劉 暢,杜羽晨,李寧輝,陸霄光,趙 烈,付連雙,劉 鑫,劉 君,王曉楠

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

低溫是限制冬小麥生長(zhǎng)的主要逆境脅迫因素之一[1]。冬小麥的抗寒性是遺傳與環(huán)境因子相互作用的結(jié)果,不同品種的抗寒能力有所差異。中國(guó)高寒地區(qū)冬季寒冷漫長(zhǎng),導(dǎo)致冬小麥無(wú)法安全越冬。東農(nóng)系列小麥品種的育成,為高寒地區(qū)開(kāi)展冬小麥高產(chǎn)育種提供了優(yōu)良的抗寒材料[2]。篩選抗寒性強(qiáng)的冬小麥品種,可豐富高寒地區(qū)抗寒種質(zhì)資源。

小麥生理指標(biāo)的變化更能直觀地反映小麥品種的抗寒性。劉艷陽(yáng)等[3]采用室內(nèi)低溫冷凍法處理雙單倍體群體的133個(gè)株系,發(fā)現(xiàn)幼苗葉片中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性可作為小麥抗寒性鑒定的理化指標(biāo)。姜麗娜等[4]通過(guò)測(cè)定小麥拔節(jié)期低溫脅迫下葉片的生理指標(biāo),發(fā)現(xiàn)可溶性糖、脯氨酸和MDA含量以及過(guò)氧化物酶(POD)活性可作為小麥拔節(jié)期抗寒性鑒定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。小麥的生長(zhǎng)點(diǎn)分化狀態(tài)影響其抗寒性,小麥生長(zhǎng)點(diǎn)分化包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段。生長(zhǎng)點(diǎn)伸長(zhǎng)是小麥通過(guò)春化階段的標(biāo)志[5-6]。黃淮麥區(qū)冬小麥生長(zhǎng)點(diǎn)在越冬階段的分化進(jìn)程一般在二棱期[7],但寒地冬小麥在越冬過(guò)程中生長(zhǎng)點(diǎn)的分化狀態(tài)尚不清楚,且抗寒性不同的小麥品種之間生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程和生理指標(biāo)的差異也有待探索。

本研究在大田條件下種植抗寒性不同的3個(gè)小麥品種,調(diào)查越冬期小麥生長(zhǎng)點(diǎn)的分化進(jìn)程,并檢測(cè)相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、MDA含量以及SOD、POD和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的變化,以期明確小麥生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程對(duì)其抗寒性的影響,為抗寒性小麥品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為抗寒性不同的3個(gè)小麥品種,分別為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究所育成的強(qiáng)抗寒性冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(hào)(在高寒地區(qū)越冬返青率高于80%)、山東省農(nóng)科院育成的在黃淮麥區(qū)主推的弱抗寒性冬小麥品種濟(jì)麥22號(hào)(在高寒地區(qū)越冬返青率低于40%)和不抗寒性春小麥品種中國(guó)春(在高寒地區(qū)越冬返青率低于20%)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料于2019年9月10日種植在黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)基地。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),3次重復(fù),小麥行長(zhǎng)3 m,行距30 cm,5行區(qū),種植密度均為200萬(wàn)株·hm-2。鄭 維等[8]提出,白天溫度在0 ℃以上,晚間溫度在-2 ℃以下,日平均溫度低于10 ℃,土壤表面成晝消夜凍的狀態(tài),即為低溫馴化階段;環(huán)境最高溫度在0 ℃以下,則為封凍階段。根據(jù)本試驗(yàn)期間哈爾濱市的氣溫變化情況,分別于2019年10月10日(生長(zhǎng)期)、11月1日(馴化期)、11月20日(封凍期)取樣,進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定,封凍前記錄每個(gè)品種的植株數(shù),于次年4月下旬記錄每個(gè)品種的返青成活植株數(shù)并計(jì)算返青率。返青率=返青成活植株數(shù)/封凍前植株數(shù)×100%。2020年種植時(shí)間、種植方式及返青率調(diào)查同2019年。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 植株外部形態(tài)特征及生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程的觀察

于2019和2020年生長(zhǎng)期、馴化期和封凍期,隨機(jī)從大田中選取5株小麥樣品,水洗后用濾紙吸干水分,取主莖分蘗節(jié),參照Guo等[9]的方法剝?nèi)∩L(zhǎng)點(diǎn)后,利用Olympus-DP電子顯微鏡進(jìn)行觀察,拍照記錄生長(zhǎng)點(diǎn)的分化狀態(tài)。

1.3.2 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

參照高京草等[10]和鄒 琦[11]的方法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率,略作改動(dòng)。具體方法:于2019和2020年生長(zhǎng)期、馴化期和封凍期,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的5株小麥,水洗后用濾紙吸干水分,用打孔器取0.2 g小麥葉片樣品,置于去離子水中,真空泵抽15 min,用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率值(S1)。然后放入沸水浴中20 min,樣品冷卻后再次測(cè)量其電導(dǎo)率(S2)。相對(duì)電導(dǎo)率=S1/S2×100%。

1.3.3 MDA含量及抗氧化酶活性的測(cè)定

取2020年生長(zhǎng)期、馴化期和封凍期的小麥葉片和分蘗節(jié),采用硫代巴比妥酸(TBA)法[12]測(cè)定MDA含量;采用NBT還原法[13]測(cè)定SOD活性;參考Wei等[14]的方法測(cè)定POD活性,參考豆昕桐等[15]的方法測(cè)定CAT活性。

1.3.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

于2020年生長(zhǎng)期、馴化期和封凍期,使用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2500進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定,每次測(cè)定均選取植株完全展開(kāi)的新葉中間部位,葉片經(jīng)暗適應(yīng)30 min后進(jìn)行初始熒光(Fo)測(cè)定,打開(kāi)飽和脈沖進(jìn)行最大熒光(Fm)測(cè)定,根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算可變熒光(Fv=Fm-Fo)和PSⅡ最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Excel 2016和Adobe Photoshop制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗寒性小麥品種的返青率

從表1可以看出,中國(guó)春和濟(jì)麥22在2020年的返青率均為0,在2021年的返青率分別為15.28%和35.62%;而強(qiáng)抗寒品種東農(nóng)冬麥1號(hào)在2020和2021年的返青率均在98%以上。說(shuō)明3個(gè)品種的抗寒性差異明顯。

表1 抗寒性不同的3個(gè)小麥品種的越冬返青率Table 1 Overwintering survival rate of the three varieties with different cold resistance

2.2 不同抗寒性小麥品種的分蘗節(jié)生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程

從圖1可以看出,2019年中國(guó)春和濟(jì)麥22在生長(zhǎng)期時(shí),其生長(zhǎng)點(diǎn)均已分化進(jìn)入二棱期,而東農(nóng)冬麥1號(hào)的生長(zhǎng)點(diǎn)在封凍期仍處于單棱期。2020年三個(gè)品種在生長(zhǎng)期時(shí),生長(zhǎng)點(diǎn)均處于單棱期,但中國(guó)春和濟(jì)麥22的生長(zhǎng)點(diǎn)在封凍期已進(jìn)入二棱期,而東農(nóng)冬麥1號(hào)的生長(zhǎng)點(diǎn)在封凍期仍處于單棱期,說(shuō)明越冬過(guò)程中,東農(nóng)冬麥1號(hào)的生長(zhǎng)點(diǎn)分化明顯滯后于濟(jì)麥22和中國(guó)春。

DM1:東農(nóng)冬麥1號(hào);JM22:濟(jì)麥22;CS:中國(guó)春。圖2～7同。DM1: Dongnongdongmai 1; JM22: Jimai 22; CS: Chinese Spring. The same in figures 2-7.圖1 3個(gè)小麥品種的分蘗節(jié)生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程Fig. 1 Growth point differentiation process of the three varieties with different cold resistance

2.3 不同抗寒性小麥品種葉片的相對(duì)電導(dǎo)率

相對(duì)電導(dǎo)率可衡量細(xì)胞電解質(zhì)的外滲狀況,反映細(xì)胞膜受傷害的程度[16]。從圖2可以看出,2019和2020年田間小麥葉片的相對(duì)電導(dǎo)率趨勢(shì)一致,從生長(zhǎng)期至封凍期,葉片的相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)出逐漸上升的變化趨勢(shì)。2019年在生長(zhǎng)期和馴化期,3個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率差異均不顯著;而在封凍期,東農(nóng)冬麥1號(hào)的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于中國(guó)春和濟(jì)麥22(圖2A)。2020年在生長(zhǎng)期和馴化期,東農(nóng)冬麥1號(hào)的相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于中國(guó)春和濟(jì)麥22;而在封凍期,3個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著(圖2B)。

同一時(shí)期圖柱上不同字母表示不同品種間在0.05水平上差異顯著。圖3～7同。Different letters above the columns at the same stage indicate significant differences among different varieties at 0.05 level. The same in figures 3-7.圖2 不同時(shí)期3個(gè)小麥品種的相對(duì)電導(dǎo)率Fig. 2 Relative electrical conductivity of the three wheat varieties at different stage

2.4 不同抗寒性小麥品種的MDA含量

MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物,可反映植物受逆境傷害的程度[17]。從圖3可以看出,東農(nóng)冬麥1號(hào)葉片中MDA含量從生長(zhǎng)期至封凍期無(wú)明顯變化,而其分蘗節(jié)中MDA含量以及中國(guó)春和濟(jì)麥22葉片和分蘗節(jié)中MDA含量從生長(zhǎng)期至封凍期均呈逐漸升高的變化趨勢(shì)。葉片中,3個(gè)時(shí)期中國(guó)春的MDA含量均顯著高于濟(jì)麥22和東農(nóng)冬麥1號(hào),且生長(zhǎng)期、馴化期濟(jì)麥22和東農(nóng)冬麥1號(hào)之間的MDA含量差異均不顯著,封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的MDA含量顯著低于濟(jì)麥22(圖3A)。分蘗節(jié)中,生長(zhǎng)期和馴化期3個(gè)品種的MDA含量差異均不顯著,封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的MDA含量顯著低于中國(guó)春和濟(jì)麥22(圖3B)。

圖3 不同時(shí)期3個(gè)小麥品種的MDA含量(2020)Fig. 3 MDA content of the three wheat varieties at different stages (2020)

2.5 不同抗寒性小麥品種的抗氧化酶活性

植物在遭受低溫脅迫時(shí)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生并積累活性氧,從而破壞植物結(jié)構(gòu)與功能。SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)重要的活性氧清除酶[18]。從圖4 可以看出,3個(gè)小麥品種葉片和分蘗節(jié)中SOD活性從生長(zhǎng)期至封凍期均呈逐漸降低的變化趨勢(shì)。葉片中,生長(zhǎng)期和封凍期3個(gè)小麥品種的SOD活性均無(wú)顯著差異;馴化期東農(nóng)冬麥1號(hào)的SOD活性顯著高于濟(jì)麥22和中國(guó)春,且濟(jì)麥22與中國(guó)春差異不顯著(圖4A)。分蘗節(jié)中,生長(zhǎng)期3個(gè)品種的SOD活性差異不顯著;馴化期東農(nóng)冬麥1號(hào)的SOD活性顯著低于中國(guó)春和濟(jì)麥22,且中國(guó)春和濟(jì)麥22差異不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的SOD活性顯著高于濟(jì)麥22,但與中國(guó)春差異不顯著(圖4B)。

圖4 不同時(shí)期3個(gè)小麥品種的SOD活性(2020)Fig.4 SOD activity of the three wheat varieties at different stages (2020)

從圖5可以看出,3個(gè)小麥品種葉片中POD活性從生長(zhǎng)期至封凍期總體上均呈逐漸升高的變化趨勢(shì);分蘗節(jié)中POD活性變化趨勢(shì)則表現(xiàn)不一致,中國(guó)春呈先升高后降低的變化趨勢(shì),而濟(jì)麥22和東農(nóng)冬麥1號(hào)呈先降低后升高的變化趨勢(shì)。

圖5 不同時(shí)期3個(gè)小麥品種的POD活性(2020)Fig.5 POD activity of the three wheat varieties at different stages (2020)

葉片中,3個(gè)時(shí)期東農(nóng)冬麥1號(hào)的POD活性均顯著高于中國(guó)春和濟(jì)麥22,在生長(zhǎng)期和封凍期濟(jì)麥22的POD活性顯著高于中國(guó)春,而在馴化期兩個(gè)品種間差異不顯著(圖5A)。分蘗節(jié)中,生長(zhǎng)期和馴化期東農(nóng)冬麥1號(hào)的POD活性顯著低于中國(guó)春,但與濟(jì)麥22差異不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的POD活性顯著高于中國(guó)春和濟(jì)麥22,且中國(guó)春的POD活性顯著高于濟(jì)麥22(圖5B)。

從圖6可以看出,3個(gè)小麥品種葉片和分蘗節(jié)中CAT活性從生長(zhǎng)期至封凍期均呈逐漸升高的變化趨勢(shì)。葉片中,生長(zhǎng)期和馴化期3個(gè)小麥品種的CAT活性差異均不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的CAT活性顯著高于中國(guó)春和濟(jì)麥22,且濟(jì)麥22顯著高于中國(guó)春(圖6A)。分蘗節(jié)中,生長(zhǎng)期東農(nóng)冬麥1號(hào)的CAT活性顯著高于中國(guó)春,但與濟(jì)麥22差異不顯著;馴化期和封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的CAT活性均顯著高于中國(guó)春和濟(jì)麥22,且封凍期濟(jì)麥22的CAT活性顯著高于中國(guó)春,而馴化期兩品種間差異不顯著(圖6B)。

圖6 不同時(shí)期3個(gè)小麥品種的CAT活性(2020)Fig. 6 CAT activity of the three wheat varieties at different stages (2020)

2.6 不同抗寒性小麥品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是衡量非生物脅迫下植物光合生理狀態(tài)的有效指標(biāo)[19-20]。從圖7A可以看出,中國(guó)春和濟(jì)麥22葉片的F0從生長(zhǎng)期至封凍期均呈先降低后升高的變化趨勢(shì),而東農(nóng)冬麥1號(hào)則呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。生長(zhǎng)期和封凍期濟(jì)麥22的F0顯著高于中國(guó)春和東農(nóng)冬麥1號(hào),且中國(guó)春和東農(nóng)冬麥1號(hào)之間無(wú)顯著差異;馴化期東農(nóng)冬麥1號(hào)的F0顯著高于中國(guó)春和濟(jì)麥22,且中國(guó)春和濟(jì)麥22之間差異不顯著。從圖7B可以看出,中國(guó)春和濟(jì)麥22葉片的Fm從生長(zhǎng)期至封凍期均呈逐漸降低的變化趨勢(shì),而東農(nóng)冬麥1號(hào)則呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。生長(zhǎng)期和封凍期濟(jì)麥22的Fm顯著高于中國(guó)春和東農(nóng)冬麥1號(hào),且生長(zhǎng)期中國(guó)春顯著高于濟(jì)麥22,而封凍期兩個(gè)品種間差異不顯著;馴化期東農(nóng)冬麥1號(hào)的Fm顯著高于中國(guó)春和濟(jì)麥22,且濟(jì)麥22顯著高于中國(guó)春。從圖7C可以看出,3個(gè)小麥品種葉片的Fv/Fm從生長(zhǎng)期至馴化期總體上均呈逐漸降低的變化趨勢(shì)。生長(zhǎng)期3個(gè)品種的Fv/Fm差異不顯著;馴化期東農(nóng)冬麥1號(hào)的Fv/Fm顯著低于中國(guó)春和濟(jì)麥22,且中國(guó)春和濟(jì)麥22之間差異不顯著;封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的Fv/Fm顯著高于中國(guó)春,但與濟(jì)麥22之間差異不顯著。

1:生長(zhǎng)期; 2:馴化; 3:封凍封。1:Growing stage; 2:Domestication stage; 3:Freeezing stage.圖7 不同時(shí)期3個(gè)小麥品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)(2020)Fig. 7 Chlorophyll fluorescence parameter of the three wheat varieties at different stages (2020)

3 討論

越冬期和返青期是冬小麥能否安全越冬和產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時(shí)期,對(duì)該時(shí)期小麥的生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程和生理指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),可為小麥的抗寒性鑒定提供一定的理論基礎(chǔ)[21]。低溫可導(dǎo)致小麥體內(nèi)相對(duì)電導(dǎo)率、生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程、抗氧化酶活性以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生變化,進(jìn)而影響翌年的返青率。本研究發(fā)現(xiàn),2020年濟(jì)麥22和中國(guó)春的返青率比2019年有所提高,且濟(jì)麥22的返青率增幅較大。2019年濟(jì)麥22和中國(guó)春的生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程較快,生長(zhǎng)期時(shí)其生長(zhǎng)點(diǎn)已分化至二棱期;在2020年其生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程較慢,在封凍期時(shí)仍處于二棱期,而2019和2020年封凍期時(shí)東農(nóng)冬麥1號(hào)的生長(zhǎng)點(diǎn)仍處于單棱期。說(shuō)明東農(nóng)冬麥1號(hào)的生長(zhǎng)點(diǎn)分化進(jìn)程較慢,能夠安全度過(guò)越冬期,從而保證翌年的返青率。

相對(duì)電導(dǎo)率是反映植物組織受凍后細(xì)胞原生質(zhì)膜透性的重要指標(biāo),且電導(dǎo)率越高植株受損越嚴(yán)重[22]。本研究中2019和2020年3個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率從生長(zhǎng)期至封凍期均呈逐漸升高的變化趨勢(shì)。但2020年變化幅度較2019年小,推測(cè)這與2020年雪層覆蓋較厚有關(guān),且研究結(jié)果也顯示,連續(xù)2年抗寒品種東農(nóng)冬麥1號(hào)的相對(duì)電導(dǎo)率增幅均低于中國(guó)春和濟(jì)麥22。前人研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下,植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基,引發(fā)膜脂過(guò)氧化[23],產(chǎn)生膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA),且膜脂過(guò)氧化的程度隨溫度降低和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而加重[24]。本研究中,封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)的MDA含量均顯著低于濟(jì)麥22和中國(guó)春,表明抗寒品種的膜脂過(guò)氧化程度較低。隨著負(fù)積溫的不斷增加,MDA的含量整體表現(xiàn)為上升趨勢(shì),即超氧陰離子的含量超出抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的清除能力,細(xì)胞膜不能夠修復(fù)低溫對(duì)細(xì)胞膜的損害,細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多[25]。為了保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的毒害,植株形成了酶保護(hù)機(jī)制[26],抗氧化酶活性的增加可以減輕低溫對(duì)生物膜的損傷[27]。分蘗節(jié)是冬小麥安全越冬的關(guān)鍵部位,本研究中,封凍期小麥POD、CAT的活性均明顯高于生長(zhǎng)期,且東農(nóng)冬麥1號(hào)的增幅大于濟(jì)麥22和中國(guó)春,分蘗節(jié)的增幅也大于葉片。這進(jìn)一步證明東農(nóng)冬麥1號(hào)的抗寒性優(yōu)于濟(jì)麥22和中國(guó)春。這與前人對(duì)東農(nóng)冬麥1號(hào)的抗寒生理特性研究結(jié)果一致[28-29]。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)也是抗寒性鑒定的重要指標(biāo)之一,被稱(chēng)為測(cè)定葉片光合功能快速、無(wú)損傷的探針,能較好地反映植株生長(zhǎng)以及受脅迫時(shí)的生理狀況[30]。Fv/Fm是指沒(méi)有遭受環(huán)境脅迫并經(jīng)過(guò)暗適應(yīng)的植物葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率,是植物潛在的最大光合能力[31]。高等植物的Fv/Fm在0.75～0.85之間,在逆境條件下迅速下降[31]。本研究中,生長(zhǎng)期3個(gè)品種的Fv/Fm值均在0.70～0.75之間,馴化期Fv/Fm值均有所下降,表明此時(shí)葉片已經(jīng)遭受低溫脅迫,但下降趨勢(shì)不明顯;進(jìn)入封凍期后Fv/Fm迅速降低,濟(jì)麥22和東農(nóng)冬麥1號(hào)分別是0.45和0.42,顯著高于中國(guó)春(0.35)。說(shuō)明封凍期東農(nóng)冬麥1號(hào)和濟(jì)麥22的Fv/Fm仍能保持較高水平。這與張 婭等[32]的研究結(jié)果一致。