不同濃度褪黑素處理對(duì)采后獼猴桃抗灰霉病的影響

段春楊，田登娟，黃二賓，王芳，2，鄧佳，3

(1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224；3. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224)

獼猴桃是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)多年生草本植物，素有“水果之王”的美譽(yù)[1]。 獼猴桃具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但由于多種因素易發(fā)生腐爛、病害等，從而失去食用價(jià)值[2]，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成損失。 據(jù)報(bào)道，常見獼猴桃病害以真菌類病原菌為主，而其中又以青霉病、灰霉病和軟腐病最為普遍[3-6]。 因此，加強(qiáng)獼猴桃采后保鮮相關(guān)研究具有十分重要的研究價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。 采后果實(shí)病害的控制方法分為物理、化學(xué)、生物方法，目前以化學(xué)方法為主。 但隨著生活水平的提高，人們對(duì)于健康和環(huán)保問題越來越重視，迫使人們探究更加安全、健康、有效的化學(xué)防治替代品。 與化學(xué)方法相比，生物方法強(qiáng)調(diào)抑菌物質(zhì)為自然界存在的、可天然提取、非人工合成的天然有機(jī)物質(zhì)，因其具有更高的生物安全性、環(huán)境友好性而成為研究的熱點(diǎn)方向[7]。 褪黑素、鈣、碳酸氫鈉、抗壞血酸、水楊酸、植酸、殼聚糖、海藻糖等能夠抑制水果上病原菌的生長，從而達(dá)到降低水果病害發(fā)生率的目的，具有很好的應(yīng)用前景。 所以，尋找化學(xué)殺菌劑的替代物來防治果蔬病害，是今后果蔬產(chǎn)品貯藏保鮮工作的重點(diǎn)之一[8，9]。

褪黑素(melatonin，MT)是一種吲哚類小分子物質(zhì)，于1995 年首次在植物中被鑒定出來，此后發(fā)現(xiàn)褪黑素存在于多種植物和植物產(chǎn)品中[10-12]。褪黑素在調(diào)控植物發(fā)芽、分化、開花、晝夜節(jié)律、光合作用以及成熟和衰老中具有重要作用。 近年來，褪黑素在控制采后病害中的作用已受到廣泛關(guān)注。 研究表明，外源施用0.1 mmol/L 褪黑素能抑制櫻桃和番茄果實(shí)因感染灰葡萄孢菌引起的灰霉病，并增加相關(guān)防御酶和代謝產(chǎn)物水平，提高內(nèi)源性褪黑素和水楊酸含量，從而提高果實(shí)抗病性[13]。 此外，褪黑素在蘋果、梨、大棗等種植中得到大量應(yīng)用，能夠提高果實(shí)的貯藏品質(zhì)。 然而有關(guān)褪黑素對(duì)采后獼猴桃果實(shí)灰霉病生物防治的研究卻少有報(bào)道。 因此，本試驗(yàn)以獼猴桃為材料，研究不同濃度褪黑素對(duì)獼猴桃灰霉病的防控效果，篩選出最佳濃度；在此基礎(chǔ)上從生理生化方面研究褪黑素對(duì)灰霉菌細(xì)胞膜的破壞效果，既為獼猴桃果實(shí)灰霉病的生物防治積累資源，也為褪黑素的應(yīng)用拓展途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)品種為四川浦江紅心獼猴桃，購于昆明市金馬正昌水果批發(fā)市場。

褪黑素購于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

灰霉菌(Botrytis cinerea)分離自獼猴桃病果表面，置于PDA 培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 褪黑素體外抑菌試驗(yàn) (1)對(duì)病原菌菌絲的抑制作用:采用十字交叉法，在PDA 培養(yǎng)基中心接種6 mm 灰霉菌菌餅，在其四周距離3 cm 左右處放置4 片濾紙，濾紙分別滴入20 μL 同一處理濃度的褪黑素，褪黑素濃度設(shè)為0.05、0.10、0.20 mmol/L，接種好的培養(yǎng)基密封，放入恒溫箱(25℃)培養(yǎng)2 d 后觀察抑菌效果，記錄灰霉菌病斑直徑。 用無菌水取代褪黑素作為空白對(duì)照[14，15]，每處理重復(fù)3 次。

(2)孢子萌發(fā)率及芽孢管長測定:參考Qin等[16]的方法略改動(dòng)。 取不同濃度(0.05、0.10、0.20 mmol/L)的褪黑素和無菌水各1 mL，加至裝有50 mL PDB 培養(yǎng)基的錐形瓶(容積為100 mL)中，之后加入1 mL 灰霉菌孢子懸浮液(106cfu/mL，下同)，28℃、120 r/min 培養(yǎng)12 h。 每個(gè)處理重復(fù)3 次。 孢子萌發(fā)率、芽孢管長測定方法參見孔珊珊等[8]的方法。

1.2.2 褪黑素體內(nèi)抑菌試驗(yàn) 將獼猴桃果實(shí)用濃度為2%的次氯酸鈉浸泡2 min 后，用蒸餾水沖洗干凈，置于室溫條件下通風(fēng)晾干。 將消毒好的獼猴桃果實(shí)放在無菌操作臺(tái)內(nèi)，用已滅菌的打孔器在果實(shí)赤道部位等距離的刺2 個(gè)孔(深4 mm、直徑4 mm)，待孔內(nèi)汁液自然晾干后，用移液槍分別向每個(gè)孔洞中注入10 μL 灰霉菌孢子懸浮液和10 μL 不同濃度(0.05、0.10、0.20 mmol/L)的褪黑素，待液體全部吸收后，用自封袋進(jìn)行單果包裝，置于塑料筐內(nèi)室溫貯藏。 用無菌水取代褪黑素作為空白對(duì)照，每個(gè)處理5 個(gè)果實(shí)。

發(fā)病率(%)＝果實(shí)發(fā)病總孔數(shù)/果實(shí)接種總孔數(shù)×100 。

1.2.3 褪黑素對(duì)灰霉菌的溶菌作用 相對(duì)電導(dǎo)率的測定參考Elsherbiny 等[17]的方法并做適當(dāng)調(diào)整。 將6 mm 灰霉菌絲塊轉(zhuǎn)移至含有10 mL PDB培養(yǎng)基的20 mL 離心管中，25℃搖床上120 r/min培養(yǎng)72 h，無菌水清洗菌絲(清除PDB 培養(yǎng)基)并將其轉(zhuǎn)移至含有4 mL 不同濃度褪黑素的10 mL離心管中，以無菌水處理作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次，28℃搖床上120 r/min 培養(yǎng)，分別于4、8、12、24、48、72 h 取樣，并測定電導(dǎo)率R1，后于沸水中加熱30 min，冷卻到室溫后測定電導(dǎo)率R2，計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率(R1/R2×100%)。

將收集的6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品在4℃、5000 × g離心2 min。 獲得的上清液用于胞外核酸滲透量和可溶性蛋白含量的測定，樣品的組織部分用于測定丙二醛(MDA)含量。 胞外核酸滲透量以O(shè)D260值表示(用Thermo Scientific 賽默飛Nano-Drop 2000 紅外分光光度計(jì)測量)，可溶性蛋白和MDA 含量的測定與計(jì)算方法參照蘇州研犀生物科技有限公司相應(yīng)試劑盒的說明書完成。

1.2.4 褪黑素對(duì)獼猴桃果實(shí)采后貯藏品質(zhì)的影響 用清水沖洗果皮表面晾干，再用75%乙醇擦試果皮表面自然晾干，待用。 將60 個(gè)獼猴桃果實(shí)平均分為2 組。 第一處理用最佳濃度的褪黑素浸泡，第二處理用無菌水浸泡，浸泡時(shí)間3 min。 所有果實(shí)自然晾干進(jìn)行單果包裝，置于塑料盒內(nèi)室溫貯藏。

分別于處理后第0、2、4、6、8、10 天取果實(shí)赤道部位皮下3 ～8 mm 果肉組織，快速置于-80℃冰箱內(nèi)保存。 參見曹建康等[18]的方法測定可溶性固型物(SSC)、可滴定酸(TA)、抗壞血酸(ASA)、還原糖含量。 每次測量5 個(gè)果實(shí)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 軟件制圖，采用SPSS Statistics 23.0 軟件進(jìn)行Duncan’s 多重差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對(duì)灰霉菌菌落生長的影響

從圖1 可以看出，培養(yǎng)3 ～5 d，0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理的灰霉菌菌落直徑均與CK存在顯著差異；培養(yǎng)4 d 和5 d，0.10 mmol/L 褪黑素處理的灰霉菌菌落直徑顯著低于0.05 mmol/L和0.20 mmol/L 褪黑素處理。 所以，褪黑素處理對(duì)灰霉菌的生長有顯著抑制作用，0.10 mmol/L褪黑素處理對(duì)灰霉的抑制效果優(yōu)于0.05 mmol/L和0.20 mmol/L 褪黑素處理。

圖1 不同濃度褪黑素處理下灰霉菌病斑直徑

2.2 不同濃度褪黑素處理對(duì)灰霉菌孢子萌發(fā)的影響

從表1 可以得出，與CK 相比，不同濃度褪黑素處理顯著抑制了灰霉菌的孢子萌發(fā)，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理的孢子萌發(fā)率分別比CK 降低29.33、41.66、61.66 個(gè)百分點(diǎn)，其中，0.20 mmol/L 褪黑素處理孢子萌發(fā)率顯著低于0.10 mmol/L 和0.05 mmol/L 褪黑素處理。 不同濃度褪黑素處理顯著抑制了灰霉菌的芽孢管長，0.20 mmol/L 褪黑素處理抑制效果優(yōu)于其它兩個(gè)濃度。 所以，褪黑素處理對(duì)灰霉菌孢子萌發(fā)、孢子管生長均有顯著抑制作用，在所取的褪黑素濃度處理范圍內(nèi)，抑制效果與褪黑素濃度處理呈正相關(guān)關(guān)系，0.20 mmol/L 褪黑素處理效果最佳。

表1 不同濃度褪黑素處理下灰霉菌孢子萌發(fā)情況

2.3 不同濃度褪黑素處理對(duì)貯藏期獼猴桃果實(shí)灰霉病發(fā)病率的影響

由表2 可知，與CK 相比，不同濃度褪黑素處理降低了貯藏期獼猴桃果實(shí)灰霉菌的發(fā)病率，至第10 天CK 的獼猴桃果實(shí)完全發(fā)病，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理分別比CK 降低40、60、20個(gè)百分點(diǎn)。褪黑素處理能夠降低貯藏期獼猴桃果實(shí)灰霉病的發(fā)病率，且以0.10 mmol/L 褪黑素處理效果最優(yōu)。

表2 不同濃度褪黑素處理下貯藏期獼猴桃果實(shí)灰霉病發(fā)病率(%)

2.4 不同濃度褪黑素處理下灰霉菌細(xì)胞膜通透性的變化

通過檢測灰霉菌菌絲的相對(duì)電導(dǎo)率來評(píng)估灰霉菌的細(xì)胞膜通透性。 從圖2A 可以看出，不同濃度褪黑素處理和CK 的菌絲相對(duì)電導(dǎo)率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長總體呈上升趨勢。 培養(yǎng)4 h，不同濃度褪黑素處理和CK 的菌絲相對(duì)電導(dǎo)率存在顯著差異，且0.20 mmol/L 褪黑素處理顯著高于其它兩個(gè)處理；培養(yǎng)8～72 h，不同濃度褪黑素處理和CK的菌絲相對(duì)電導(dǎo)率存在顯著差異，但不同濃度褪黑素處理間基本不存在顯著差異。 因此，不同濃度褪黑素處理可顯著提高灰霉菌菌絲的相對(duì)電導(dǎo)率。

圖2 不同濃度褪黑素處理對(duì)灰霉菌細(xì)胞膜通透性的影響

病原菌菌絲體核酸滲透量被認(rèn)為是細(xì)胞膜損傷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 從圖2B 可以看出，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素處理和CK 的OD260值在48 h 內(nèi)均呈上升趨勢，并于培養(yǎng)48 h 達(dá)到最大值(1.4117、1.5187、2.4713 和1.1793)，之后下降。與CK 相比，褪黑素處理下的細(xì)胞外核酸含量顯著升高，其中，0.20 mmol/L 褪黑素處理顯著高于0.10 mmol/L 和0.05 mmol/L 褪黑素處理。 所以，褪黑素處理對(duì)灰霉菌細(xì)胞膜有顯著破壞作用，在所選褪黑素濃度處理范圍內(nèi)，破壞效果與褪黑素濃度呈正相關(guān)，0.20 mmol/L 褪黑素處理效果最佳。

蛋白質(zhì)泄漏量被認(rèn)為是細(xì)胞膜損傷的另一項(xiàng)重要指標(biāo)。 從圖2C 可以看出，在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，不同濃度褪黑素處理和CK 的可溶性蛋白含量總體呈下降趨勢。 與CK 相比，不同濃度褪黑素處理后的細(xì)胞外可溶性蛋白含量升高。 0.20 mmol/L 褪黑素處理的細(xì)胞外可溶性蛋白含量在4 h 時(shí)達(dá)到最大值(2.02 ± 0.0079 mg/mL)。 因此，不同濃度褪黑素處理可顯著提高細(xì)胞外可溶性蛋白含量，且0.20 mmol/L 褪黑素處理效果更優(yōu)。

通過測定細(xì)胞氧化損傷標(biāo)志物丙二醛(MDA)的含量可檢測病原菌絲體的脂質(zhì)過氧化程度。 從圖2D 可以看出，不同濃度褪黑素處理和CK 的菌絲體MDA 含量總體呈先上升后下降趨勢。 與CK 相比，培養(yǎng)4、12、24 h 不同濃度褪黑素處理的菌絲體MDA 含量顯著升高。 褪黑素處理的菌絲體MDA 含量在12 h 時(shí)達(dá)到最大值，之后開始下降并趨于穩(wěn)定。

以上結(jié)果表明，褪黑素處理導(dǎo)致灰霉菌細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞膜通透性增加。

2.5 褪黑素處理對(duì)貯藏期獼猴桃果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)的影響

從圖3A 可以看出，除了第10 天，0.10 mmol/L褪黑素處理的獼猴桃果實(shí)可溶性固形物(SSC)含量均與CK 無顯著差異；與CK 相比，0.10 mmol/L褪黑素處理的抗壞血酸(ASA)含量除了在2 d 和10 d 有顯著差異外，其余時(shí)間段無明顯差異(圖3B)；可滴定酸(TA)含量在4 d 和8 d 存在顯著差異，其余時(shí)間段無顯著差異(圖3C)；還原糖含量在6 d 和8 d 出現(xiàn)顯著差異(圖3D)。 綜合分析，0.10 mmol/L 褪黑素處理對(duì)獼猴桃果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)無不良影響。

圖3 褪黑素處理下貯藏期獼猴桃果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的變化

3 討論與結(jié)論

獼猴桃具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，采后獼猴桃由于運(yùn)輸中的機(jī)械損傷、病菌侵襲、生理性疾病等因素易發(fā)生腐爛、病害等情況，使其失去食用價(jià)值。已有研究證明，采后褪黑素處理可以抑制水稻白葉枯病的生長[19]，唐琦[20]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對(duì)青霉病的生長有抑制作用，集中表現(xiàn)在對(duì)病菌菌落直徑和孢子萌發(fā)兩個(gè)方面。 本研究結(jié)果表明，0.10 mmol/L 褪黑素處理下的灰霉菌病斑直徑最小，所以，褪黑素處理對(duì)灰霉菌的生長菌落有顯著抑制作用；同時(shí)，褪黑素處理可明顯抑制灰霉菌孢子的萌發(fā)、芽孢管長，從而影響灰霉菌菌絲生長，說明褪黑素處理能夠在體外控制灰霉菌生長和分生孢子萌發(fā)，其中，0.20 mmol/L 褪黑素處理抑制孢子萌發(fā)的效果最佳；褪黑素處理能夠顯著降低貯藏期獼猴桃果實(shí)灰霉病的發(fā)病率，曹晶晶等[21]的研究中也得到類似結(jié)果。

生物激發(fā)子通過破壞細(xì)胞膜的通透性和結(jié)構(gòu)或使關(guān)鍵細(xì)胞成分泄漏，如核酸或蛋白質(zhì)，從而直接或間接地作用于真菌細(xì)胞膜[22]。 相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、核酸和可溶性蛋白滲透量可用于評(píng)估細(xì)胞膜損傷程度[23]。 本研究表明，褪黑素處理增加了灰霉菌的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量，破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致可溶性蛋白和核酸從細(xì)胞膜中釋放出來，其中0.10～0.20 mmol/L 褪黑素處理效果較為明顯。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Bacillus pumilusHR10 破壞了病原菌細(xì)胞膜的完整性，影響了其生理細(xì)胞成分的產(chǎn)生[24]。 Wang 等[22]發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞膜被抗菌物質(zhì)破壞的情況下，細(xì)胞膜的通透性會(huì)產(chǎn)生變化，隨后釋放細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白。

獼猴桃果實(shí)在采摘后仍會(huì)進(jìn)行一系列代謝過程，如能量代謝、呼吸消耗等，果實(shí)中的可溶性固形物、抗壞血酸、可滴定酸和還原糖含量的變化可用來評(píng)價(jià)果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)的好壞[25-29]。 余巧銀等[30]研究發(fā)現(xiàn)，拮抗酵母(P.membranaefaciens)能在降低西蘭花發(fā)病率的同時(shí)，較好地維持果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)，且無不良影響。 趙魯寧等[31]的研究結(jié)果表明，季也蒙畢赤酵母Y35-1 菌株不同制劑能夠有效降低采后枇杷炭疽病的發(fā)病率，并且對(duì)采后枇杷的果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)也起到一定的維持作用。本研究表明，0.10 mmol/L 褪黑素處理能有效維持貯藏期間獼猴桃果實(shí)中的TA、ASA、SSC 和還原糖的含量。 因此，0.10 mmol/L 褪黑素處理采后獼猴桃果實(shí)不會(huì)對(duì)其營養(yǎng)品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。

綜上所述，褪黑素處理可有效抑制灰霉菌病斑直徑的增長，抑制灰霉孢子的萌發(fā)和芽孢管長度的增長，顯著降低貯藏期獼猴桃果實(shí)灰霉病的發(fā)病率，增加灰霉菌細(xì)胞膜的通透性，維持貯藏期間獼猴桃果實(shí)品質(zhì)。 綜合分析，0.10 ～0.20 mmol/L的褪黑素處理對(duì)獼猴桃采后灰霉病有顯著的抑制效果。 考慮到褪黑素的成本以及過高的褪黑素濃度可能存在一定負(fù)面影響等多種因素，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中，推薦0.10 mmol/L 為最佳褪黑素使用濃度。