路 艷, 馬明東, 曹 慧, 毛美琴

(1.濰坊學院種子與設(shè)施農(nóng)業(yè)工程學院, 山東 濰坊 261061;2.四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院, 成都 611130)

紅涼傘[ArdisiacrenataSims var.bicolor(Walker) C. Y. Wu et C. Chen]為紫金?？?Myrsinaceae)植物朱砂根(A.crenataSims)的變種,葉背、花梗、花萼及花瓣均帶紫紅色,又名葉下紅、紫背紫金牛、紅八爪,是土家族、壯族、瑤族等少數(shù)民族地區(qū)常用的傳統(tǒng)民間草藥[1]。研究表明,紅涼傘含有三萜皂苷類、香豆素類、黃酮類、酚類、揮發(fā)油、醌類、氨基酸、糖類等多種化合物,具有解毒消腫,活血止痛,祛風除濕的功效[2]。三萜皂苷是紅涼傘重要的藥理活性成分,能明顯抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡[3-4]。此外,紅涼傘還具有抗病毒、消炎、提高免疫力、降低膽固醇、保肝等多種生物活性[5],獨特的雙色彩葉和累累紅果也具有極高的觀賞價值[6]。紅涼傘的有效藥用部位主要集中在根部,對紅涼傘野生植株過度開采,導致種質(zhì)資源數(shù)量急劇下降。如何有效保護紅涼傘種質(zhì)資源,滿足紅涼傘在制藥產(chǎn)業(yè)中的高需求量,是亟待解決的基本問題。

組織培養(yǎng)技術(shù)能夠快速繁殖種苗,保持優(yōu)良品種的遺傳特性,在新品種選育、珍稀植物種質(zhì)保存、植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)等方面應(yīng)用廣泛[7-8]。利用組織培養(yǎng)和細胞工程技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì),是提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物含量的重要途徑之一。Bhattacharyya等[9]研究發(fā)現(xiàn),金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)組織培養(yǎng)再生植株的次級代謝產(chǎn)物,如酚類、生物堿、類黃酮等都有較高的活性水平。目前,紅涼傘相關(guān)研究主要集中在藥理作用及化學成分分析方面[10-11],關(guān)于紅涼傘離體快繁技術(shù)體系的報道較少。本研究以紅涼傘種子萌發(fā)的無菌苗為材料,探討愈傷組織誘導的影響因素,并通過叢芽誘導途徑建立紅涼傘快繁技術(shù)體系,以期為紅涼傘種質(zhì)資源保存、工廠化育苗、次生代謝產(chǎn)物生物合成調(diào)控等方面提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

紅涼傘購于山東省濰坊市高新區(qū)廣發(fā)花卉城,經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學馬明東教授鑒定為紅涼傘,種植于濰坊學院園林植物溫室盆栽試驗區(qū),常規(guī)養(yǎng)護管理。

1.2 方 法

1.2.1種子無菌苗培養(yǎng)

于12月、翌年3月、6月、9月采集紅涼傘成熟果實進行試驗。選擇健康飽滿的種子,洗衣粉溶液浸泡30 min→流水沖洗2 h→無菌水沖洗3次→75%乙醇消毒1 min→0.1% HgCl2消毒10 min,無菌水沖洗5遍,用無菌濾紙吸去種子表面水分,接種到MS+BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上,培養(yǎng)獲得無菌苗。每處理接種15個外植體,3次重復。統(tǒng)計污染率、萌發(fā)率、觀察啟動時間和無菌苗生長情況。

污染率/%=(污染數(shù)/接種數(shù))×100%;

萌發(fā)率/%=(萌發(fā)數(shù)/未污染數(shù))×100%。

1.2.2愈傷組織誘導

將無菌苗葉片、莖段和根切成1 cm長,接種到MS+2,4-D 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上,篩選誘導愈傷組織的最佳外植體類型,20 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率和褐化率。將莖段接種到添加不同濃度6-BA、2,4-D、NAA的MS培養(yǎng)基,篩選愈傷組織誘導的最佳激素組合,培養(yǎng)每處理接種15個外植體,3次重復,35 d后記錄愈傷組織誘導和生長情況。

誘導率/%=(誘導出愈傷的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%;

褐化率/%=(褐化的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%。

1.2.3叢生芽誘導與增殖培養(yǎng)

以培養(yǎng)45 d的紅涼傘無菌苗帶芽莖段為材料,切成2.0 cm長,進行叢生芽誘導培養(yǎng)。設(shè)計不同培養(yǎng)基、不同濃度6-BA、NAA的3因素3水平正交試驗,每處理接種15個外植體,3次重復,統(tǒng)計不定芽誘導率、繁殖系數(shù)以及叢生芽生長狀況。

誘導率/%=(誘導出叢芽的莖段個數(shù)/接種莖段總數(shù))×100%;

增殖系數(shù)=60 d后叢生芽總數(shù)/接種莖段總數(shù)。

1.2.4生根培養(yǎng)及煉苗移栽

將生長健壯的單株芽苗接種到附加不同質(zhì)量濃度 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基中,記錄根系生長情況,40 d后統(tǒng)計生根率。打開培養(yǎng)瓶封口膜,對高4～6 cm、長勢良好的生根苗進行煉苗。10 d后取出小苗,洗去根部培養(yǎng)基,移植到V營養(yǎng)土∶V珍珠巖∶V蛭石=2∶1∶2的基質(zhì)中,35 d后統(tǒng)計成活率。

生根率/%=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%;

成活率/%=(成活苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100%。

1.2.5培養(yǎng)條件

試驗所用培養(yǎng)基均附加瓊脂5.8 g/L、蔗糖30 g/L、pH=5.8～6.0,培養(yǎng)溫度(25±1)℃,光照12～14 h/d,光照強度1 500～2 000 lx。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)整理,SPSS 20.0軟件進行方差分析和多重比較(Duncan)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子無菌苗萌發(fā)

不同時間取材的紅涼傘種子(圖1)污染率、萌發(fā)率和啟動時間差異顯著,表現(xiàn)出一定的時間效應(yīng)(表1)。3月份的種子污染率最低,12月、9月污染率次之,6月污染率最高,達28.89%。12月種子萌發(fā)率最低,僅為44.32%,啟動時間28 d;其他月份萌發(fā)率差異不顯著。以翌年3月取材的種子污染率低、誘導萌發(fā)效果最佳,啟動時間7 d,萌發(fā)率為93.68%。接種后紅涼傘種子的胚根點顏色逐漸變綠,7 d左右胚根尖開始膨大,胚根伸長變粗,21 d胚根長至2～2.5 cm,幼芽萌出,新葉纖細,葉表綠色、背面紫紅色,60 d左右無菌苗高3 cm以上。

表1 不同取材時間種子無菌苗的萌發(fā)情況

注:A為紅色果實;B為胚根點突出;C為胚根伸長;D為萌發(fā)的幼苗;E為誘導不定芽;F為不定芽增殖;G為不定芽成苗;H為長大的芽苗;I為組培苗生根。

2.2 紅涼傘愈傷組織的誘導

2.2.1外植體類型對愈傷組織誘導的影響

接種7 d時,葉、莖段、根外植體切口處開始膨大,顏色變淺,14 d左右產(chǎn)生愈傷組織(圖2)。不同外植體類型愈傷組織誘導情況見表2。莖段愈傷組織誘導率最高,為91.11%,莖段兩端切口處形成黃白色愈傷組織,慢慢增殖成球狀,愈傷組織顏色鮮亮、生長迅速。根和葉愈傷組織的誘導率比較低,愈傷組織呈水漬狀,生長緩慢。

表2 不同外植體誘導的愈傷組織及生長情況

注:A為葉誘導愈傷組織;B為莖段誘導愈傷組織;C為根誘導愈傷組織;D為淡黃白色愈傷組織;E為愈傷組織增殖;F為顆粒狀愈傷組織;G為水漬狀愈傷組織;H為致密狀愈傷組織。

2.2.2激素對愈傷組織誘導的影響

不同激素組合對紅涼傘愈傷組織的誘導和生長影響結(jié)果見表3。愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基是MS+2,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L,誘導率為93.33%。愈傷組織呈3種狀態(tài),顆粒狀愈傷組織黃白色,表面有球形突起,生活力強;冰沙狀愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松,增殖速度快,易褐變?yōu)椴枭疂n狀;致密狀愈傷組織,質(zhì)地堅硬,增殖較慢。紅涼傘愈傷組織增殖過程中易褐化,最終失去分化能力死亡,進一步分化成苗難度較大。

表3 不同激素對愈傷組織誘導的影響

方差分析結(jié)果(表4)表明,3種激素對紅涼傘愈傷組織誘導率的影響程度依次為2,4-D>NAA>6-BA。2,4-D、NAA的影響呈極顯著(p<0.01),6-BA的影響不顯著(p>0.05)。對2,4-D、NAA 兩種激素不同濃度水平進行多重比較(表5),2,4-D 三個濃度水平對紅涼傘愈傷組織誘導率的影響呈極顯著差異,影響最大的是水平2(0.2 mg/L);NAA對紅涼傘愈傷組織誘導率影響在水平2(0.5 mg/L)與水平3(1.0 mg/L)差異不顯著,與水平1(0.2 mg/L)差異極顯著。

表4 激素影響愈傷組織平均誘導率的方差分析

表5 不同激素水平對愈傷組織誘導效果的多重比較

2.3 莖段誘導叢生芽

將紅涼傘無菌苗的帶節(jié)莖段接種于正交實驗設(shè)計的培養(yǎng)基中進行叢芽誘導(圖1),統(tǒng)計結(jié)果(表6)表明,帶節(jié)莖段誘導不定芽的最佳培養(yǎng)基組合是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L,誘導率達91.11%,增殖系數(shù)3.47,叢生芽分化數(shù)量多,芽苗健壯、葉片舒展,生長良好。極差分析表明,3種因素及因素水平對紅涼傘不定芽誘導率的影響不同,極差依次是培養(yǎng)基>6-BA>NAA。方差分析結(jié)果(表7)表明,培養(yǎng)基類型對紅涼傘莖段誘導不定芽的影響最大,培養(yǎng)基類型和6-BA達極顯著水平(p<0.01),NAA影響差異不顯著(p>0.05)。

表6 不同因素對莖段誘導不定芽的影響和極差分析

表7 叢芽誘導率的方差分析

2.4 生根及移栽

將高4～5 cm的健壯芽苗接種到生根培養(yǎng)基,10 d 左右,部分小苗基部開始出現(xiàn)白色根點,20 d時白色不定根長1～1.5 cm,培養(yǎng)40 d左右,根長達3～5 cm,根系粗壯。小苗葉片伸展,生長良好,結(jié)果如表8所示。隨著IBA濃度的升高,紅涼傘小苗生根率先升高后下降。IBA濃度為0.5 mg/L時,生根率達90.74%,平均生根數(shù)4.6條,根長而粗壯,是最佳的生根培養(yǎng)基。移栽前開蓋煉苗10 d左右,用流水洗凈小苗根上的培養(yǎng)基,移栽到V營養(yǎng)土∶V珍珠巖∶V蛭石=2∶1∶2的混合基質(zhì)中,溫度為25～30 ℃,濕度為90%～100%,遮蔭度為85%,小苗成活率達75.40%。

表8 不同濃度IBA對紅涼傘無菌苗生根的影響

3 討 論

植物種子取材方便、消毒徹底,更易于通過無菌苗培養(yǎng)方式建立快繁體系[12-13]。紅涼傘種子數(shù)量多,掛果期長,取材時間不受季節(jié)限制,是理想的材料。12月種子萌發(fā)率最低,啟動時間最長,可能與紅涼傘種子的后熟特性有關(guān)。果實成熟時種胚仍然處于發(fā)育前期,需要經(jīng)過胚的后熟作用發(fā)育成熟[14]。翌年3月、6月種胚后熟發(fā)育完成,種子啟動時間較早,萌發(fā)率差異不顯著。6月污染率最高,與此時細菌、真菌微生物生命活動旺盛有關(guān),適當延長消毒時間1～2 min能降低污染率。翌年9月種子發(fā)生胎萌現(xiàn)象,胚根從果實內(nèi)伸出,消毒處理嚴重傷害胚根的活力,影響種子萌發(fā)。

影響愈傷組織誘導的主要因子包括外植體類型、培養(yǎng)基、植物激素等。袁云香[15]以蝴蝶莢蒾幼葉為外植體,誘導出淡黃色、小顆粒狀的愈傷組織;賈明良等[16]以三葉木通幼嫩枝條及葉片作為外植體誘導愈傷組織,誘導率分別為92.00%和97.53%。本研究中,紅涼傘莖段誘導愈傷組織的效果最好,誘導率達91.11%。植物激素對于愈傷組織的誘導也具有重要作用,不同植物或同種植物不同器官所需的植物激素的種類和濃度有較大差異。曾超珍等[17]研究發(fā)現(xiàn),2,4-D對虎杖愈傷組織增殖培養(yǎng)有顯著影響;張旭紅等[18]在研究歐洲百合愈傷組織誘導時發(fā)現(xiàn),NAA的添加最有利于愈傷組織的誘導。本研究中,紅涼傘愈傷組織的誘導主要受到2,4-D和NAA質(zhì)量濃度的影響,隨著2,4-D濃度的升高以及NAA的協(xié)同作用,愈傷組織誘導率逐漸增加,但濃度過高時,愈傷組織的誘導受到抑制。6-BA的配合使用顯著提高了愈傷組織的誘導率,愈傷的結(jié)構(gòu)由疏松變得致密。紅涼傘愈傷組織有顆粒狀、冰沙狀、致密狀3種形態(tài),黃白色顆粒狀愈傷組織生活力強、增殖速度快,可能為胚性細胞。冰沙狀、致密狀愈傷組織生活力弱,增殖緩慢,生長后期易褐化死亡,可能是因為2,4-D濃度過高,抑制了愈傷組織再分化成苗的能力,后面將做進一步研究。

腋芽萌發(fā)是植物離體再生的重要途徑[19-21],培養(yǎng)基、激素的種類與濃度是叢芽再生的重要影響因素。植物基因型不同,叢生芽誘導增殖的培養(yǎng)基也不同。青錢柳適宜的芽誘導增殖培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基[22];毛棉杜鵑在Read培養(yǎng)基上誘導的叢生芽最多[23];懸鈴木最佳叢生芽誘導培養(yǎng)基是WPM[24]。本研究中,紅涼傘叢生芽誘導的最適培養(yǎng)基是MS,叢生芽分化數(shù)量多,芽苗健壯。植物生長調(diào)節(jié)劑通過改變內(nèi)源激素水平調(diào)控形態(tài)建成,在不定芽直接分化途徑中起著關(guān)鍵性作用[25]。一定范圍內(nèi),高質(zhì)量濃度細胞分裂素與低質(zhì)量濃度生長素配合使用,有利于不定芽的誘導發(fā)生,但二者的質(zhì)量濃度大小和比值因植物的基因型不同而有所不同。太行花在0.6 mg/L 6-BA與0.15 mg/L IBA組合下,叢生芽增殖系數(shù)最高且無玻璃化現(xiàn)象[26],醉魚草不定芽誘導研究中,9 mg/L 6-BA與1 mg/L IBA配合使用顯著增加了芽的誘導數(shù)量,誘導率達100%[27]。本研究中,6-BA、NAA的配合使用對紅涼傘不定芽誘導有顯著影響。隨著6-BA濃度的增加,紅涼傘不定芽誘導率增加,分化數(shù)量多,芽苗健壯。NAA濃度增加導致不定芽基部長出大量愈傷組織,增殖系數(shù)降低,苗細弱不伸展。6-BA在紅涼傘芽誘導增殖過程中起主導作用,與齊賢等[28]在“黃水蜜”桃實生苗莖段誘導不定芽再生體系研究的結(jié)果相似。

植物組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基一般以1/2 MS為主,添加生長素IBA或者NAA,不同植物適用的生長素種類和濃度不同?！敖鸹屎蟆弊?nèi)~木最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 1.5 mg/L,生根率達100%[29];胡楊花藥再生體系在1/2 MS+1.2 mg/L IBA培養(yǎng)基中芽苗的生根率最高,達96.7%[30]。紅涼傘組培苗生根培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L,生根率達90.74%,主根長而粗壯。組培苗葉片極易失水萎蔫,移栽成活的關(guān)鍵因子是濕度,濕度90%、遮蔭度85%的條件下移栽成活率較高。本試驗以紅涼傘種子培養(yǎng)的無菌苗為材料,探討了培養(yǎng)基、外植體類型、植物生長調(diào)節(jié)劑等因素對愈傷組織誘導、叢生芽誘導增殖及生根移栽的最適培養(yǎng)條件,建立了紅涼傘植株快繁技術(shù)體系,為紅涼傘野生種質(zhì)資源保存、優(yōu)質(zhì)種苗繁育和次生代謝產(chǎn)物開發(fā)利用提供了研究基礎(chǔ)。