包 鑫, 陳小軍, 孟志遠(yuǎn)*,,2

(1.揚(yáng)州大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 廣陵學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

農(nóng)藥作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生產(chǎn)要素之一，在保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中發(fā)揮著重要的作用。土壤不僅是植物生長的主要依托，還是耕地產(chǎn)能、糧食安全和環(huán)境保護(hù)的重要支撐[1-2]，更是農(nóng)藥施用過程中最容易進(jìn)入的環(huán)境介質(zhì)之一[3]。已有研究指出了包括有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、新煙堿類等農(nóng)藥在內(nèi)的諸多農(nóng)藥在土壤中殘留的事實(shí)[4-6]。同時(shí)，大量研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥可以明顯影響土壤的生態(tài)功能。比如丙硫菌唑 (prothioconazole) 及其脫硫代謝物可抑制土壤中脫氫酶、過氧化氫酶和脲酶的活性[7]；氟醚菌酯 (fluoxastrobin)、乙草胺(acetochlor) 和莠去津 (atrazine) 等農(nóng)藥不僅會(huì)影響土壤脫氫酶和脲酶的活性，還可改變土壤微生物的多樣性[8-9]。

蚯蚓是土壤環(huán)境中生物量最大的動(dòng)物類群[10]，其可以通過挖洞、攝食等活動(dòng)而疏松土壤、促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)以及改善土壤肥力[11]。此外，蚯蚓在土壤無機(jī)物和有機(jī)物的分解中也發(fā)揮著重要作用[12]，是陸生生物與土壤生物之間污染物傳遞的橋梁。因此，蚯蚓在毒理學(xué)研究中常被作為評價(jià)土壤污染程度的重要模式生物[13]。其中，赤子愛勝蚓Eisenia fetida和安德愛勝蚓E.andrei因具有較短的生命周期以及較強(qiáng)的行動(dòng)能力、繁殖能力和降解能力而在生態(tài)毒理學(xué)研究中被廣泛使用，也是農(nóng)藥土壤環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估的標(biāo)準(zhǔn)測試生物[14-16]。近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展，人們對生態(tài)環(huán)境安全提出了更高的要求，農(nóng)藥對蚯蚓的生態(tài)毒性效應(yīng)及其潛在機(jī)制研究備受關(guān)注。目前，已有大量研究證實(shí)了農(nóng)藥污染會(huì)對蚯蚓的生殖生長[17]、組織結(jié)構(gòu)[18]及神經(jīng)傳遞[19]等方面造成不利影響。此外，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和微生物組學(xué)等組學(xué)技術(shù)可以在較短時(shí)間內(nèi)檢測出生物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、內(nèi)源性代謝物及微生物等生物信息的變化，徹底改變了農(nóng)藥毒理學(xué)的研究體系，有助于促進(jìn)人們對農(nóng)藥毒性效應(yīng)分子機(jī)制的理解[20-23]。已有一些研究利用組學(xué)技術(shù)創(chuàng)新性地從基因、代謝物或微生物水平探究了農(nóng)藥對蚯蚓的致毒機(jī)理[24-26]。本文擬就農(nóng)藥進(jìn)入土壤的途徑及其在土壤中的殘留現(xiàn)狀、農(nóng)藥在蚯蚓體內(nèi)的富集與消除等研究成果進(jìn)行回顧，重點(diǎn)歸納總結(jié)農(nóng)藥對蚯蚓產(chǎn)生的毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制，旨在為農(nóng)藥的土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供數(shù)據(jù)支撐，為農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的合理應(yīng)用以及土壤污染管理提供建議。

1 農(nóng)藥進(jìn)入土壤的途徑及其在土壤中的殘留現(xiàn)狀

1.1 農(nóng)藥進(jìn)入土壤的途徑

農(nóng)藥對土壤的污染可以分為直接污染和間接污染兩種形式。截至2020 年底的統(tǒng)計(jì)表明，中國水稻、小麥、玉米三大糧食作物的農(nóng)藥利用率僅為40.6%[26]，這意味著大部分農(nóng)藥并未能沉積于靶標(biāo)而發(fā)生了流失損耗?，F(xiàn)階段，農(nóng)藥仍主要以莖葉噴霧的方式施用，因此大量的農(nóng)藥霧滴會(huì)以飛濺、漂移、滾落等形式流失到土壤、水體等環(huán)境中[27]。此外，拌種法、土壤處理法等施藥方式更是直接將土壤作為農(nóng)藥的儲(chǔ)存和集散場所[28]。同時(shí)，在農(nóng)藥生產(chǎn)過程中，加工機(jī)械、運(yùn)輸管道、儲(chǔ)存單元等加工流程中的農(nóng)藥泄漏也是土壤環(huán)境中殘留農(nóng)藥的來源之一[29]。而作為典型社會(huì)源危險(xiǎn)廢物的農(nóng)藥包裝廢棄物，若未得到妥善的處理，也將是農(nóng)藥進(jìn)入土壤環(huán)境中的潛在形式[30]。還有研究發(fā)現(xiàn)，毒氟磷 (dufulin) 進(jìn)入大羽白肉雞體內(nèi)后，主要隨著排泄物排出體外[31]，由此證明農(nóng)藥還可能通過動(dòng)物排泄物間接進(jìn)入土壤環(huán)境。此外，Tauchnitz 等[32]在德國的城市環(huán)境以及農(nóng)業(yè)環(huán)境的地表水中發(fā)現(xiàn)了草甘膦 (glyphosate) 及其代謝物氨甲基膦酸 (AMPA)、吡氟草胺 (diflufenican)等農(nóng)藥的殘留。也有一些關(guān)于在中國的水環(huán)境、地表沉積物中發(fā)現(xiàn)有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留的相關(guān)報(bào)道[33-34]，因此，被污染的灌溉水源以及地表沉積物等土壤改良物質(zhì)同樣也可能是農(nóng)藥進(jìn)入土壤的載體之一?？偟膩碚f，農(nóng)藥可能通過施藥過程的流失、加工儲(chǔ)運(yùn)過程的泄漏、農(nóng)藥廢棄包裝、生物體排泄、土壤改良物質(zhì)等多種形式進(jìn)入土壤環(huán)境(圖1)。

圖1 農(nóng)藥進(jìn)入土壤中的主要途徑Fig.1 The main ways of pesticides entering the soil

1.2 農(nóng)藥在土壤中的殘留現(xiàn)狀

有機(jī)氯類農(nóng)藥由于在環(huán)境中滯留時(shí)間長，降解速度慢以及歷史使用量大等原因，其在環(huán)境中的檢出率一直居高不下[35]。魏雪芬等[36]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甘肅蘭州西固地區(qū)土壤中的8 種有機(jī)氯農(nóng)藥異構(gòu)體 (OCPs) 的檢出率均達(dá)到了100%。梁曉暉等[37]也在雷州半島土壤中檢測出了10 種OCPs 殘留，其中六六六 (HCHs) 和七氯 (heptachlor) 是該地區(qū)的主要有機(jī)氯類污染物，在土壤中的殘留量分別為23.83～111.51 和11.01～25.95 ng/g。Tao 等[4]在2018—2020 年間采集的北京麥田土壤中檢測出了HCHs、DDTs 等有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，其中DDTs保持了穩(wěn)定的檢出頻率，2020 年在土壤樣本中檢測到了21 種農(nóng)藥殘留，其中p,p′-DDE 的檢出率達(dá)到100%，最高殘留量為546.0 μg/kg，吡蟲啉(imidacloprid) 則以90%的檢出率位居新煙堿類農(nóng)藥第一，最高殘留量為532.6 μg/kg。同時(shí)，2017—2018 年間韓國的有機(jī)氯類農(nóng)藥土壤調(diào)查結(jié)果顯示，在韓國150 個(gè)農(nóng)業(yè)土壤樣品中，有機(jī)氯類農(nóng)藥的檢出率為96%，其中DDTs 和硫丹 (endosulfan)的檢出濃度水平較高，平均殘留量分別為0.31 和0.33 ng/g[38]。

土壤對有機(jī)磷類農(nóng)藥具有吸附和結(jié)合殘留成分的作用，因此該類農(nóng)藥在土壤中也具有較高的殘留風(fēng)險(xiǎn)[39-40]。Li 等[5]在調(diào)查有機(jī)磷類農(nóng)藥在中國的分布特征時(shí)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥在溫室土壤和露天土壤中的檢出殘留量范圍分別為22.1～335 和9.93～303 ng/g，平均殘留量分別達(dá)到了108 和57.9 ng/g，同時(shí)該調(diào)查結(jié)果顯示，有機(jī)磷類農(nóng)藥在中國東北部、北部和中部地區(qū)殘留量較高。Pan 等[41]采集并檢測了241 份長江三角洲的農(nóng)業(yè)土壤，發(fā)現(xiàn)9 種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出率達(dá)到了93%，總檢出殘留量范圍為3.0～521 ng/g，平均殘留量為64.7 ng/g，其中，樂果 (dimethoate) 的檢出率最高，為80.9%，平均殘留量達(dá)到50.8 ng/g。

新煙堿類殺蟲劑因其獨(dú)特的作用機(jī)理以及廣譜、高效的殺蟲活性，已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用[42]，并逐漸在土壤污染因子中占據(jù)了主要地位[43]。在山東省濟(jì)陽縣的設(shè)施番茄土壤中，調(diào)查人員檢測出了較高濃度的噻蟲嗪 (thiamethoxam) 和吡蟲啉，其殘留量均值分別為0.107 和0.233 mg/kg。此外，在設(shè)施黃瓜土壤中同樣檢測出了較高濃度的噻蟲嗪和吡蟲啉，其殘留量均值分別為1.18 和0.126 mg/kg[44]。Wu 等[6]在山東省壽光市的番茄大棚土壤和黃瓜大棚土壤中分別檢出了7 種和6 種新煙堿類殺蟲劑，總檢出殘留量范圍分別為0.731～11.383 和0.363～19.224 μg/kg，同時(shí)發(fā)現(xiàn)表層土壤中的新煙堿類殺蟲劑殘留量高于中下層土壤。Bonmatin 等[45]采集了菲律賓3 個(gè)省份的67 份土壤樣品，新煙堿類殺蟲劑的檢出率達(dá)到78%，其中吡蟲啉檢出頻率最高，平均殘留量為0.56 μg/kg；同時(shí)他們指出，柑橘土壤中的新煙堿類農(nóng)藥殘留水平是水稻、香蕉、蔬菜土壤的130 倍，平均殘留量達(dá)到了113.5 μg/kg。

研究人員在中國江蘇、重慶、浙江、廣東、廣西、福建及云南等地的土壤中還檢測出了8 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留，其中氯氰菊酯 (cypermethrin)在上述地區(qū)土壤中的檢出率最高[46]。為了評估中國長江三角洲地區(qū)農(nóng)業(yè)土壤中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留狀況，Deng 等[47]對在上述地區(qū)所采集的土壤樣品進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)了甲氰菊酯 (fenpropathrin)、氯氰菊酯、溴氰菊酯 (deltamethrin) 以及三氟氯氰菊酯 (cyhalothrin) 的殘留，4 種農(nóng)藥的平均檢出殘留量分別為4.92、1.10、0.89 和0.20 ng/g，其中氯氟氰菊酯的檢出率最高，達(dá)到63.9%。同樣，調(diào)查人員在江蘇省的農(nóng)業(yè)土壤和茶園土壤中也檢測出了高效氯氟氰菊酯 (beta-cyfluthrin) 和聯(lián)苯菊酯(bifenthrin) 等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留，兩種土壤中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留總量分別為27.1～50.7和56.9～97.0 ng/g[48]。此外，手性農(nóng)藥由于其獨(dú)特的手性結(jié)構(gòu)，在土壤中的降解行為存在較大差異，因此其土壤殘留風(fēng)險(xiǎn)也備受關(guān)注。Shen 等[49]調(diào)查了我國農(nóng)業(yè)土壤中的甲霜靈 (metalaxyl)、敵草胺 (napropamide)、滅菌唑 (triticonazole) 及葉菌唑 (metconazole) 等手性農(nóng)藥的殘留情況，發(fā)現(xiàn)上述4 種農(nóng)藥的最大檢出殘留量分別為16.67、32.99、207.39 和71.83 ng/g，其中還觀察到了R-甲霜靈、R-滅菌唑、葉菌唑-1 和葉菌唑-4 的特異性殘留 (表1)。

表1 部分地區(qū)土壤中的農(nóng)藥殘留分布特征Table 1 Distribution characteristics of pesticide residues in soil samples from certain areas

相較于上述對幾種農(nóng)藥的檢測，Silva 等[50]基于LC-MS 檢測了317 個(gè)歐洲農(nóng)業(yè)土壤樣品中76 種農(nóng)藥的殘留水平，在80%的土壤中檢測出了農(nóng)藥殘留；在所有土壤樣品中，最大單個(gè)農(nóng)藥殘留量為2.05 mg/kg，最大總殘留量為2.87 mg/kg；且值得關(guān)注的是，上述歐洲農(nóng)業(yè)土壤樣品中殘留量和檢出率較高的農(nóng)藥除了草甘膦、DDTs 及其代謝物外，還包含了啶酰菌胺 (boscalid)、氟環(huán)唑(epoxiconazole)、戊唑醇 (tebuconazole) 等常用殺菌劑。

2 農(nóng)藥在蚯蚓體內(nèi)的富集與消除

2.1 農(nóng)藥在蚯蚓體內(nèi)的富集行為

蚯蚓暴露于土壤環(huán)境中，可通過被動(dòng)擴(kuò)散和攝食作用將土壤中的農(nóng)藥吸收并積累于體內(nèi)，進(jìn)而通過食物鏈等途徑威脅更高等級生物。被動(dòng)擴(kuò)散作用主要是指農(nóng)藥通過土壤溶液穿透蚯蚓體表進(jìn)入體內(nèi)，而攝食作用則是土壤中的農(nóng)藥通過蚯蚓的攝食過程進(jìn)入體內(nèi)[51]。Belfroid 等[52]基于兩種吸收途徑，建立了可預(yù)測蚯蚓體內(nèi)疏水性有機(jī)化合物吸收、積累的模型，借此模型可以通過化合物的油水分配系數(shù) (logKow) 來預(yù)測蚯蚓吸收和積累農(nóng)藥的方式。Jager 等[53]也建立了相關(guān)預(yù)測模型并進(jìn)一步指出，隨著有機(jī)化合物疏水性的增強(qiáng)，當(dāng)logKow接近5、尤其是大于6 時(shí)，蚯蚓通過腸道吸收有機(jī)化合物將是其主要的吸收途徑。例如在正常環(huán)境下，甲霜靈[54]、乙氧呋草黃 (ethofumesate)[55]和α-六氯環(huán)己烷[56]的logKow值分別為1.6、2.7 和3.9，因此皮膚暴露可能是這3 種農(nóng)藥進(jìn)入蚯蚓的主要途徑。蚯蚓的內(nèi)臟分泌物有利于物質(zhì)的消化且可以提高農(nóng)藥等有機(jī)物在其體內(nèi)的溶解度，從而間接提高農(nóng)藥向蚯蚓組織擴(kuò)散的能力。與此同時(shí)，蚯蚓臟器內(nèi)液相物質(zhì)極性降低，更利于農(nóng)藥在蚯蚓臟器脂肪中累積[51]。除此之外，Chevillot 等[57]還提出了農(nóng)藥與蚯蚓體內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白等蛋白質(zhì)的結(jié)合也是蚯蚓富集農(nóng)藥的一種潛在機(jī)制。

生物濃縮因子 (BCF)、生物富集因子 (BAF)及生物-土壤富集因子 (BSAF) 在“OECD 317”[58]中被確定為用于描述污染物在蚯蚓體內(nèi)富集過程的重要因子，并成為評估農(nóng)藥在蚯蚓體內(nèi)富集的重要指標(biāo)。熊康[59]研究發(fā)現(xiàn)，隨著暴露時(shí)間延長，溴敵隆 (bromadiolone) 可在蚯蚓體內(nèi)富集，其中10 和20 mg/kg 土壤處理組蚯蚓的富集濃度均在暴露第14 天達(dá)到最大值，同時(shí)其BAF 值隨著土壤中藥劑暴露濃度的增大而減小，表明溴敵隆在蚯蚓體內(nèi)的富集與暴露濃度有關(guān)。此外，楊廣斌等[60]在分別進(jìn)行疊加污染和一次污染、但控制毒死蜱 (chlorpyrifos) 暴露總濃度均為4、12 和20 mg/kg 的前提下，根據(jù)BSAF 值測定結(jié)果，證明毒死蜱以多次疊加污染的方式暴露更易在蚯蚓體內(nèi)富集。Goto 等為了評估二甲戊靈 (pendimethalin)和氟樂靈 (trifluralin) 在Eiseniaspp.和Pheretimaspp.兩種亞洲常見蚯蚓中的富集能力，通過吸收和消除試驗(yàn)計(jì)算出兩種除草劑在蚯蚓體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)生物積累因子 (BAFk)，證明了Pheretimaspp.對二甲戊靈和氟樂靈吸收較慢、消除較快，由此認(rèn)為Pheretimaspp.對該兩種除草劑的富集風(fēng)險(xiǎn)較低[61]。Hartnik 等[62]研究發(fā)現(xiàn)，在時(shí)長50 d 的α-氯氰菊酯暴露試驗(yàn)期間，挪威和丹麥土壤中蚯蚓體內(nèi)的α-氯氰菊酯濃度一直保持上升趨勢；而Diao等[63]的研究顯示，α-氯氰菊酯在中國北京土壤中暴露10 天后，蚯蚓體內(nèi)α-氯氰菊酯濃度就開始下降并達(dá)到穩(wěn)定水平。因此，污染方式、蚯蚓種類、土壤性質(zhì)等因素的差異也會(huì)對農(nóng)藥在蚯蚓中的富集與消除行為產(chǎn)生潛在影響。此外，Wang 等[64]研究發(fā)現(xiàn)，手性農(nóng)藥滅菌唑和丙硫菌唑在蚯蚓體內(nèi)的富集行為存在對映體選擇性，其中S-滅菌唑和R-丙硫菌唑在蚯蚓體內(nèi)優(yōu)先富集。同時(shí)，Chang等[65]根據(jù)高效氯氟氰菊酯暴露28 d 期間的對映體分?jǐn)?shù) (EF) 測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(+) -高效氯氟氰菊酯在蚯蚓體內(nèi)優(yōu)先富集。

2.2 農(nóng)藥在蚯蚓體內(nèi)的消除行為

蚯蚓還可進(jìn)一步通過體內(nèi)的相關(guān)酶系統(tǒng)或腸道菌群降解所富集的農(nóng)藥[66]。李冰等[67]研究發(fā)現(xiàn)，敵百蟲 (trichlorfon) 對蚯蚓體內(nèi)的解毒酶羧酸酯酶 (CarE) 有誘導(dǎo)作用，其中0.04 g/L 的敵百蟲可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)CarE 活性達(dá)到最大。Sanchez-Hernandez 等[68]的研究則表明，蚯蚓體內(nèi)的Ⅰ相代謝酶細(xì)胞色素酶 (CYP450) 和Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 (GST) 在毒死蜱的降解過程中發(fā)揮了重要作用。蚯蚓在受到硫丹脅迫后，其腸道中的RhodococcusMTCC 6716 菌株可在15 d 內(nèi)將97%的硫丹降解為無毒的硫丹二醇和硫丹硫酸酯[69]。研究人員基于16S rRNA 分析結(jié)果，提出蚯蚓體內(nèi)的紅球菌和芽孢桿菌可將DDT 降解，使其毒性降低，并通過試驗(yàn)證明了菌株的降解率分別可達(dá)到88.36%和85.22%[70]。Owagboriaye 等[71]研究發(fā)現(xiàn)，Alma millsoni、Eudrilus eugeniae和Libyodrilus violaceus3 種蚯蚓均可富集草甘膦，其中A.millsoni的BAF 值在整個(gè)試驗(yàn)周期均小于1，而E.eugeniae、L.violaceus兩種蚯蚓的BAF 值在第8 周均大于1，同時(shí)E.eugeniae和L.violaceus兩種蚯蚓可加快土壤中草甘膦的消除速度，因此研究者認(rèn)為這兩種蚯蚓可用來治理被草甘膦污染的土壤。Cao 等[72]研究發(fā)現(xiàn)，異草酮 (clomazone)在蚯蚓體內(nèi)富集較快，第3 天即達(dá)到富集最大值；同時(shí)通過消除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1 d 內(nèi)，3 個(gè)濃度處理組 (10、40、160 mg/kg) 分別有74%、75%和80%的異草酮被消除。孫宇涵[73]將富集聯(lián)苯三唑醇 (bitertanol) 21 d 后的蚯蚓置于空白土壤，發(fā)現(xiàn)前3 d 蚯蚓體內(nèi)的聯(lián)苯三唑醇濃度迅速下降，3 d 后則與土壤中的聯(lián)苯三唑醇濃度基本達(dá)到平衡。同時(shí)，Qu 等[74]的研究還發(fā)現(xiàn)，兩種氟蟲腈(fipronil) 對映體在蚯蚓體內(nèi)的半衰期分別為3.3和2.5 d，7 d 后分別有76%和85%的氟蟲腈被消除。乙氧呋草黃對映體在蚯蚓體內(nèi)的消解半衰期更短，僅為1.8 d[55]。Zhou 等[56]根據(jù)α-六氯環(huán)己烷在蚯蚓體內(nèi)的快速消除特性，指出蚯蚓的腸道排泄是α-六氯環(huán)己烷在蚯蚓體內(nèi)快速消除的原因之一。因此，蚯蚓富集農(nóng)藥后，由于農(nóng)藥性質(zhì)差異以及蚯蚓自身排泄等的差異，導(dǎo)致農(nóng)藥在蚯蚓體內(nèi)的降解半衰期存在較大差異。

綜上所述，蚯蚓主要通過攝入被污染的土壤及皮膚接觸兩種途徑吸收土壤中的殘留農(nóng)藥。在接觸農(nóng)藥的初期，蚯蚓體內(nèi)農(nóng)藥量一般會(huì)呈現(xiàn)上升趨勢并在某暴露節(jié)點(diǎn)達(dá)到峰值，隨后在蚯蚓體內(nèi)代謝酶和微生物等的作用下，經(jīng)過積累、轉(zhuǎn)化和代謝等多個(gè)過程，使得農(nóng)藥在蚯蚓和土壤之間的分配達(dá)到平衡，最終使蚯蚓體內(nèi)農(nóng)藥含量趨于穩(wěn)定。

3 農(nóng)藥對蚯蚓的毒性效應(yīng)

3.1 生長生殖毒性

大量研究表明，農(nóng)藥會(huì)對蚯蚓的生長過程產(chǎn)生影響，其中生長率、體重、行為形態(tài)變化等指標(biāo)常被用來評估農(nóng)藥對蚯蚓的生長毒性[75](表2)。史雅靜等[17]研究發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)不同水平 (5、25 和30 mg/kg) 的溴氰菊酯暴露均能顯著降低蚯蚓的體重，并且蚯蚓體重降低的程度與溴氰菊酯的暴露濃度和時(shí)間呈正相關(guān)。為了更全面地評估氟草胺(benfluralin)、嗪草酮 (metribuzin) 及戊炔草胺(propyzamide) 3 種除草劑對蚯蚓的影響，Travlos等[76]通過土壤暴露試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述3 種除草劑均不同程度地降低了蚯蚓的體重并且可影響蚯蚓的存活率。此外，胡玲[77]的研究表明，呋喃丹(carbofuran) 暴露會(huì)導(dǎo)致蚯蚓呈現(xiàn)蜷縮掙扎、環(huán)節(jié)腫大和糜爛的中毒癥狀。王喆[78]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓在殺菌劑甲霜靈和精甲霜靈 (metalaxyl-M) 暴露下，出現(xiàn)了環(huán)節(jié)腫大、滲液出血的現(xiàn)象。蚯蚓作為寡毛綱雌雄同體生物，其生殖活動(dòng)主要包括交配、精液交換、繭內(nèi)受精結(jié)繭等[79]。Wang 等[80]研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉對蚯蚓具有較高的生殖毒性，可以顯著抑制其繁殖。Ge 等[81]通過人工土壤法進(jìn)行了吡蟲啉、噻蟲胺 (clothianidin)、烯啶蟲胺 (nitenpyram)、啶蟲脒 (acetamiprid)、呋蟲胺 (dinotefuran) 及噻蟲啉 (thiacloprid) 6 種新煙堿類殺蟲劑對蚯蚓的暴露試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6 種供試農(nóng)藥均可不同程度地抑制蚯蚓的繭產(chǎn)量、重量以及孵化數(shù)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，40 和80 mg/kg 的乙草胺暴露15 d 會(huì)引起蚯蚓精子數(shù)量的減少[82]。毒死蜱以10 mg/kg 及以上的濃度暴露后，蚯蚓出現(xiàn)精子細(xì)胞核濃縮、桑葚胚受損且數(shù)量減少的現(xiàn)象[83]。Espinoza-Navarro 等[84]還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)馬拉硫磷 (malathion) 處理后，赤子愛勝蚓受精卵中的精子分布異常，精囊中細(xì)胞增殖加快，精原細(xì)胞中DNA 發(fā)生斷裂。

表2 典型農(nóng)藥對蚯蚓的毒理學(xué)效應(yīng)Table 2 Toxicological effects of pesticides on earthworms

3.2 神經(jīng)毒性

長期以來，農(nóng)藥對蚯蚓神經(jīng)系統(tǒng)的影響一直受到廣泛關(guān)注 (表2)。眾所周知，有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、沙蠶毒素類殺蟲劑對蚯蚓的神經(jīng)系統(tǒng)威脅較大[85-86]。乙酰膽堿酯酶 (AchE) 是生物體神經(jīng)傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵酶，因此也是農(nóng)藥毒理學(xué)研究中重要的生物標(biāo)志物[87]。除草劑甲草胺 (alachlor)暴露會(huì)降低蚯蚓AchE 的活性，其中甲草胺暴露24 h 對蚯蚓AchE 活性的抑制率最高，達(dá)91.99%[88]。此外，新煙堿類殺蟲劑戊吡蟲胍 (guadipyr) 以50 和100 mg/kg 的濃度暴露，也導(dǎo)致了蚯蚓的AchE 活性降低[89]。Mazzia 等[86]通過測定蚯蚓的神經(jīng)傳導(dǎo)速度 (NCV) ，評價(jià)了氨基甲酸酯類殺蟲劑抗蚜威 (pirimicarb) 對蚯蚓的神經(jīng)毒性，發(fā)現(xiàn)抗蚜威以0.66、3.3 mg/kg 的濃度暴露后，在第3、第4 和第7 天可誘導(dǎo)蚯蚓的NCV 顯著降低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)抗蚜威所誘導(dǎo)的蚯蚓N C V 變化與其AchE 活性的改變顯著相關(guān)。為了研究吡蟲啉暴露下蚯蚓的逃逸行為，研究者還記錄了蚯蚓在接觸吡蟲啉后的初始逃逸距離和逃逸速度，發(fā)現(xiàn)10 和20 mg/L 的吡蟲啉暴露會(huì)破壞蚯蚓的神經(jīng)系統(tǒng)，抑制其逃逸行為[90]。此外，Huslystyi 等[91]還在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)了吡蟲啉可導(dǎo)致蚯蚓神經(jīng)元標(biāo)志物特異性烯醇化酶 (NSE) 的表達(dá)降低，證明吡蟲啉造成了蚯蚓神經(jīng)細(xì)胞的紊亂。Liu 等[87]研究發(fā)現(xiàn)，25 mg/kg 的己唑醇 (hexaconazole) 暴露可以顯著抑制蚯蚓體內(nèi)AchE 的活性，證明己唑醇對蚯蚓的神經(jīng)傳導(dǎo)過程具有潛在影響。

3.3 細(xì)胞毒性

蚯蚓的體腔細(xì)胞具有免疫活性，在識(shí)別和消除外來物質(zhì)、免疫反應(yīng)、吞噬作用等方面具有重要作用[92]。已有研究表明，化學(xué)物質(zhì)可通過真皮影響體腔細(xì)胞，并誘導(dǎo)蚯蚓體腔細(xì)胞的凋亡[93-94]。作為一種具有系統(tǒng)滲透性的殺菌劑，經(jīng)抑霉唑(imazalil) 暴露72 h 后，蚯蚓體腔細(xì)胞的密度隨著抑霉唑濃度的增加而增加，此外，研究人員根據(jù)細(xì)胞學(xué)染色結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抑霉唑暴露48 h 后，蚯蚓體腔液中變形細(xì)胞的比例顯著增加[95]。Correia 等[96]評估了抑霉唑的光催化降解產(chǎn)物對赤子愛勝蚓的毒性作用，發(fā)現(xiàn)蚯蚓在分別暴露于光降解18、35 和90 min 的抑霉唑降解產(chǎn)物 (PDT-18、35 和90) 溶液中48 h 后，其體腔細(xì)胞中油細(xì)胞的比例顯著增加。He 等[97]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5 和10 mg/kg 的苯并烯氟菌唑 (benzovindiflupyr) 暴露14 d 后，蚯蚓體內(nèi)吞噬細(xì)胞的活性顯著提高，且細(xì)胞功能受損。Li 等[18]將乳酸脫氫酶 (LDH) 作為反映蚯蚓細(xì)胞膜通透性的生物標(biāo)志物，通過體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五氯硝基苯 (pentachloronitrobenzene) 暴露可導(dǎo)致蚯蚓細(xì)胞膜通透性受損；同時(shí)，五氯硝基苯的暴露濃度和蚯蚓體內(nèi)的LDH 水平呈線性關(guān)系。此外，中性紅保留時(shí)間(NRRT) 作為溶酶體膜損傷程度的評價(jià)指標(biāo)，可以反映蚯蚓受到農(nóng)藥影響后在亞細(xì)胞水平上發(fā)生的變化[98]。隨著毒死蜱暴露濃度和時(shí)間的增加，蚯蚓NRRT 值逐漸下降，證明毒死蜱暴露對蚯蚓的溶酶體膜造成了損傷[83]。Xiao 等[82]在發(fā)現(xiàn)乙草胺破壞了蚯蚓溶酶體膜完整性的同時(shí)，還提出NRRT 可以作為蚯蚓受到乙草胺脅迫的預(yù)警信號(hào)，并建立了NRRT 和土壤中乙草胺殘留濃度的關(guān)系模型?？偟膩碚f，農(nóng)藥對蚯蚓的細(xì)胞毒性主要包括導(dǎo)致細(xì)胞密度和活性變化、細(xì)胞膜通透性改變以及溶酶體膜損傷等方面 (表2)。

3.4 遺傳毒性

DNA 作為遺傳信息的載體，易受到生命體內(nèi)部或外部因素的影響而產(chǎn)生損傷[99]。單細(xì)胞凝膠電泳法 (彗星試驗(yàn)) 是一種能快速地在單細(xì)胞水平檢測DNA 損傷的測試方法[100]，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥對蚯蚓遺傳毒性的評價(jià) (表2)。Liu 等[101]通過單細(xì)胞凝膠電泳法，發(fā)現(xiàn)硫丹暴露后蚯蚓的OTM 值 (Olive 尾矩) 增加，認(rèn)為其誘導(dǎo)了蚯蚓DNA 鏈的斷裂。Yao 等[102]發(fā)現(xiàn)，除0.5 mg/kg 處理組外，1.5、5 和50 mg/kg 苯并烯氟菌唑處理組蚯蚓的OTM 值均顯著高于對照組，證明苯并烯氟菌唑造成了蚯蚓DNA 的損傷。此外，殺菌劑噻呋酰胺 (thifluzamide) 也可導(dǎo)致蚯蚓細(xì)胞核出現(xiàn)大量拖尾，使DNA 呈蓬松狀；同時(shí)，噻呋酰胺對蚯蚓OTM 值的影響還存在劑量依賴效應(yīng)[103]。除導(dǎo)致蚯蚓DNA 拖尾長度和OTM 值顯著增加外，還有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)莠去津的質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/kg時(shí)，蚯蚓體腔細(xì)胞的大部分DNA 會(huì)遷出細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞核呈現(xiàn)鏤空狀，造成DNA 損傷[104]。劉修園等[105]研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓經(jīng)5 和10 mg/kg 的氟苯蟲酰胺 (flubendiamide) 暴露7 d 后，其DNA 的OTM值隨著染毒劑量的增加和暴露時(shí)間的推移而升高，并顯著高于對照組。

3.5 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是由于蚯蚓體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受到抑制以及活性氧 (ROS) 的過量產(chǎn)生并超過了內(nèi)源性抗氧化能力而引起的毒性效應(yīng)[106]，其進(jìn)一步會(huì)誘導(dǎo)蚯蚓脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)損傷、DNA 損傷以及細(xì)胞凋亡[92]。其中，丙二醛 (MDA) 作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，在破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的同時(shí)還會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)及核酸聚合，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性[107]。當(dāng)ROS 積累至一定程度時(shí)，還會(huì)進(jìn)攻DNA分子中鳥嘌呤堿基的第8 位碳原子而產(chǎn)生8-羥基脫氧鳥苷 (8-OHdG)；與此同時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)被激活，從而降低其過氧化氫 (H2O2) 等ROS 的積累，以達(dá)到自身防御作用[108](圖2)。對于農(nóng)藥暴露造成的氧化損傷，蚯蚓主要通過提高抗氧化酶活性來實(shí)現(xiàn)其機(jī)體防御，因此超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD) 及過氧化氫酶(CAT) 等主要抗氧化酶的活性是評價(jià)蚯蚓受農(nóng)藥影響后體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)[109](表2)。

圖2 農(nóng)藥誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生氧化應(yīng)激的內(nèi)在過程Fig.2 The internal process of oxidative stress in earthworms induced by pesticides

張程[110]將蚯蚓暴露于不同濃度的氟嘧菌酯后，發(fā)現(xiàn)潮土、紅土、黑土3 種不同性質(zhì)土壤中的氟嘧菌酯均可導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)的ROS 含量升高，誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生氧化應(yīng)激。Liu 等[87]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)25 mg/kg 的己唑醇暴露7 和14 d 后，均可以顯著提高蚯蚓體內(nèi)ROS 的水平，證明己唑醇會(huì)導(dǎo)致蚯蚓氧化損傷。蚯蚓在受到溴氰蟲酰胺 (cyantranilipr)刺激后，其體內(nèi)ROS 含量改變，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，同時(shí)蚯蚓體內(nèi)8-OHdG 含量的改變表明溴氰蟲酰胺還導(dǎo)致了其DNA 損傷[108]。Qiao 等[111]基于蚯蚓在溴氰蟲酰胺刺激下蛋白羰基 (PCO) 含量的升高，證明溴氰蟲酰胺暴露造成了蚯蚓蛋白質(zhì)的氧化損傷。肟菌酯 (trifloxystrobin) 的暴露也會(huì)導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)ROS 積累，顯著改變SOD 及CAT 等抗氧化酶的活性，同時(shí)研究人員通過計(jì)算綜合生物標(biāo)志物反應(yīng)指數(shù) (IBR) 發(fā)現(xiàn)，棕色土壤中的肟菌酯對蚯蚓所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激要大于人工土壤[112]。在為期28 d 的三酮類除草劑硝磺草酮 (mesotrione)暴露期內(nèi)，蚯蚓ROS 含量均顯著高于對照組且呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，同時(shí)基于SOD、CAT及POD 活性的變化，表明蚯蚓抗氧化酶系統(tǒng)被激活以清除過量的ROS，其中CAT 和POD 的活性在28 d 時(shí)接近對照水平，進(jìn)一步表明二者最終共同清除了蚯蚓體內(nèi)過多的ROS[113]。研究人員發(fā)現(xiàn)，精甲霜靈暴露也會(huì)導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)ROS 含量的升高，在第21 天和第28 天，由于抗氧化酶的作用使ROS 含量較前兩周開始下降，以緩解精甲霜靈所誘導(dǎo)的氧化損傷[114]。此外，經(jīng)0.125、0.25、0.5 及1 μg/cm2的二甲吩草胺-p(dimethenamid-p)暴露48 h 后，蚯蚓體內(nèi)的ROS 含量并沒有發(fā)生顯著改變，表明蚯蚓自身的抗氧化酶系統(tǒng)仍能及時(shí)清除所產(chǎn)生的過量ROS[15]。張榜軍等[115]基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù) (RT-qPCR) 發(fā)現(xiàn)，除草劑2,4-D 暴露改變了蚯蚓hsp70和crt基因的表達(dá)水平，

證明了蚯蚓體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。為評估毒死蜱對蚯蚓的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，F(xiàn)arsani 等[116]研究發(fā)現(xiàn)，在毒死蜱暴露的第4 和第8 天，19.2 和38.4 mg/kg 處理組蚯蚓的MDA 含量顯著升高。Fang 等[117]也發(fā)現(xiàn)了蚯蚓在經(jīng)氟啶蟲胺腈 (sulfoxaflor) 暴露 7 d以后，其體內(nèi)MDA 的含量顯著升高。上述研究強(qiáng)調(diào)了毒死蜱和氟啶蟲胺腈暴露除了可導(dǎo)致蚯蚓發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用外，還可以誘發(fā)蚯蚓的細(xì)胞毒性。此外，作為解毒酶系統(tǒng)中清除過氧化物的關(guān)鍵酶[108]，GST 在蚯蚓受到多菌靈 (carbendazim)的干擾后活性顯著提高，進(jìn)而有助于減輕多菌靈對蚯蚓造成的氧化損傷[118]。

4 基于組學(xué)技術(shù)的農(nóng)藥對蚯蚓致毒機(jī)制研究進(jìn)展

4.1 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的農(nóng)藥對蚯蚓致毒機(jī)制研究

轉(zhuǎn)錄是遺傳信息從DNA 轉(zhuǎn)向RNA 的過程，是調(diào)控生物體基因表達(dá)的重要方式之一。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體水平上研究機(jī)體細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，其可以從轉(zhuǎn)錄水平揭示生物受到脅迫后整個(gè)基因組表達(dá)情況[119]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的核心技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組測序，即利用儀器對試驗(yàn)樣品的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行測序，以獲取遺傳序列信息[120]。目前，相關(guān)測序技術(shù)已發(fā)展至第3 代，但在蚯蚓毒理學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用較多且較成熟的則是以Illumina 為主要測序平臺(tái)的第2 代測序技術(shù)。在獲得轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果并篩選出差異表達(dá)的基因 (DEGs) 后，研究人員還可基于京都基因和基因組百科全書 (KEGG)、基因本體功能 (GO) 等數(shù)據(jù)庫對DEGs 進(jìn)行功能注釋，進(jìn)而從基因表達(dá)層面闡述試驗(yàn)變量對蚯蚓生物學(xué)功能的影響[23]。此外，為了明確差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)水平，還有一些研究使用RT-qPCR 技術(shù)評估了差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度差異[120]。

已有研究表明，農(nóng)藥可以通過影響蚯蚓不同代謝通路中相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而對蚯蚓造成不利影響。Li 等[23]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，分析了暴露于嗪草酮和戊唑醇后蚯蚓的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)2 種農(nóng)藥均導(dǎo)致了Ankyrin-2、Chitinase、Scavenger receptor、Cytochrome P450等與神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及氧化應(yīng)激相關(guān)基因的異常表達(dá)，證明了嗪草酮和戊唑醇可誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生神經(jīng)毒性、免疫毒性以及氧化應(yīng)激。張程[110]運(yùn)用RNAseq 對氟嘧菌酯處理后蚯蚓的基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行探究，從0、0.1、1 和2.5 mg/kg 4 種質(zhì)量濃度的氟嘧菌酯處理組共篩選出27 個(gè)共同的DEGs，同時(shí)基于這27 個(gè)DEGs 的KEGG 富集分析結(jié)果表明，氟嘧菌酯影響了蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和降解，同時(shí)影響了其信號(hào)傳導(dǎo)、免疫以及細(xì)胞生長相關(guān)的途徑，此外根據(jù)其血管生成素基因表達(dá)量的下調(diào)，還發(fā)現(xiàn)蚯蚓的血液循環(huán)受到了干擾。Qiao等[111]研究發(fā)現(xiàn)，1 和10 mg/kg 的溴氰蟲酰胺可分別誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)960 和1212 個(gè)基因表達(dá)異常，其中氨基糖、核苷酸糖相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而類固醇激素生物合成和蛋白質(zhì)消化吸收通路的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，證明溴氰蟲酰胺影響了蚯蚓體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的生物合成及其吸收與轉(zhuǎn)化過程。Liu 等[87]基于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，己唑醇(HEX) 暴露可使蚯蚓體內(nèi)20 多個(gè)生物途徑發(fā)生變化，其中S-(+)-HEX 對蚯蚓類固醇的生物合成、花生四烯酸代謝和細(xì)胞周期等過程的影響比R-(-)-HEX 明顯。研究人員通過Illumina Novaseq 6000對蚯蚓樣品的cDNA 進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)25 和50 mg/kg的氟吡呋喃酮 (flupyradifurone) 共同顯著改變了蚯蚓880 個(gè)基因的表達(dá)，并通過KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋了蚯蚓的DEGs 功能，同時(shí)針對與熱休克蛋白(HSP)、AchE 及細(xì)胞色素P450 酶相關(guān)的DEGs，通過RT-qPCR 技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)氟吡呋喃酮暴露后顯著影響了蚯蚓的信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)合成與代謝、細(xì)胞進(jìn)程以及解毒等通路，進(jìn)一步破壞了蚯蚓的神經(jīng)系統(tǒng)、糖脂代謝以及誘導(dǎo)蚯蚓細(xì)胞損傷與凋亡[121]。Zhang 等[122]根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)戊唑醇暴露后蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)卵相關(guān)基因Annetocin的表達(dá)降低，從而干擾其產(chǎn)卵過程，表現(xiàn)出生殖毒性 (表3)。

4.2 基于代謝組學(xué)的農(nóng)藥對蚯蚓致毒機(jī)制研究

代謝組學(xué)作為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一種新的組學(xué)方法[10]，主要通過研究生物體內(nèi)源性代謝產(chǎn)物相對含量的變化，從整體水平研究生物體的代謝變化[123]，目前已廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、醫(yī)學(xué)及食品等領(lǐng)域中[124-126]?，F(xiàn)階段，代謝組學(xué)主要依靠核磁共振波譜 (NMR)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (GC-MS/MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 等平臺(tái)檢測生物體氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、維生素和脂類等內(nèi)源性代謝產(chǎn)物[127-129]。代謝組學(xué)作為一種高通量、高靈敏度的分析方法，在完成樣品檢測工作后會(huì)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，因此，研究人員常通過多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)處理工作[130]。具體來說，主要是基于主成分分析 (PCA)、偏最小二乘法-判別分析 (PLSDA)、正交偏最小二乘法-判別分析 (OPLS-DA) 等模式識(shí)別方法來篩查試驗(yàn)組間的差異代謝物，初步評估試驗(yàn)變量對生物體代謝譜的影響。最后，利用KEGG、人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫 (HMDB) 等公共數(shù)據(jù)庫解釋差異代謝物的生物學(xué)功能，以進(jìn)一步評估試驗(yàn)變量對生物體的分子作用機(jī)制[123]。

農(nóng)藥在引起蚯蚓代謝過程發(fā)生改變后，基于代謝組學(xué)技術(shù)可以闡述農(nóng)藥干擾蚯蚓特定代謝途徑的具體機(jī)制[131]。Dani 等[24]利用1H NMR 分析平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)亞致死劑量的莠去津抑制了蚯蚓的整體代謝水平，并可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)麥芽糖、延胡索酸、蘋果酸、蘇氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺及ATP 等物質(zhì)發(fā)生顯著變化。同時(shí)，他們進(jìn)一步指出，莠去津通過抑制蚯蚓ATP 的合成而擾亂其能量代謝[24]。Dani 等[130]借助主成分分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蚯蚓在接觸吡蟲啉后代謝水平較對照組發(fā)生了顯著改變，且該變化與吡蟲啉暴露濃度無關(guān)；此外，基于谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸及肌苷等代謝物水平的改變，表明吡蟲啉影響了蚯蚓的糖異生以及ATP 的合成過程 。Mudiam[132]等利用GC-MS/MS 平臺(tái)，借助多變量分析，研究了克百威 (carbofuran) 對蚯蚓的代謝擾動(dòng)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)克百威暴露后，蚯蚓體內(nèi)葡萄糖、半乳糖等糖類代謝物以及酪氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、絲氨酸及苯丙氨酸等氨基酸類代謝物的相對含量表現(xiàn)出顯著波動(dòng)，證明克百威可以顯著干擾蚯蚓的蛋白質(zhì)和糖類代謝過程。Zhang 等[133]利用非靶向代謝組學(xué)，闡釋了甲霜靈和精甲霜靈對蚯蚓代謝過程的選擇性作用差異主要是由于精甲霜靈對蚯蚓三羧酸循環(huán)和尿素循環(huán)產(chǎn)生的干擾較甲霜靈大。根據(jù)一維和二維NMR 代謝組學(xué)研究結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)，硫丹及其代謝物硫丹硫酸鹽可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)谷氨酸循環(huán)代謝產(chǎn)物以及亞精胺發(fā)生顯著波動(dòng)，從而導(dǎo)致蚯蚓產(chǎn)生神經(jīng)中毒和細(xì)胞凋亡[134]。為了明確氯氰菊酯對蚯蚓的代謝擾動(dòng)，Ch 等[135]基于GC-MS/MS 代謝組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯可影響蚯蚓體內(nèi)22 種代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致蚯蚓神經(jīng)元代謝發(fā)生明顯變化，同時(shí)增加了糖原和脂肪酸的消耗，進(jìn)而影響蚯蚓體內(nèi)正常的生理生化過程以及誘導(dǎo)神經(jīng)毒性。還有研究發(fā)現(xiàn)，氟啶蟲胺腈激活了蚯蚓體內(nèi)的能量代謝和尿素循環(huán)，但抑制了核苷酸的代謝，這一作用被認(rèn)為是造成蚯蚓DNA 損傷的因素[117]。楊曉霞等[136]基于代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦暴露會(huì)導(dǎo)致蚯蚓糖酵解及三羧酸循環(huán)減弱，氨基酸代謝受損，嘌呤代謝紊亂，細(xì)胞滲透功能受損，對蚯蚓的正常生長產(chǎn)生明顯毒副作用?？傊x組學(xué)可揭示農(nóng)藥暴露后蚯蚓體內(nèi)代謝譜的波動(dòng)，從而進(jìn)一步明確了農(nóng)藥暴露對蚯蚓糖類、脂類代謝以及尿素循環(huán)等過程的潛在毒性作用機(jī)制 (表3)。

4.3 基于微生物組學(xué)的農(nóng)藥對蚯蚓致毒機(jī)制研究

蚯蚓的腸道是一個(gè)接近于厭氧狀態(tài)的微環(huán)境，其中的菌群具有富集碳、氮、磷元素的能力[137]，而農(nóng)藥的暴露脅迫與蚯蚓腸道菌群特征之間具有復(fù)雜的相互依賴性。宏基因組學(xué)是一種通過功能基因篩選或測序分析，研究特定環(huán)境中微生物的新方法[138]，用于對樣本中所包含的微生物基因組進(jìn)行功能性和序列性的分析，其中，擴(kuò)增子測序技術(shù)正逐漸成為環(huán)境微生物組學(xué)的主要研究手段[139]。目前，已有大量基于宏基因組學(xué)研究農(nóng)藥對蚯蚓腸道微生物結(jié)構(gòu)和豐度影響的報(bào)道。Zhu 等[25]通過微生物組分析發(fā)現(xiàn)，蚯蚓腸道中變形菌門 (Proteobacteria)、厚壁菌門 (Firmicutes)、放線菌門 (Actinobacteria) 以及泉古菌門 (Crenarchaeota)的相對豐度隨著氯丹 (chlordane) 暴露濃度的增大而升高，而浮霉菌門 (Planctomycetes) 和綠彎菌門(Chloroflexi) 的相對豐度則呈相反趨勢；同時(shí)他們對蚯蚓腸道菌群進(jìn)行遺傳功能注釋后，發(fā)現(xiàn)氯丹暴露會(huì)刺激蚯蚓的免疫功能，并使得蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、硝酸鹽轉(zhuǎn)化以及葡萄糖、脂質(zhì)和氨基酸的代謝過程發(fā)生改變。此外，Chang 等[140]的研究還發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)放線菌門下芽生球菌(Blastococcus)、諾卡氏菌 (Nocardioides)、節(jié)桿菌(Arthrobacter) 和放線菌 (Gaiella) 豐度的增加對于氟磺胺草醚 (fomesafen) 在蚯蚓體內(nèi)的生物富集具有推動(dòng)作用，而芽孢桿菌 (Bacillus)、微枝形桿菌(Microvirga) 及羅爾斯通菌 (Ralstonia) 豐度的減少則證明，蚯蚓在暴露于氟磺胺草醚后其代謝能力有所下降?；诩{米孔測序結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)，毒死蜱暴露后蚯蚓腸道菌群α-多樣性和β-多樣性發(fā)生了顯著改變，其中蚯蚓腸道細(xì)菌群落受毒死蜱的影響較真菌群落更顯著[141]。Astaykina等[142]基于宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)嗪草酮、吡蟲啉和苯菌靈 (benomyl) 可以顯著改變蚯蚓腸道菌群的結(jié)構(gòu)與豐度，主要表現(xiàn)為變形菌門 、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉?fàn)罹?(Planctomyces)、疣微菌門 (Verrucomicrobia) 及藍(lán)菌門 (Cyanobacteria)

的相對豐度增加，而放線菌門的相對豐度降低。同時(shí)，該研究表明，放線菌門豐度的降低是蚯蚓代謝能力下降的因素之一，此外他們還鑒定出蚯蚓腸道中蚯蚓狀腎桿菌屬 (Verminephrobacter)、不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter)、Candidatus udaeobacter及假蒼白桿菌屬 (Pseudochrobactum) 等細(xì)菌是對嗪草酮、吡蟲啉和苯菌靈敏感的菌群[142]。最近的一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，多菌靈會(huì)富集蚯蚓腸道中放線菌門下的特定菌群，且多菌靈暴露誘導(dǎo)了蚯蚓腸道內(nèi)四環(huán)素類、利福霉素類和糖肽類抗生素抗性基因 (ARGs) 豐度的增加[143]?？傮w而言，目前從微生物角度闡明農(nóng)藥對蚯蚓毒理學(xué)影響的研究大多聚焦于農(nóng)藥暴露前后蚯蚓腸道微生物的組成與豐度變化，然后基于產(chǎn)生豐度差異的微生物類群，并結(jié)合現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)以闡述農(nóng)藥對蚯蚓的作用機(jī)理 (表3)。

5 總結(jié)與展望

農(nóng)藥進(jìn)入土壤環(huán)境后，會(huì)對蚯蚓產(chǎn)生不同程度的影響，部分農(nóng)藥即使在較低濃度下也會(huì)對蚯蚓的生長、發(fā)育、繁殖等過程產(chǎn)生不同層次的毒性效應(yīng)，對土壤生態(tài)環(huán)境具有潛在風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)階段，有關(guān)農(nóng)藥對蚯蚓的毒性研究主要集中于生長生殖毒性、遺傳毒性、細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性及氧化應(yīng)激等方面 (圖3)。依據(jù)此類研究數(shù)據(jù)，對于部分高殘留、對蚯蚓高毒性農(nóng)藥的使用需進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)范的管理，以期進(jìn)一步降低農(nóng)藥對蚯蚓的毒性影響。與此同時(shí)，目前針對農(nóng)藥對蚯蚓毒理學(xué)效應(yīng)的研究仍然是片面的，迫切需要借助更多新的技術(shù)手段進(jìn)行農(nóng)藥對蚯蚓毒理學(xué)效應(yīng)的評估研究，并根據(jù)研究結(jié)果科學(xué)地評估相關(guān)農(nóng)藥的土壤環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。此外，組學(xué)技術(shù)在環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用為農(nóng)藥對蚯蚓致毒機(jī)制的探究作出了重大貢獻(xiàn)，但組學(xué)技術(shù)在闡明其中相關(guān)機(jī)制的過程中仍有較大發(fā)展空間。轉(zhuǎn)錄組學(xué)雖然改變了傳統(tǒng)的針對單個(gè)基因的研究模式，轉(zhuǎn)而從轉(zhuǎn)錄水平上揭示部分農(nóng)藥對蚯蚓的毒性作用機(jī)制，但仍需進(jìn)一步完善不同種類蚯蚓的基因組測序以及相關(guān)基因注釋等工作，同時(shí)需要解決蚯蚓中相關(guān)蛋白mRNA的豐度與蛋白本身含量或活性的關(guān)系不一致等問題，以期為蚯蚓的基因功能分析以及農(nóng)藥對蚯蚓的致毒機(jī)制探究提供堅(jiān)實(shí)的工具[144-145]。相較于其他組學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)技術(shù)雖然可以完整地反映出蚯蚓代謝水平的變化，但受制于檢測技術(shù)，目前在研究中并無法真正實(shí)現(xiàn)對蚯蚓全部代謝物的檢測以及對其代謝通路的精準(zhǔn)定位[10]。更重要的是，單一的組學(xué)技術(shù)并不能完全闡述農(nóng)藥對蚯蚓的致毒機(jī)制，因而多組學(xué)技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用將是未來相關(guān)機(jī)制探究的主流手段。正如現(xiàn)階段微生物組學(xué)的發(fā)展，便為多組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用提供了重要的發(fā)展思路。事實(shí)上，微生物組學(xué)囊括了宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)等其他檢測手段，可基于多種檢測技術(shù)對蚯蚓腸道等微生物進(jìn)行分析[146]。同樣，突破單一組學(xué)技術(shù)的弊端，從代謝水平、轉(zhuǎn)錄水平、基因水平、蛋白質(zhì)水平等其他層面綜合進(jìn)行探究，將組學(xué)技術(shù)進(jìn)行有意義的結(jié)合，對于全面闡述農(nóng)藥對蚯蚓的致毒機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

圖3 基于組學(xué)技術(shù)的農(nóng)藥對蚯蚓致毒機(jī)制研究Fig.3 Study of the toxicological mechanisms of pesticides on earthworms based on omics technology

除此之外，雖然已有大量研究揭示了農(nóng)藥對蚯蚓的毒性效應(yīng)，并利用組學(xué)技術(shù)初步探索了農(nóng)藥對蚯蚓的致毒機(jī)制，但現(xiàn)階段有關(guān)農(nóng)藥對蚯蚓的毒理學(xué)研究仍集中于對單一農(nóng)藥毒性的評估，忽視了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中實(shí)際用藥的復(fù)雜性及其他諸多因素的影響。從農(nóng)藥使用層面而言，大多數(shù)研究都是將農(nóng)藥原藥 (有效成分) 作為供試藥劑來評估其生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，從而忽視了農(nóng)藥劑型中助劑等成分對蚯蚓的潛在毒性影響。此外，納米農(nóng)藥具有提高農(nóng)藥利用率及生物活性、延長持效期等優(yōu)勢，成為近年來農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)[147]，但其對蚯蚓的毒性效應(yīng)等迫切需要進(jìn)一步探究。從土壤污染層面而言，Shen 等[148]在中國太湖地區(qū)的土壤中檢測出了Cd、Cr、Cu 等重金屬與農(nóng)藥的共同殘留；張俊麗等[149]在分析中國陜西省渭南市種植業(yè)面源污染現(xiàn)狀時(shí)發(fā)現(xiàn)，2017 年當(dāng)?shù)剞r(nóng)用地膜的回收率僅為47.9%，具有較大的土壤殘留風(fēng)險(xiǎn)。因此，探明重金屬、殘留地膜等其他污染源與農(nóng)藥復(fù)合污染對蚯蚓的毒理學(xué)影響更具有實(shí)際意義[150-151]?，F(xiàn)有研究已證實(shí)，聚苯乙烯微塑料會(huì)破壞蚯蚓腸道細(xì)胞，誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并對其繁殖產(chǎn)生不利影響[152-153]，除此之外，重金屬作為土壤中另一重要污染源也會(huì)在蚯蚓體內(nèi)富集，并對其腸道組織、抗氧化酶系統(tǒng)等產(chǎn)生影響[154-156]，但目前關(guān)于農(nóng)藥與微塑料、重金屬等其他土壤污染物共同暴露對蚯蚓毒性影響的研究仍較少，其對蚯蚓的復(fù)合毒性亟待進(jìn)一步評估。因此，農(nóng)藥與其他土壤污染物的復(fù)合毒性評估及其機(jī)制探究將是未來農(nóng)藥土壤生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)之一。