魏云芳，唐健，張若鵬，3，何建萍

1.昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)教研室，云南 昆明 650200；

2.昆明市婦幼保健院昆明學(xué)院附屬婦幼保健醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科，云南 昆明 650000；

3.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000

地中海貧血也稱為珠蛋白生成障礙性貧血，是一種常見的單基因隱性遺傳性疾病，目前對(duì)該病尚無特異性治療方法。地中海貧血可分為α和β兩種類型，其分子機(jī)制與α和β珠蛋白基因發(fā)生改變引起珠蛋白合成異常繼而導(dǎo)致溶血性貧血的發(fā)生有關(guān)。人類α-珠蛋白基因定位于16 號(hào)染色體pl3.3，包括ζ2、ψζ1、ψα2、ψα1、α2和α1基因，由于ζ2和ψζ1基因間以及α1和α2 基因之間存在廣泛的同源序列，兩個(gè)ζ 和2 個(gè)α基因之間往往易發(fā)生不同程度的同源重組，這導(dǎo)致了人類珠蛋白基因拷貝的增加或減少[1-2]，因此，α-地中海貧血基因型包括東南亞型缺失(--SEA)、-α3.7和-α4.2缺失，QS、CS 和WS 點(diǎn)突變，甚至一些未知突變[3-4]。α2-珠蛋白融合基因地中海貧血于2013 年首次通過DNA 序列分析在湖南永州一個(gè)患有Hb H 病的2 歲女孩中被鑒定[5]，其在人群患病情況及分布還不得而知，目前常規(guī)試劑盒不包含該基因位點(diǎn)的檢測，無法滿足臨床對(duì)不同疾病類型進(jìn)行篩查需求。因此，本研究分別采用PCR-導(dǎo)流雜交法、反向點(diǎn)雜交法、缺口PCR (gap-PCR)以及高通量測序技術(shù)檢測1例α2-珠蛋白融合基因血標(biāo)本，探討其在α-地中海貧血融合基因檢測中目前常規(guī)分子診斷方法的應(yīng)用效果，分析其可能存在的缺陷與不足。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 該病例來源于昆明市婦幼保健院2020 年1 月1 日至12 月31 日婚育體檢中心的α2珠蛋白融合基因樣本，籍貫為云南省昆明市祿勸縣，漢族，男性，22歲，既往體健，否認(rèn)輸血史，否認(rèn)家族遺傳病史，無貧血貌，知情同意并簽署相關(guān)同意書。

1.2 標(biāo)本收集 分別用EDTA-K2抗凝管采集兩份3 mL靜脈血，一份進(jìn)行血細(xì)胞分析和血紅蛋白電泳檢測，另一份進(jìn)行地中海貧血基因的測定。

1.3 表型分析 血細(xì)胞分析中觀察血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)等紅細(xì)胞參數(shù)；正常參考值：Hb，女性110～155 g/L，男性120～160 g/L，MCV 82～100 fL，MCH 26～34 pg。血紅蛋白電泳是將電泳出全部條帶的峰值記為100%，各個(gè)條帶所占的峰面積作為條帶的相對(duì)含量；正常參考值：HbA 94.5%～98%，HbF 0～2.0%，HbA 2 2.5%～3.5%。

1.4 地中海貧血基因常規(guī)檢測α-地中海貧血基因檢測試劑盒(gap-PCR 法)(深圳益生堂公司)、PCR-導(dǎo)流雜交法與反向點(diǎn)-雜交法(廣東凱普生物科技股份有限公司與亞能生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒)檢測中國人群常見的α-地中海貧血基因。

1.5 高通量測序技術(shù) 利用高通量測序技術(shù)檢測地中海貧血基因(α+β)508 Plus(委托深圳華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室)。

2 結(jié)果

2.1 表型和基因型 血細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞參數(shù)Hb 為171 g/L、MCV 為81.3 fL、MCH 為25.8 pg，均提示異常，血紅蛋白升高，MCV、MCH 輕度降低。血紅蛋白電泳分析HbA為98.06%，HbA2為1.94%，提示HbA2低于正常參考范圍，基因型為Fusion gene/αα。

2.2 地中海貧血基因常規(guī)檢測結(jié)果 PCR-導(dǎo)流雜交法在-α4.2突變位點(diǎn)見弱顯影，顯色程度淡，(圖1A)，反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)見-α4.2突變位點(diǎn)顯影明顯，呈強(qiáng)顯影(圖1B)，gap-PCR法未出現(xiàn)-α4.2缺失型陽性電泳條帶(1 400 bp)，即為-α4.2陰性(圖2A)，但在750～1 000 bp 區(qū)域可見融合基因條帶(圖2B)。

圖2 gap-PCR法檢測地中海貧血基因圖Figure 2 Detection of thalassemia genes by gap-PCR

2.3 高通量測序結(jié)果 檢測出nt34527T＞C、nt34531A＞C、nt34534G＞A、nt34537C＞A、nt34545G＞A、nt34555A＞G、nt34561T＞C7 個(gè)融合基因突變位置，見圖3。

圖3 高通量測序融合基因位置圖Figure 3 Fusion gene locations by high-throughput sequencing

3 討論

3.1 地中海貧血融合基因形成過程 融合基因是指將兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的編碼區(qū)首尾相連并置于同一套調(diào)控序列(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等)控制之下構(gòu)成的嵌合基因。有研究發(fā)現(xiàn)，α2珠蛋白融合基因的形成是在減數(shù)分裂過程中，α2珠蛋白基因與Ψα1 發(fā)生了不同程度片段重組[5-6]，使α2珠蛋白基因的3'UTR改變導(dǎo)致大量α2珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生，引起α+-地中海貧血。

3.2 融合基因地中海貧血臨床表現(xiàn) 本研究中發(fā)現(xiàn)融合基因地中海貧血基因型為Fusion gene/αα，為雜合子狀態(tài)，血液表型存在輕度異常，但患者未出現(xiàn)貧血的癥狀及體征，表明由α2珠蛋白融合基因引起的α+-地中海貧血為靜止型，無需治療。在當(dāng)融合基因和其他基因位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，可能會(huì)造成不良結(jié)局。Huang等[5]的研究顯示α2珠蛋白融合基因合并--SEA時(shí)，可引起Hb H 病，引起慢性溶血性貧血，余文芳[7]的研究也證明了這一結(jié)果。慢性溶血性貧血可能是由于HbH對(duì)氧的親和力較HbA明顯增加，失去了正常的運(yùn)氧功能進(jìn)而出現(xiàn)溶血造成的。胡俊杰等[2]的研究表明α2珠蛋白融合基因伴有-α4.2缺失的患者呈小細(xì)胞低色素貧血表型，即MCV (68.1 fL)、MCH (20.5 pg)和Hb(115 g/L)均降低。然而在α2珠蛋白融合基因合并β41-42突變的患者則并沒有貧血(Hb 147 g/L)，僅表現(xiàn)為MCV(69.4 fL)及MCH(21 pg)的降低[5]。盡管融合基因的存在不是造成地中海貧血的決定性因素，但在地中海貧血基因篩查和基因診斷中不應(yīng)忽視α2珠蛋白融合基因。

3.3 融合基因地中海貧血檢測方法α2珠蛋白融合基因?yàn)棣?-地中海貧血基因，攜帶者表型通常為靜止型，未引起臨床醫(yī)生重視，這是導(dǎo)致其獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少的原因之一[2，5，8-9]，也是導(dǎo)致臨床在地中海貧血基因篩查和診斷中未將其納入檢測位點(diǎn)范圍的原因之一，導(dǎo)致α2珠蛋白融合基因的檢出率低。因此，α2珠蛋白融合基因篩查和診斷具有一定的挑戰(zhàn)性。

PCR-導(dǎo)流雜交法與反向點(diǎn)-雜交法主要用于檢測α-地中海貧血基因--SEA、-α3.7和-α4.2三種缺失以及QS、CS 和WS 3 種點(diǎn)突變。而gap-PCR 法主要用于檢測--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAⅠ4 種缺失型α-地中海貧血基因，以及融合基因的檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，用PCR-導(dǎo)流雜交法檢測時(shí)，在-α4.2突變位點(diǎn)有弱顯影，反向點(diǎn)雜交法復(fù)核時(shí)，-α4.2突變位點(diǎn)呈強(qiáng)顯影，但經(jīng)α-地中海貧血gap-PCR試劑盒驗(yàn)證時(shí)，未出現(xiàn)-α4.2缺失型陽性電泳條帶，進(jìn)一步檢測融合基因，出現(xiàn)融合基因陽性電泳條帶。通過高通量測序技術(shù)顯示7 個(gè)差異堿基位點(diǎn)(nt34527T＞C、nt34531A＞C、nt34534G＞A、nt34537C＞A、nt34545G＞A、nt34555A＞G、nt34561T＞C)，通過BLAST 對(duì)該同源序列進(jìn)行比對(duì)顯示為α2珠蛋白融合基因。2021 年鞠愛萍[8]報(bào)道了廣州市2 例α2珠蛋白融合基因樣本通過gap-PCR、PCR-導(dǎo)流雜交法以及Sanger 測序技術(shù)，與本研究的結(jié)果基本一致。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在臨床中通過常規(guī)PCR-導(dǎo)流雜交法可能會(huì)誤判為-α4.2雜合子，當(dāng)發(fā)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果弱顯影時(shí)不推薦進(jìn)行反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行驗(yàn)證，會(huì)導(dǎo)致-α4.2假陽性，可通過gap-PCR進(jìn)行驗(yàn)證或者通過基因測序來驗(yàn)證是否為α2珠蛋白融合基因。Ju等[10]通過對(duì)α2珠蛋白融合基因進(jìn)行基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR)的多色熔融曲線分析(multicolor melting curve analysis，MMCA)、常規(guī)gap-PCR、多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)、DNA 測序技術(shù)的檢測對(duì)比，發(fā)現(xiàn)基于qPCR 的MMCA 可以準(zhǔn)確的檢測到α2珠蛋白融合基因。總之，對(duì)于α2珠蛋白融合基因的檢測方法有g(shù)ap-PCR、基于qPCR 的MMCA、DNA 測序技術(shù)(包括sanger 測序及高通量測序技術(shù))。目前的研究表明在該研究中發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)差異堿基位點(diǎn)(nt34527T＞C、nt34531A＞C、nt34534G＞A、nt34537C＞A、nt34545G＞A、nt34555A＞G、nt34561T＞C)，Huang 等[5]的研究顯示出有七個(gè)突變位點(diǎn)(nt 284 C、nt 288 C、nt 291 A、nt 294 A、nt 302 G 和nt 308 C)，而在Ju 等[10]的研究中有8 個(gè)堿基發(fā)生了置換，胡俊杰等[2]在黎族人中利用α-珠蛋白基因測序技術(shù)研究顯示α2基因有8 個(gè)保守的堿基(nt875C、nt879C、nt882A、nt885A、nt893 A、nt903 G、nt909 C、nt918 G)發(fā)生堿基置換，這也驗(yàn)證了α2珠蛋白基因可以發(fā)生不同程度的同源重組。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在臨床中常規(guī)的檢測方法為-α4.2雜合子，即當(dāng)發(fā)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果弱顯影或者強(qiáng)顯影時(shí)均需通過基因測序來驗(yàn)證是否為α2珠蛋白融合基因，以此提高罕見基因突變的診斷率及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的精準(zhǔn)診斷。