程大偉 綜述 鄭軍 審校

三峽大學第一臨床醫(yī)學院(宜昌市中心人民醫(yī)院)肝膽胰外科三峽大學肝膽胰外科研究所，湖北 宜昌 443003

原發(fā)性肝癌是目前我國第四位常見惡性腫瘤及第二位腫瘤致死病因，它主要包括肝內(nèi)膽管癌(ⅠCC)、肝細胞癌(HCC)和混合型(HCC-ⅠCC)三種常見的病理類型，以及兩類罕見的肝母細胞瘤和纖維狀肝細胞癌(FLC)[1-3]。目前作為肝癌篩查和診治的腫瘤標志物有血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、異常凝血酶原(PⅠVKA-Ⅱ)[4-5]，且PⅠVKA-Ⅱ?qū)FP 陰性的肝癌具有重要的診斷價值，可與AFP 互補，進而提高肝癌的早期診斷率[6]。雖然這些標志物為眾多肝癌患者贏得了手術(shù)時機，但其依然有著較高的術(shù)后復發(fā)率。目前肝腫瘤的治療方案已由過去的手術(shù)和傳統(tǒng)化療藥物相結(jié)合的治療方法演變成現(xiàn)在的以手術(shù)為主的綜合治療策略，輔以肝癌轉(zhuǎn)化治療、新輔助治療、分子靶向藥物和傳統(tǒng)化療藥物相結(jié)合的綜合治療。于是肝癌的分子靶向治療已成為近年來臨床治療方案中的新突破口，而探尋一個精準的分子靶點，是安全而有效治療肝臟惡性腫瘤的關(guān)鍵。相關(guān)研究表明人組織激肽釋放酶(human tissue kallikreins，KLKs)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為肝癌診斷、治療以及預后判斷的新型分子生物學靶點[7]。因此，本文就KLKs在肝癌中的表達調(diào)控、作用機理、化療敏感性及預后評估價值方面進行綜述，以期為肝癌的分子靶向治療提供更精準的治療決策。

1 KLKs家族基因介紹

20 世紀30 年代，由Kraut 等在胰腺組織中首次發(fā)現(xiàn)KLKs，KLKs 具有胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的特性，是人類基因組中最大的具有連續(xù)性的絲氨酸蛋白水解酶亞群。KLKs 由14 種激肽釋放酶相關(guān)肽酶(KLK2-KLK15)和人組織激肽釋放酶(KLK1)組成，其編碼基因存在于人類染色體的19q13.3-13.4 長臂上，長度為262 kbp，各成員之間的蛋白質(zhì)水平、三級結(jié)構(gòu)以及基因序列極為保守，分別編碼出相對應(yīng)的KLK1-KLK15 蛋白[8]。目前有關(guān)研究顯示單個KLKs 基因的長度為4～10 kbp，其不僅結(jié)構(gòu)排列緊密而且無假基因存在，KLK4與KLK5之間相鄰最遠，距離為32.5 kbp，而KLK1 與KLK15 之間相鄰最近，二者僅間隔1.5 kbp[9]。著絲粒端與KLK1間有一個非KLKs基因—睪丸酸性磷酸酶(ACPT)，末尾基因KLK14 與末尾基因KLK14 端粒端之間也存在一個非KLKs 基因—唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素9 (Siglec9) (圖1)。KLKs基因編碼序列由4個內(nèi)含子和5個外顯子組成，內(nèi)含子相位高度保守，總是遵循Ⅰ～Ⅱ～Ⅰ～0的模式；外顯子的長度和數(shù)量基本相似，其長度差異主要體現(xiàn)在內(nèi)含子上；編碼的絲氨酸蛋白酶均含保守的絲氨酸(Ser195)、天冬氨酸(Asp102)和三聯(lián)體催化殘基(組氨酸(His57)。此外，多數(shù)KLKs 基因會受到類固醇激素的調(diào)節(jié)，均有10～12 個半胱氨酸殘基，理論上可形成5～6個二硫鍵。

圖1 染色體19q13.4上人組織激肽釋放酶基因位點示意圖Figure 1 Schematic diagram of the human tissue kallikrein gene locus on chromosome 19q13.4

KLKs 有15 個成員(KLK1～KLK15)，廣泛表達于不同表達水平的各種組織中，參與細胞生長、組織重塑等一系列生理過程，雖然KLKs在人體中廣泛表達，但由于其表達水平的顯著差異，使KLKs 在不同部位或組織中產(chǎn)生不同的生理作用[10]。Koumandou等[11]發(fā)現(xiàn)，KLKs在腫瘤微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用，與多類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且部分KLKs 已被當作腫瘤標志物，應(yīng)用于癌癥的早期診斷、治療方案的確立以及預后評估等臨床實踐中。臨床上將KLK3作為前列腺癌的標志物，從而用于其篩查、診療及預后分析[12]；KLK5 與口腔鱗狀細胞癌的侵襲性相關(guān)[13]；KLK5的蛋白表達水平與人胃腺癌的侵襲深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，KLK5可以促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，則KLK5 表達較高的患者總生存期較差[14]；KLK6 是治療卵巢癌的潛在靶點，也是評估卵巢癌不良預后的生物學標志物[15]；KLK7 在結(jié)腸癌等惡性腫瘤的異常表達可促進腫瘤細胞在人體組織中的增殖與侵襲[16]；此外，KLK13 在乳腺腫瘤和卵巢腫瘤的預后評判中亦是關(guān)鍵的生物學標志物，并且在預估胃癌細胞化療敏感性方面也具有潛在的臨床價值[17-18]。由此可見，KLKs與腫瘤的研究緊密相關(guān)。

2 KLKs對肝癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制

隨著學者對KLKs研究的不斷深入，KLKs基因在肝癌的發(fā)生與發(fā)展中的作用也日漸受到研究者們的重視。相關(guān)研究表明，KLKs 的異常表達基本存在于所有的激素依賴性腫瘤和實體瘤中，KLKs 表達失調(diào)并借助不同的信號傳導通路誘導肝腫瘤細胞的增殖、侵襲，進而促進腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移[19-20]。如圖2 所示，KLKs可通過以下方式促進肝癌的進展。

圖2 KLKs促進肝癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機制Figure 2 Mechanism of KLKs promoting invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells

2.1 KLKs可通過蛋白酶激活受體通路介導肝癌細胞的增殖 蛋白酶激活受體(protease-activated receptor，PAR)作為細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體，通過介導細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的信號轉(zhuǎn)導通路及傳遞信號，調(diào)控著多種腫瘤的發(fā)生與進展[21]。Michel等[22]研究證實，KLKs可激活癌細胞中的PAR，通過PAR通路介導腫瘤細胞的增殖作用。KLK6 可通過PAR2 依賴性表皮細胞生長因子受體的反式激活，從而促進癌細胞的增殖并抑制其凋亡，KLK6 也可以介導PAR1 信號通路，使多形性膠質(zhì)細胞瘤的增殖能力增強[23]。

2.2 KLKs可通過介導生長因子通路調(diào)控肝癌細胞的增殖 生長因子(growth factor，GF)是一類由細胞分泌的信號分子，通過與細胞膜上的特異性受體結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞的生長與分化。KLKs 可通過調(diào)節(jié)GF的活性和生物利用度，進而激活蛋白酶活化受體，從而調(diào)控著腫瘤細胞的增殖[24]。有關(guān)研究報道，KLK12通過水解細胞間的GF信號蛋白來調(diào)節(jié)成纖維細胞生長因子-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β1和血管內(nèi)皮生長因子的活性，進而參與腫瘤細胞增殖的調(diào)控[25]；Sano等[26]研究發(fā)現(xiàn)KLK11可水解大多數(shù)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白，通過促進活化的胰島素樣生長因子的釋放來提高其生物利用度，進而在肝癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。此外，KLKs還可通過間接激活GF相關(guān)信號通路進而促進肝癌的惡性轉(zhuǎn)化。Mukai等[27]通過免疫組化法探究了肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)特異性受體酪氨酸激酶MET (mesenchymal epithelial transition factor，MET)和KLK4的表達及磷酸化情況，結(jié)果顯示KLK4可激活MET，間接將前體HGF分散因子轉(zhuǎn)化為磷酸化的形式，進而促進肝癌的進展。

2.3 KLKs可通過調(diào)控雄激素受體促進肝癌細胞的增殖 在激素相關(guān)性腫瘤中，腫瘤細胞的增殖可受KLKs 活性調(diào)節(jié)的影響。Shang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，KLK2可通過雄激素受體(androgen receptor，AR)信號系統(tǒng)，與AR輔助調(diào)節(jié)因子ARA70相互結(jié)合從而誘導AR反式激活，進而促進肝癌細胞的生長與增殖。與KLK2不同的是，KLK4 和KLK14 則是通過水解性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)來調(diào)控AR 的表達，KLK4 僅能水解部分游離的SHBG，而KLK14卻能使SHBG完全水解[29]。

2.4 KLKs 可通過水解細胞黏附分子、細胞間連接蛋白和細胞外基質(zhì)促進肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移 有關(guān)體內(nèi)外試驗結(jié)果表明，KLKs 可介導肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，KLKs 可通過水解某些大分子物質(zhì)如細胞間連接蛋白、細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)和細胞黏附分子等促使肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。Dong 等[30]的研究證實了KLKs 在肝癌細胞中的異常表達，可以降解絕大多數(shù)ECM 分子和黏附蛋白質(zhì)。也有相關(guān)文獻報道，KLKs 促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機制與其水解ECM 蛋白、重塑血管生成有關(guān)，KLK12 可通過促進血小板衍生生長因子B(platelet derived growth factor B，PDGF-B)的合成從而增加血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)的分泌，而這一過程恰與腫瘤血管生成中的內(nèi)皮分化和毛細血管結(jié)構(gòu)的形成密切相關(guān)[31]。ECM 的水解與重塑可使腫瘤細胞獲得局部擴散和侵入血管的能力，更有利于腫瘤細胞的遷移和黏附，例如在內(nèi)皮祖細胞中KLK1 的高表達使VEGF 分泌增加，并使血管內(nèi)皮細胞免受凋亡，KLKs基因通過轉(zhuǎn)導內(nèi)皮祖細胞的遷移和黏附進而誘導新生血管形成[32]。Jiang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在KLK5 高表達的癌細胞系SCC25 中，沉默KLK5 基因的表達后，橋粒黏蛋白1(desmoglein 1，Dsg1)的水解明顯受到抑制，同時細胞的聚集顯著增加，因此，KLKs可通過水解細胞間連接蛋白從而介導細胞間的聚集，進而調(diào)控細胞骨架結(jié)構(gòu)和細胞遷移。而且，KLKs還可借助上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程來增強腫瘤細胞的侵襲及遷移能力[34-35]。在肝癌細胞中，EMT 是由ΔNp63β介導的，高表達的ΔNp63β蛋白可以使KLK6、PAR2的表達上調(diào)和PAR1的表達下調(diào)，從而誘導肝細胞的惡性轉(zhuǎn)變，并借助激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號傳導來促使腫瘤細胞的增殖；而當ΔNp63β表達降低時，KLK6、PAR2的表達下調(diào)和PAR1表達上調(diào)，從而誘導EMT 表型，通過降低侵襲前沿的ERK 信號傳導進而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲[36]。

3 KLKs對肝癌化療敏感性的調(diào)控

眾多研究指出，化療藥物的臨床療效亦受KLKs異常表達的影響。KLKs的異常表達與腫瘤的放療效果也有一定的相關(guān)性，KLK5 對宮頸癌的放射抗性至關(guān)重要，KLK5 的過表達與放療后預后不良有關(guān)，下調(diào)KLK5 的表達會增加放射敏感性，從而為宮頸癌的放療提供新的靶點和標志物[37]。在肝癌組織中，KLK10 的高表達與索拉非尼的化療抵抗顯著相關(guān)，KLK10 可作為索拉非尼治療反應(yīng)的獨立預測標志物[38-39]。Dong 等[40]研究表明，KLK4 高表達與侖伐替尼的耐藥存在著一定的相關(guān)性，在內(nèi)源性高表達KLK4 的OVCA432 細胞系和外源性過度表達KLK4的SKOV-3 細胞系中，KLK4 過表達導致多細胞團簇(multicellular aggregates，MCAs)的形成，從而產(chǎn)生侖伐替尼化療抵抗；而抑制KLK4 的活性可不同程度地逆轉(zhuǎn)MCAs 的形成，從而增強化療敏感性。另有基于3D 球體的動物模型研究報道，侖伐替尼和KLKs/MAPK 信號通路抑制的組合方法可能比單獨使用侖伐替尼化療對晚期肝癌更有效，表明部分KLKs 基因可能與化療藥物耐藥性的形成過程相關(guān)[41]。目前，尚缺乏關(guān)于KLKs在調(diào)控肝癌細胞化療藥物敏感性的機制及過程中的相關(guān)研究，因此開展深入研究或?qū)⒂兄谪S富以KLKs為靶點治療肝癌的新思路。

4 KLKs在肝癌表達和預后評估中的研究進展

近年來KLKs在肝癌中的表達和預后評估中的價值引起了國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注。絕大多數(shù)KLKs蛋白可在正常人體的肝臟組織中表達，其中在肝臟提取物中可觀察到相對濃度較高的KLK7、KLK9 和KLK12，其余KLK的家族成員則可在較低濃度下觀察到；但在mRNA 水平上，除了可以觀察到較低表達水平 的KLK11、KLK12 和KLK14 之 外，其 余KLKs mRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在肝臟中幾乎檢測不到[42-43]?，F(xiàn)階段關(guān)于KLKs與肝癌的研究報道尚不多見。有學者研究發(fā)現(xiàn)KLK1 在ⅠCC 中的表達比健康對照組低[44]。KLK6、KLK7、KLK12 mRNA 基因在正常肝臟標本中幾乎檢測不到，其在肝臟的表達僅見于腫瘤肝轉(zhuǎn)移，而KLK5、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14 mRNA基因不管是在正常肝組織還是在病理性肝組織中的表達均較弱[45]。Lu 等[46]研究指出KLK10 的高甲基化與丙型病毒性肝炎及肝硬化的感染呈正相關(guān)，而與乙型病毒性肝炎感染呈負相關(guān)；另外，KLK10 基因的表達恢復對HCC細胞的基質(zhì)非依賴性生長產(chǎn)生阻礙作用，且增強其對細胞毒性劑的敏感性，這說明KLK10基因的失活在肝癌進展中產(chǎn)生著重要影響。但另有研究表明，KLK10 mRNA 在HCC 中的表達水平與腫瘤的數(shù)目、大小、臨床分期等呈顯著負相關(guān)，而表達水平明顯降低，這說明KLK10的低表達或表達缺失與肝腫瘤的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移緊密相連，可考慮作為評估肝癌預后的良好指標[47-48]。同時，內(nèi)源性KLKs 結(jié)合蛋白Serpin A4 還可通過拮抗KLKs 活性來阻礙血管生成，從而抑制肝癌HepG2細胞增殖并誘導細胞凋亡[49]。吳錦良[50]研究發(fā)現(xiàn)，與KLK9蛋白質(zhì)在癌旁組織及正常肝組織中的表達水平相比，其在肝癌組織中的表達水平更高，而KLK9 mRNA 在肝癌細胞株的表達水平也顯著高于正常肝細胞，說明KLK9 基因可能與正常肝組織的癌變過程密切相關(guān)；該研究還發(fā)現(xiàn)KLK9 蛋白質(zhì)的陽性表達率與腫瘤的大小、分化程度、TNM 分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著的正相關(guān)，說明KLK9 基因可促進肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，是肝癌診斷和預后評價的重要指標。

5 結(jié)語

綜上所述，KLKs在肝癌中表達異常，其可以通過蛋白酶激活受體通路、生長因子通路和雄激素受體等信號通路促進肝癌細胞的增殖，以及通過水解細胞黏附分子、細胞間連接蛋白和細胞外基質(zhì)，并介導肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。KLKs 在肝癌中的表達異常與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，未來可能作為新型生物學標志物應(yīng)用于肝癌的早期篩查、個性化診治以及預后評估中，也有學者提出將KLKs作為肝癌潛在的分子靶點以期豐富肝臟腫瘤的臨床治療策略進而改善患者預后。因此，進一步探索相關(guān)KLKs基因在肝癌組織中的信號傳導通路、表達調(diào)控情況及蛋白的相互作用機理，結(jié)合大量的體內(nèi)外臨床研究，提出有針對性的干預策略，可為肝癌的分子靶向治療提供更加精準的治療決策。