付海寧，丁曉明，李新宇，高博，陸雪穎，梁冠文

1.寶雞市婦幼保健院檢驗(yàn)科，陜西 寶雞 721000；

2.寶雞市婦幼保健院內(nèi)科，陜西 寶雞 721000；

3.寶雞市人民醫(yī)院骨二科，陜西 寶雞 721000

骨質(zhì)疏松累及全身骨骼，其基本病理特征表現(xiàn)為骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)變化、骨小梁坍塌，不僅會(huì)增加骨骼脆性，還會(huì)加大骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，輔助性T 細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)會(huì)產(chǎn)生阻礙骨吸收細(xì)胞生長(zhǎng)及激活的相關(guān)因子，從而在骨質(zhì)疏松過(guò)程中發(fā)揮作用[2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cell，Treg)能發(fā)揮免疫抑制作用，對(duì)骨質(zhì)破壞進(jìn)行抑制[3]。正常骨代謝指的是骨形成(成骨細(xì)胞介導(dǎo))同骨吸收(破骨細(xì)胞介導(dǎo))間的平衡過(guò)程，且在生理下破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞一起對(duì)正常骨轉(zhuǎn)化進(jìn)行控制，進(jìn)而保持骨穩(wěn)態(tài)，骨代謝的不平衡就會(huì)引發(fā)骨疾病，于骨質(zhì)疏松發(fā)展期間，骨代謝也發(fā)揮重要作用[4-5]。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，在分化發(fā)育期間，Th17、Treg被諸多細(xì)胞因子調(diào)控，對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答進(jìn)行參與，經(jīng)分化、激活成骨與破骨細(xì)胞對(duì)骨代謝進(jìn)行干擾[6]。目前，Th17、Treg 細(xì)胞平衡于骨質(zhì)疏松中的具體機(jī)制還不明確?；诖耍狙芯恐荚谔接慣h17、Treg 細(xì)胞平衡在骨質(zhì)疏松患者中的表達(dá)意義及其與骨代謝指標(biāo)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年3月至2022年2 月在寶雞市婦幼保健院診治的120 例骨質(zhì)疏松患者(骨質(zhì)疏松組)的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)同骨質(zhì)疏松相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]相符；(2)骨密度T 值不足2.5 SD；(3)年齡超過(guò)18歲；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有腎、肝功能不全；(2)伴有類(lèi)風(fēng)濕、原發(fā)性甲亢、糖尿病等干擾骨代謝的疾?。?3)6 個(gè)月內(nèi)使用過(guò)干擾骨代謝的藥物。另選擇同期在本院進(jìn)行體檢的健康者100例作為對(duì)照組。骨質(zhì)疏松組中男性51 例，女性69 例；年齡52～76 歲，平均(63.83±6.15)歲。對(duì)照組中男性42例，女性58 例；年齡54～78 歲，平均(64.14±6.33)歲。兩組受檢者性別和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 觀(guān)察指標(biāo)與檢測(cè)方法 (1)Th17、Treg：Th17檢測(cè)：收集所有受檢者空腹?fàn)顟B(tài)下4 mL 全血，選擇乙二胺四乙酸進(jìn)行抗凝，并在60 min 內(nèi)提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，置入佛波醇乙酯、離子霉素、莫能霉素進(jìn)行刺激，在二氧化碳(carbon dioxide，CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，之后置入藻紅蛋白-抗人CD8 mAb 及經(jīng)異硫氰酸熒光素染色后的抗人CD3 mAb，固定液置入后破膜，再置入PERCP-CY5.5 抗人白介素-17A (interleukin-17A，IL-17A)及200 μL 固定液，上機(jī)檢測(cè)。Treg 檢測(cè)：收集所有受檢者空腹?fàn)顟B(tài)下3 mL全血，選擇乙二胺四乙酸進(jìn)行抗凝，并在60 min內(nèi)提取PBMCs，避光后，置入藻紅蛋白-抗人CD8 mAb及經(jīng)異硫氰酸熒光素染色后的抗人CD3 mAb，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，將同定液置入，等待1 h，置入穿膜液，再等待1 h，置入PERCPCY5.5 抗人牛叉頭型基因P3 (Forkhead Box P3，F(xiàn)OXP3) FOXP3 后孵育2 h，將200 μL 固定液置入，上機(jī)檢測(cè)。(2)骨代謝炎性細(xì)胞因子指標(biāo)：收集所有受檢者空腹?fàn)顟B(tài)下5 mL肘靜脈血，以3 000 r/min的速度離心10 min，使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)骨代謝炎性細(xì)胞因子指標(biāo)[包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)]。(3)骨代謝蛋白酶活性指標(biāo)：使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)所有受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標(biāo)[包括基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Ⅰ型膠原吡啶交聯(lián)終肽(collagenⅠcross-linked carboxy terminal telopeptide，ICTP)、Ⅰ型前膠原氨基端原肽(procollagen I of aminoterminal propeptide，PINP)]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman 相關(guān)性分析Th17、Treg 與骨代謝指標(biāo)的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的Th17、Treg水平比較 骨質(zhì)疏松組患者的Th17水平明顯高于對(duì)照組，Treg水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組受檢者的Th17、Treg水平比較(±s，%)Table 1 Comparison of Th17 and Treg levels between the two groups(±s,%)

表1 兩組受檢者的Th17、Treg水平比較(±s，%)Table 1 Comparison of Th17 and Treg levels between the two groups(±s,%)

組別骨質(zhì)疏松組對(duì)照組t值P值例數(shù)120 100 Th17 2.30±0.41 1.43±0.35 16.978 0.001 Treg 3.18±0.78 4.47±0.63 13.568 0.001

2.2 兩組受檢者的骨代謝炎性細(xì)胞因子水平比較 骨質(zhì)疏松組患者的TNF-α、IL-6 水平明顯高于對(duì)照組，IL-10、TGF-β水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組受檢者的骨代謝炎性細(xì)胞因子水平比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in bone metabolism between the two groups(±s)

表2 兩組受檢者的骨代謝炎性細(xì)胞因子水平比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in bone metabolism between the two groups(±s)

組別骨質(zhì)疏松組對(duì)照組t值P值例數(shù)120 100 TNF-α(ng/mL)7.63±1.05 3.36±0.47 39.998 0.001ⅠL-6(pg/mL)33.60±5.35 20.34±3.28 22.539 0.001ⅠL-10(pg/mL)16.61±2.19 29.51±3.55 31.663 0.001 TGF-β(pg/mL)21.39±6.11 40.47±10.35 16.228 0.001

2.3 兩組受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標(biāo)比較 骨質(zhì)疏松組患者的MMP-2、ICTP水平明顯高于對(duì)照組，PINP 水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標(biāo)比較(±s，ng/mL)Table 3 Comparison onthelevels ofbonemetabolicprotease activity indexesbetweenthetwo groups(±s,ng/mL)

表3 兩組受檢者的骨代謝蛋白酶活性指標(biāo)比較(±s，ng/mL)Table 3 Comparison onthelevels ofbonemetabolicprotease activity indexesbetweenthetwo groups(±s,ng/mL)

組別骨質(zhì)疏松組對(duì)照組t值P值120 100 912.36±109.82 648.59±75.28 21.040 0.001 6.50±0.84 4.02±0.56 26.118 0.001 0.85±0.13 1.44±0.20 25.370 0.001例數(shù)MMP-2ⅠCTP PⅠNP

2.4 Th17、Treg與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman分析結(jié)果顯示，Th17 與TNF-α、MMP-2、ICTP 呈正相關(guān)(P＜0.05)，Treg 與TNF-α、MMP-2、ICTP 呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與TGF-β呈正相關(guān)(P＜0.05)，見(jiàn)表4。會(huì)促進(jìn)人核因子KB受體活化因子配體(human nuclear factor KB receptor activator Ligand，RANKL)分泌及破骨細(xì)胞活化，從而使破骨細(xì)胞中的蛋白酶水平增加，介導(dǎo)骨降解過(guò)程[11]。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，骨質(zhì)疏松患者的Th17呈現(xiàn)出過(guò)度活化的狀態(tài)，然而其對(duì)蛋白酶活性及炎性反應(yīng)的干擾機(jī)制還不明確[12]。有文獻(xiàn)顯示，Treg細(xì)胞經(jīng)負(fù)反饋對(duì)破骨細(xì)胞的分化、形成進(jìn)行抑制，在骨代謝平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。Treg細(xì)胞通過(guò)其重要轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 經(jīng)分泌IL-10、TGF-β 等細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫機(jī)制的作用，進(jìn)而參與破骨抑制，降低骨吸收量[14]。本研究顯示，骨質(zhì)疏松患者的Th17水平明顯高于健康體檢者，Treg水平明顯低于健康體檢者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示骨質(zhì)疏松患者可能出現(xiàn)Th17/Treg 平衡失衡。骨質(zhì)疏松患者Th17 水平提升、Treg水平降低，可能是因?yàn)門(mén)h17能夠加快炎性細(xì)胞大量分泌RANKL，而RANKL又能夠在破骨細(xì)胞前發(fā)揮作用，進(jìn)而對(duì)破骨分化進(jìn)行誘導(dǎo)。

表4 Th17、Treg與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation analysis of Th17, Treg and bone metabolism indexes

本研究還顯示，參與骨代謝的相關(guān)炎性細(xì)胞因子，像TNF-α、IL-6水平明顯升高，IL-10、TGF-β水平明顯降低，TNF-α、IL-6能夠誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞，進(jìn)而分泌大量IL-17，最終形成鏈?zhǔn)叫?yīng)，進(jìn)一步加重骨質(zhì)疏松，IL-10、TGF-β降低主要是由于Treg水平的降低導(dǎo)致其分泌的IL-10、TGF-β對(duì)應(yīng)減少。且本研究經(jīng)Spearman分析顯示，Th17同TNF-α呈正相關(guān)，Treg同TNF-α呈負(fù)相關(guān)，同TGF-β呈正相關(guān)。

MMP-2 屬于基質(zhì)金屬蛋白酶中Ⅰ型膠原介導(dǎo)水解的一種重要催化酶，在骨骼Ⅰ型膠原的降解及合成過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)諸多不良產(chǎn)物，PINP為Ⅰ型膠原前體發(fā)生裂解、產(chǎn)生成熟Ⅰ型膠原期間的產(chǎn)物，可反映膠原合成活力，ICTP屬于型膠原水解期間脫落羧基末端的產(chǎn)物之一，可反映膠原降解活力[15-16]。本研究顯示，骨質(zhì)疏松患者的MMP-2、ICTP 水平明顯高于健康體檢者，PINP 水平明顯低于健康體檢者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)

3 討論

骨質(zhì)疏松屬于骨病綜合征之一，它以骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨量降低為病理學(xué)典型表現(xiàn)，臨床中呈現(xiàn)為骨強(qiáng)度衰退、骨脆性提升等，會(huì)增加人體低能量性骨折的發(fā)生率[8]。在宏觀(guān)層面上，臨床特征表現(xiàn)為個(gè)子變矮、駝背、渾身疼痛等腰椎變形，嚴(yán)重者還會(huì)引發(fā)骨折、殘疾，甚至是死亡[9]。骨質(zhì)疏松發(fā)病期間，會(huì)過(guò)度激活炎性反應(yīng)及增加蛋白酶活性，這會(huì)直接影響骨代謝期間的骨吸收與形成，目前，調(diào)控蛋白酶活性及炎性反應(yīng)的機(jī)制還尚未明確[10]。

Th17屬于人體中比較重要的一種CD4+T 細(xì)胞亞群，于維甲酸相關(guān)孤核受體γt(retinoid-relatedorphanreceptorgammat，RORγt)轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)作用下分化、成熟，同時(shí)會(huì)分泌大量IL-17。IL-17促炎活性極強(qiáng)，可以使炎性反應(yīng)激活，同時(shí)干擾骨代謝，除此之外，IL-17還意義(P＜0.05)。提示于骨質(zhì)疏松發(fā)病期間，蛋白酶活性明顯增加，膠原合成產(chǎn)物減少、裂解產(chǎn)物增多。基于此，經(jīng)Spearman 分析顯示，Th17 同MMP-2、ICTP 為正相關(guān)關(guān)系，Treg同MMP-2、ICTP為負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示骨質(zhì)疏松發(fā)病期間，Th17的活化過(guò)度可使蛋白酶活性增強(qiáng)，進(jìn)而加快骨基質(zhì)中的膠原降解，Treg的降低會(huì)提升膠原降解活力。

綜上所述，骨質(zhì)疏松患者的Th17 水平提升，Treg表達(dá)水平降低，它們共同干擾骨代謝期間的炎性反應(yīng)與蛋白酶活性。