基于ITS2 序列對市售白扁豆的鑒別研究

畢武，聶平，孫輝，丁野，張文娟，馬雙成

1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410001；2.湖南省藥品審核查驗中心，湖南 長沙 410013；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

白扁豆為我國常用中藥材，來源于豆科扁豆屬植物扁豆Dolichos lablabL.（Lablab purpureus）的種子，具有消暑除濕，健脾止瀉的功效［1］，同時也廣泛作食用，是一種藥食兩用品種。目前有參苓白術(shù)散、健脾糕片、嬰兒健脾顆粒等近20 個中成藥中含有白扁豆。研究［2-3］表明，白扁豆具有降糖、抗炎鎮(zhèn)痛、抗結(jié)石等多種活性，主要含有三萜皂苷（如Lablabosides A,B and C）、凝集素等化學成分，還含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸等氨基酸，飽和脂肪酸（24.2%），單不飽和脂肪酸（18.42%）和多不飽和脂肪酸（57.38%）等脂肪酸類成分，其中以亞油酸含量較高。此外，還有高含量的鉀，少量的鈣、鐵、鋅等微量元素。

白扁豆在世界各熱帶地區(qū)均有栽培。我國南北朝時名醫(yī)陶弘景所撰《名醫(yī)別錄》中記載扁豆已有栽培［4］。白扁豆目前在全國均有種植，尤其以云南、四川種植面積較大。市場供應(yīng)分為國內(nèi)、國外兩種貨源。因此，一方面白扁豆存在國外非藥用品種混用或誤用的可能；另一方面，由于中藥的有效性往往與生長環(huán)境等密切相關(guān)，國外以及國內(nèi)不同地域栽培的白扁豆品種之間是否存在差異也未見相關(guān)報道。

DNA 條形碼概念是加拿大學者Paul Hebert 于2003 年首次提出［5］，之后引起各國學者們的廣泛關(guān)注，該技術(shù)利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA 片段來進行物種鑒定，具有不受生物個體形態(tài)特征、發(fā)育階段和外界環(huán)境等因素影響的優(yōu)勢，近年來在動植物分類鑒定尤其是在藥用植物鑒定研究方面得到廣泛應(yīng)用，取得了很大進展［6-7］。核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列由于具有序列短，易擴增，鑒定能力強等優(yōu)點,成為目前藥用植物DNA 條形碼鑒定的常用序列之一。因此，本研究通過ITS2 條形碼序列對不同來源市售白扁豆進行鑒別分析，了解市售白扁豆的具體狀況。

1 材料

1.1 實驗材料

31 批白扁豆樣品通過市場、網(wǎng)絡(luò)購買等方式收集。樣品信息詳見表1。

從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載已公布的57 份白扁豆和14 份混偽品的ITS2 序列信息，詳見表2。

表2 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的白扁豆及其混偽品ITS2序列信息

1.2 儀器設(shè)備

混合球磨儀（型號MM400，德國Resch 公司）；微量冷凍離心機（型號Fresco21，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；電子天平（型號JA5003，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；PCR 擴增儀（型號Labcycler，SensQuest 公司）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（型號G：BOX XT4，英國Syngene 公司）；電泳儀（型號BG-Power600，北京百晶生物技術(shù)有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號BH8104-D，杭州保恒恒溫技術(shù)有限公司）。

1.3 試藥

離心柱型植物基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq Master Mix 緩沖液均購自天根生化科技（北京）有限公司；100bp DNA ladder marker（上海捷瑞生物工程有限公司）；GeneRed Nucleic Acid Dye（19G0326，Biotium）；ITS2 擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 DNA 的提取

取適量白扁豆樣品，用75%的酒精擦拭表面進行消毒處理，待自然揮干后經(jīng)球磨儀研磨，取30 mg左右研磨后的細粉，加入700 μL 基因組DNA 提取試劑盒中的DNA 裂解液，56 ℃水浴2 h，期間混勻3～4次，采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取總DNA，具體提取步驟按說明書進行。

2.2 PCR 擴增和測序

PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ITS2 引物（ITS2F ：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' ；ITS3R ：5'-GACGCTCTCCAGACTACAAT-3'）［8］各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。ITS2 序列PCR 擴增程序為94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，將具有單一明亮目的條帶的產(chǎn)物送往湖南大地同年生物科技有限公司進行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將測序獲得的序列數(shù)據(jù)使用 CodonCode Aligner 10.0 軟件對測序峰圖校對，去除引物及低質(zhì)量區(qū)后進行拼接。通過ITS2 注釋網(wǎng)站（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）進行注釋，獲得不含5.8S和28S 兩端區(qū)段后的ITS2 間隔區(qū)序列。對所得序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行相似性搜索，進行物種鑒別。利用MEGA 11.0 軟件對序列進行多重比對分析，計算不同堿基的比例，查找變異位點，并構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 實驗結(jié)果

3.1 白扁豆樣品性狀

從收集的白扁豆樣品性狀來看，不同樣品的形狀，大小以及外表面等存在較大差異，部分樣品表面存在黑色斑點，典型樣品見圖1。

圖1 白扁豆典型樣品性狀圖

3.2 PCR 擴增及測序結(jié)果

利用通用引物對31 份市售白扁豆樣品ITS2 序列擴增，均獲得成功，成功率為100%。測序結(jié)果顯示，ITS2 序列的PCR 擴增產(chǎn)物雙向測序均獲成功，獲得序列質(zhì)量高。因此，后續(xù)對ITS2 序列展開深入分析。

3.3 基于ITS2 序列的物種鑒定

將拼接好的ITS2 序列通過數(shù)據(jù)庫注釋獲得ITS2 條形碼序列。注釋得到的31 條ITS2 條形碼序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過Blast 進行相似性搜索，完成物種鑒定。鑒定結(jié)果顯示，樣品序列與數(shù)據(jù)庫中最匹配的物種為Lablab purpureus，相似度均在99%以上。由此可以說明，ITS2 序列能夠準確鑒定市售白扁豆藥材。本次實驗樣品均為正品白扁豆，可用于下一步的分析。

3.4 ITS2 序列特征分析

實驗共得到經(jīng)注釋后的ITS2 序列88 條，其中白扁豆樣品序列31 條，從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的序列57 條。應(yīng)用MEGA 11.0 軟件將這些序列進行比對分析，結(jié)果顯示，白扁豆ITS2 序列長度為216～218 bp，C+G 占比為46.8%～47.3%。種內(nèi)變異較少，經(jīng)與峰圖確認（因部分GenBank 數(shù)據(jù)庫下載序列在這兩個位點未明確具體堿基），共存在2 個變異位點，分別為86 位點D 的A →G 和174 位點的G →C（代表性峰圖如圖2 所示）。根據(jù)對變異位點的分析，可將白扁豆歸納為6 種主要的單倍型（B1～B6），具體如表3 所示。

圖2 白扁豆ITS2序列雜合型變異位點峰圖

表3 白扁豆ITS2序列變異位點

3.5 白扁豆與其混偽品遺傳發(fā)育分析

基于ITS2 條形碼序列，通過鄰接法構(gòu)建白扁豆與其常見的7 種混偽品14 條序列的NJ 樹（見圖3）。由圖中可見，白扁豆與其混偽品硬皮豆、眉豆等能明顯區(qū)分。不同單倍型白扁豆聚為一支，眉豆和豇豆聚為一支（因眉豆為豇豆的亞種），鐮扁豆、硬皮豆、金甲豆、菜豆和荷包豆這些不同的種各自聚在一起。從親緣關(guān)系來看，白扁豆與眉豆、豇豆的親緣關(guān)系最近；與鐮扁豆、硬皮豆的親緣關(guān)系次之；與金甲豆、菜豆和荷包豆的親緣關(guān)系相對較遠。因此，通過ITS2 條形碼能很好地區(qū)分白扁豆藥材及其常見的混偽品或近緣種。

圖3 基于ITS2的系統(tǒng)發(fā)育分析（NJ樹）

3.6 白扁豆與其混偽品二級結(jié)構(gòu)比較分析

通過ITS2 注釋網(wǎng)站對白扁豆及其常見混偽品的ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，結(jié)果見圖4?？傮w上來看，白扁豆及其常見混偽品均由一個中心環(huán)和四個螺旋結(jié)構(gòu)組成，每個螺旋上的莖、環(huán)存在不同程度的差異，通過這些差異可以將白扁豆與其常見混偽品明顯區(qū)分。主要區(qū)別點有：中心環(huán)大小，螺旋之間的夾角，螺旋上環(huán)的數(shù)量和大小，螺旋長度等。

圖4 白扁豆及其混偽品ITS2序列二級結(jié)構(gòu)比較4 討論

在長期栽培過程中，白扁豆在外觀形態(tài)上發(fā)生了較大的變化，比如，表面有黑色斑點，性狀和大小差異較大，這些變化雖不成為種的鑒別依據(jù)，但也可能會對經(jīng)驗不足的鑒定和使用人員造成困擾。據(jù)文獻［9-12］報道，目前白扁豆發(fā)現(xiàn)的混偽品主要有金甲豆、眉豆、鐮扁豆以及菜豆、荷包豆等；在植物分類中，扁豆屬（Lablab）和硬皮豆屬（Macrotyloma）二者非常相似，曾一起被歸入Dolichos 屬，如白扁豆Lablab purpureus 拉丁學名原為Dolichos lablab；硬皮豆Macrotyloma uniflorum(Lam.) Verdc.拉丁學名原為Dolichos unifloraLam.［13］，因此，這些均為白扁豆易混偽或近緣品種。還有觀點認為“進口扁豆”系偽品，不可入藥［14］。此外，目前《中國藥典》2020 年版收載的白扁豆項目僅有性狀和顯微鑒別，無化學成分鑒別指標，不易將白扁豆與其混偽品區(qū)分。

鑒于以上原因，需要采用更多的手段或指標對市售白扁豆進行分析，本研究采用基于ITS2 序列的DNA 條形碼技術(shù)對白扁豆的遺傳背景情況進行了較為深入的分析。從ITS2 序列來看，白扁豆ITS2 序列可與其近源種有效區(qū)分，但不同地域栽培的白扁豆以及國產(chǎn)和進口白扁豆未發(fā)現(xiàn)明顯的差異，可能原因是這些均為白扁豆的不同栽培類型，遺傳背景差異很小。本研究表明，白扁豆ITS2 序列變異小，僅有兩個變異位點。王明芳等［15］也曾報道進口白扁豆與國產(chǎn)白扁豆僅在外觀性狀上存在差異，但在顯微鑒別、薄層鑒別及健脾止瀉功效方面未表現(xiàn)出明顯的差異，說明進口白扁豆與國產(chǎn)白扁豆差異很小。

雖然ITS2 序列可以作為白扁豆真?zhèn)舞b別的一個指標，但能否作為白扁豆質(zhì)量評價的指標，還有待進一步的研究。因有報道認為，白扁豆與其變種云南、四川白扁豆在蛋白黏度、紫外吸收和薄層色譜等方面存在較大差異［16］；國產(chǎn)白扁豆星狀細胞胞腔內(nèi)有棕色內(nèi)含物，進口品種則無此特征［15］。因此，還需要深入研究，尋找白扁豆的標記物，對白扁豆的真?zhèn)蝺?yōu)劣進行鑒別。