhì)量[20]。本研究提取的梨組織混合RNA樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),RNA純度較高,完整性較好,符合建庫(kù)的要求(見(jiàn)圖1)。cDNA文庫(kù)質(zhì)量主要依賴文庫(kù)的容量、文庫(kù)的重組率和插入片段的大小等方面的評(píng)判[21]。一個(gè)良好的cDNA文庫(kù)要求文庫(kù)滴度至少為1×107cfu/mL[22]。若是文庫(kù)的庫(kù)容量過(guò)低,則會(huì)使文庫(kù)所包含的基因信息不全面,從而會(huì)降低篩選到低豐度基因的概率[23]。本研究通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建的梨酵母雙雜交cDNA文庫(kù),其文庫(kù)滴度為1.76×108cfu/mL,說(shuō)明文庫(kù)質(zhì)量較好(見(jiàn)圖4)。文庫(kù)中的重組cDNA插入片段大小和基因重組率代表重組序列的完整性。植物的cDNA長(zhǎng)度一般在500～3 000 bp之間,文庫(kù)插入片段過(guò)小或過(guò)大均對(duì)文庫(kù)質(zhì)量產(chǎn)生影響[24]。本研究隨機(jī)檢測(cè)構(gòu)建的cDNA文庫(kù),其基因重組率為100%,插入片段主要分布在600～1 500 bp,達(dá)到了構(gòu)建文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn),說(shuō)明文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量較好,能為后續(xù)利用酵母雙雜交技術(shù)篩選關(guān)鍵基因的互作蛋白奠定基礎(chǔ)。