劉 陽, 鄧仕萍, 劉 丹, 李姝慧, 孟紫薇

(中國農業(yè)大學 理學院，北京 100193)

牛生乳形成過程中的多個環(huán)節(jié)可能受到農藥污染，如飼料原料中的農藥殘留；在儲存、加工等過程中可能引入的農藥殘留；控制養(yǎng)殖場的衛(wèi)生環(huán)境所使用的殺蟲劑混入動物的飼料和飲用水中導致的農藥殘留等[1-2]。

目前，關于牛奶中農藥殘留的分析報道主要集中在有機氯類[3]、有機磷類[4-6]、氨基甲酸酯類[7]、新煙堿類[8]和菊酯類[9]等農藥。牛奶作為脂溶性物質的良好載體，脂溶性農藥更容易在牛奶中殘留。正辛醇-水分配系數(shù) (LogKow) 常被作為脂溶性指標，當農藥的LogKow> 3 時被認為是脂溶性的[10]。本研究根據中國農藥信息網上農藥登記的飼料作物以及LogKow> 3，選取了目前在牛生乳基質中相關研究較少的12 種脂溶性農藥及其代謝物，研究其在牛生乳中的殘留水平。

目前，關于牛奶中農藥殘留檢測的樣品前處理方法主要有液液分配 (LLE)[7]、分散液液微萃取(DLLME)[8]、凝膠滲透色譜 (GPC)[11]、固相萃取(SPE)[12]、酶抑制法、免疫分析技術[13]、QuEChERS[14]等。其中，DLLME 能很大程度地節(jié)約溶劑，富集目標物，但方法優(yōu)化影響因素多，操作復雜且平行性較差；LLE 和GPC 能除去樣品中的脂類，但一般需耗費大量溶劑；SPE 凈化能力強，但成本較高，處理過程較繁瑣[15]；酶抑制法和免疫分析技術能快速、特異性地分析樣品中的農藥殘留，但存在重現(xiàn)性差和適用范圍窄等缺點。而QuEChERS方法因其簡單、快速、低成本、高通量、溶劑用量少等優(yōu)點，被廣泛應用在高水分和高含油基質中農藥殘留的測定[16-19]。

牛奶中農藥殘留的檢測方法主要有：氣相色譜法[20]、氣相色譜-質譜法[21]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法[22]、高相液相色譜法[23]、液相色譜-質譜法[24]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)等[25]。其中，液相色譜-串聯(lián)質譜法因其靈敏度高、特異性強、分析速度快，成為農藥多殘留測定的首選方法[26]。本研究利用QuEChERS 前處理方法結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜 (HPLC-MS/MS) 檢測手段，對牛生乳中我國尚未建立最大殘留限量 (MRL) 值的12 種脂溶性農藥及其3 種代謝物的殘留分析方法進行研究，并對市售牛生乳進行抽檢，旨在為我國牛生乳中農藥MRLs 值標準的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent 6410B 液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜儀 (美國 Agilent 公司)；JY2002 型電子天平 (精度0.01 g，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；JA2003B 型電子天平 (0.001 g，上海越平科學儀器有限公司)；AUW220D 型電子分析天平(0.0001 g，日本島津制作所)；VORTEX-5 型旋渦混合器 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；RJTDL-40B 型低速臺式離心機 (無錫市瑞江分析儀器有限公司)；HC-2517 型高速離心機 (安徽中科中佳科學儀器有限公司)；0.22 μm 尼龍有機濾膜 (上海安譜實驗科技股份有限公司)；1 mL 無菌醫(yī)用注射器 (江蘇治宇醫(yī)療器械有限公司)；50 mL 塑料離心管 (美國康寧公司)。

1.1.2 供試材料及試劑 牛生乳 (新疆布拉合農場)；甲酸、氯化鈉和無水硫酸鎂 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇和乙腈 (色譜純，F(xiàn)isher Chemicals 公司)；純凈水 (天津娃哈哈宏振飲料有限公司)；石墨化碳黑 (GCB，38～125 μm)、十八烷基硅烷鍵合硅膠 (C18，50 μm (60 ?)) 和N-丙基乙二胺 (PSA，40～60 μm (60 ?))，均購自天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.1.3 農藥標準品 炔草酯 (純度98.3%) 和炔草酸 (純度99.1%)，購自上海市農藥研究所有限公司；環(huán)丙唑醇 (純度99.6%)，購自沈陽化工研究院有限公司；抑霉唑 (純度98.5%)，購自國家農藥質量監(jiān)督檢驗中心；氟吡乙禾靈 (純度98.3%)、氟吡禾靈 (純度99.1%) 和乙螨唑 (純度99%)，購自壇墨質檢科技股份有限公司；肟菌酸 (純度98%)、啶氧菌酯 (純度99.6%)、唑螨酯 (純度95%)、虱螨脲 (純度98.7%) 和氟吡甲禾靈 (純度98.0%)，購自德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；吡氟酰草胺(純度99.7%)，購自國家農藥質量監(jiān)督檢驗中心；肟菌酯 (純度99.6%)，購自德國Bayer Corp Science；茚蟲威 (純度97.8%)，購自安到麥馬克西姆有限公司。15 種目標化合物的具體信息詳見表1。表中11 種農藥在動物源性食品中的殘留物定義來自(世衛(wèi)組織/糧農組織) 農藥殘留聯(lián)席會議 (JMPR)報告[27]，氟吡甲禾靈的殘留定義來自GB2763—2021[28]；12 種農藥的最大殘留限量來自澳大利亞[29]和國際食品法典委員會(CAC)[30]。

表1 15 種目標化合物的CAS 號、分子式、LogKow、殘留物定義、最大殘留限量及登記飼料作物Table 1 CAS number, molecular formula, LogKow, definition of the residue, maximum residue limit (MRL) and registered feed crops of 15 target compounds

1.2 標準溶液配制

單一溶劑標準儲備液：準確稱取各標準品10 g(精確至0.0001g)，分別用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為1000 mg/L 的單一溶劑標準儲備液，于 -18 ℃冰箱保存。

混合溶劑標準工作液：準確移取上述各單一標準儲備液，用體積分數(shù) (下同) 為1%的甲酸乙腈逐級稀釋，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.4 和1 mg/L 的系列混合標準工作液。

1.3 樣品前處理

準確稱取10.0 g 牛生乳均質樣品于50 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL 1%的甲酸乙腈溶液，渦旋提取3 min，加入3 g NaCl，渦旋5 min 后于3800 r/min 下離心 5 min。取3 mL 上清液至10 mL 聚丙烯離心管中，置于 -18 ℃冰箱冷凍5 h。取1 mL 上清液，加入裝有100 mg C18的2 mL 離心管中，渦旋2 min，于10 000 r/min 下離心 1 min。取上清液，過 0.22 μm 有機系濾膜，待HPLC-MS/MS 測定。

1.4 HPLC-MS /MS 檢測條件

1.4.1 液相色譜條件 Athena C18-WP 色譜柱(50 mm ×4.6 mm, 5 μm)；柱溫 30℃；流速 0.3 mL/min；進樣量 5 μL；流動相A 相為乙腈，B 相為體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～1.5 min，5%A；>1.5～6 min，55%～65% A；>6～9 min，65%～80% A；>9～10 min，80%～5% A；>10～15 min，5% A。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下采用多重反應監(jiān)測(MRM)模式采集數(shù)據。離子噴霧電壓4000 V；霧化氣壓力240 MPa；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃。MRM 模式下15 種目標化合物質譜參數(shù)詳見表2。

表2 15 種目標化合物的保留時間和質譜參數(shù)Table 2 Retention time and mass spectrometry parameters of 15 target compounds

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 液相色譜條件的優(yōu)化 1) 流動相的選擇。在20 min 內，將有機相比例從0 線性升高至100%，考察了甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液在相同梯度洗脫條件下，對15 種目標化合物的分離度、響應值和峰形的影響。結果表明：以甲醇-水作為流動相時，20 min 內15 種目標化合物尚未完全出峰(圖1 A-I)，說明此流動相體系出峰時間較晚；而以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時，各目標化合物色譜峰形良好，響應值均能達到最低檢測需求，單針運行時間短，色譜峰分離度更優(yōu) (圖1 A-Ⅱ)。因此，選用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為15 種目標化合物色譜分離的流動相。

圖1 線性提高有機相比例時 (A) 及梯度洗脫程序下 (B) 15 種目標化合物的混合標準溶液 (0.1 mg/L) 的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solutions (0.1 mg/L) of 15 target compounds when linearly lifting the organic phase (A) and under gradient elution procedure (B)

2) 洗脫條件的優(yōu)化。梯度洗脫總時間tg為20 min，第1 個峰為ti，最后1 個峰為tf，兩者的差值Δtg= (tf-ti)。若 Δtg＜ 0.25tg，則適用等度洗脫；若Δtg> 0.25tg，則適用梯度洗脫。如圖1 A-Ⅱ所示，ti(抑霉唑) 的保留時間為12.2 min，tf(唑螨酯) 的保留時間為18.7 min。Δtg= (ti-tf) = 6.5 min > 0.25tg(5 min)，表明該方法適合梯度洗脫。梯度洗脫程序按1.4.1 節(jié)所述，15 種目標化合物在此色譜條件下分離出11 個色譜峰，色譜圖詳見圖1B。

2.1.2 質譜條件的優(yōu)化 以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，在全掃描 M2 Scan 模式下提取母離子，SIM 模式下優(yōu)化碎裂電壓，比較正離子 (ESI+)和負離子 (ESI-) 掃描模式下15 種目標化合物的質譜響應值。結果發(fā)現(xiàn)，15 種目標化合物在 ESI+模式下均可得到穩(wěn)定的[M + H]+離子峰，響應值明顯優(yōu)于 ESI-模式。以 Product Ion 為掃描類型確定碎片離子，取其中豐度較高的作為子離子，然后在MRM 模式下優(yōu)化各子離子的碰撞能量，最終根據色譜峰的響應值確定不同化合物的定性離子和定量離子。15 種目標化合物的定性離子和定量離子詳見表2。

2.2 提取方法的優(yōu)化

QuEChERS 方法提取農藥殘留時，常以乙腈作為提取溶劑，乙腈在NaCl 鹽析的作用下與水相分層，可以很好地去除蛋白質和糖類等極性物質[31]。本研究中12 種目標農藥的LogKow> 3，脂溶性較強，在乙腈中有很好的溶解度。牛生乳中含蛋白質較多，僅以乙腈提取會導致蛋白質的共提取，為了減少蛋白質的共提取并提高牛生乳中15 種目標化合物的提取效率，考察了純乙腈以及0.5%、1%和3%的甲酸乙腈對15 種目標化合物提取效果的影響，如圖2 所示。

圖2 提取溶劑對牛生乳中15 種目標化合物的回收率(A)和基質效應(B)的影響 (n = 3)Fig.2 Effects of extraction solvents on the recovery (A) and matrix effect (B) of 15 target compounds in raw milk (n = 3)

圖2A 中，以乙腈為提取溶劑時，15 種目標化合物中除炔草酸、啶氧菌酯、炔草酯、氟吡甲禾靈、茚蟲威和氟吡乙禾靈6 種化合物的回收率在92%～110%之間外，其余目標化合物的回收率在73%～97% 之間；以酸化乙腈為提取溶劑時，15 種目標化合物的回收率在87%～115%之間，表明乙腈的提取效率相對較低，而3 種酸化乙腈對目標物的提取效率之間差異不明顯。圖2B 的結果表明，以乙腈作為提取溶劑時，氟吡禾靈和肟菌酸的基質效應明顯高于酸化乙腈的基質效應。但1%的甲酸乙腈溶液作為提取溶劑時的基質效應最弱。綜上所述，選用1%甲酸乙腈溶液作為牛生乳中15 種目標化合物的提取溶劑。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

2.3.1 低溫冷凍除脂 在牛生乳基質中，影響回收率結果的主要是基質中的脂類，低溫冷凍可以有效去除基質提取液中的脂肪[32-33]。本研究將3 mL 鹽析后的提取上清液加入到10 mL 聚丙烯離心管中，置于低于 -18 ℃的冰箱中冷凍除脂?？疾炝死鋬鰰r間分別為0、1、2、3、4 和5 h，對牛生乳基質提取液中15 種目標化合物的回收率和基質效應的影響。如圖3 所示：低溫冷凍0～5 h 內，15 種目標化合物在牛生乳中的回收率在81%～110%之間，RSD 在0.040%～2.7%之間。冷凍5 h 時，抑霉唑、炔草酸、氟吡禾靈、肟菌酸、啶氧菌酯、吡氟酰草胺和虱螨脲的基質效應均小于其他冷凍時間的，其余化合物的基質效應在 -5.7%～0.40%之間，均表現(xiàn)出輕度基質效應[34-35]，表明低溫冷凍5 h 凈化效果較好。

圖3 冷凍時間對牛生乳基質提取溶液中 15 種目標化合物回收率(A)和基質效應(B)的影響 (n = 3)Fig.3 Effects of freezing time on recovery (A) and matrix effect (B) of 15 target compounds in raw milk ( n = 3)

2.3.2 凈化劑種類的選擇 牛生乳中主要含有脂肪、脂肪酸、蛋白質、乳糖等雜質。PSA 常用于除去糖類、脂肪酸和有機酸等極性雜質；C18的比表面積大、吸附能力強，可有效去除脂肪和脂類等非極性雜質[36]。無水MgSO4不僅可以去除體系中殘余的水分，也能通過微放熱效應減少其他凈化劑對目標物的吸附[13]。本研究中，考察了C18、PSA、C18+ 無水MgSO4和PSA + 無水MgSO44 種凈化方式對牛生乳基質提取液凈化效果的影響。結果 (圖4) 表明：分別以PSA、PSA + 無水MgSO4和C18+ 無水MgSO4為凈化劑時，啶氧菌酯、肟菌酸、炔草酸、氟吡禾靈的回收率均不能滿足農藥殘留分析回收率在 70%～120% 的要求[37]。以C18為凈化劑時，15 種目標化合物的回收率在81%～109%之間，除虱螨脲的基質效應為-30%，表現(xiàn)為中度抑制外，其余目標化合物均表現(xiàn)為輕度基質增強效應，故選用C18作為牛生乳基質的凈化劑。

圖4 凈化劑組合對牛生乳基質提取液中15 種目標化合物回收率 (A) 和基質效應 (B) 的影響 (n = 3)Fig.4 Effects of cleanup sorbents on the recovery (A) and matrix effect (B) of 15 target compounds in matrix extracts of raw milk (n = 3)

2.3.3 C18用量的優(yōu)化 在其他試驗條件一致的情況下，分別考察了20、40、60、80 和100 mg C18對15 種目標化合物在牛生乳中的回收率和基質效應的影響。結果 (圖5) 表明：不同用量的C18對15 種目標化合物的平均回收率 (94%～111%)影響不大。但隨著C18用量的增加，除抑霉唑、炔草酯和肟菌酯外，其余目標化合物的基質效應均有降低的趨勢。當C18用量為100 mg 時，抑霉唑、炔草酯和肟菌酯的基質效應分別為0.10%、3.3%和1.4%，表現(xiàn)為輕度增強基質效應。因此選擇C18用量為100 mg。

圖5 C18 用量對牛生乳基質提取液中15 種目標化合物回收率 (A) 和基質效應 (B) 的影響(n = 3)Fig.5 Effects of amount of C18 on recovery (A) (n = 3) and matrix effect (B) of 15 target compounds in matrix extract of raw milk (n = 3)

2.4 基質效應

基質是樣品中除了被分析物以外的成分，對目標物的影響也不相同，也會對分析方法的線性、靈敏度、精密度和正確度造成干擾，這些影響和干擾被稱為基質效應 (ME)[34]。當ME = 0 時，表示無基質效應；當 -20% ≤ ME ≤ 20%時，表示弱基質效應，基質效應可以忽略；當20% ＜ME ≤ 50%或者 -50% ≤ ME ＜ -20%時，表示中度基質增強或者中度基質抑制效應；當ME > 50%或者 ＜ -50%時，表示重度基質增強或重度基質抑制效應?；|效應越接近0，說明凈化效果越好[35]。由表3 可知，除虱螨脲屬中度基質抑制效應外，其余14 種目標化合物的基質效應范圍在-0.50%～11%之間，屬于弱基質效應。綜合考慮，采用牛生乳基質空白溶液配制標準溶液，外標法定量。

表3 15 種目標化合物的線性方程、決定系數(shù)、檢出限、定量限和基質效應 (線性范圍：0.01～1 mg/L)Table 3 Linearity equations, determination coefficients, limit of detection (LOD) , limit of quantification (LOQ) and matrix effect (ME) of 15 target compounds (Linear range: 0.01-1 mg/L )

2.5 方法確證

2.5.1 靈敏度和線性范圍 按本研究建立的前處理方法及儀器測定方法對牛生乳中15 種目標物的線性關系、正確度、精密度、檢出限 (LOD) 和定量限(LOQ)進行了考察。結果 (表3) 表明：15 種目標化合物在質量濃度0.01～1 mg/L 范圍內，決定系數(shù)R2≥ 0.9954。牛生乳中15 種目標化合物的方法LOQ 在0.001～0.01 mg/kg 之間，LOD 在0.0003～0.003 mg/kg 之間，小于CAC[30]和澳大利亞[29]在牛生乳上建立的MRL 值。

2.5.2 正確度和精密度 結果(表4)表明：在牛生乳中添加0.01、0.1 和1 mg/kg 3 個水平的15 種目標化合物，每個水平5 個重復，平均回收率在87%～109%之間，相對標準偏差 (RSD) 在0.30%～11%之間。表明本方法正確度和精密度均可滿足農藥殘留分析的要求[37]。

表4 15 種目標化合物在牛生乳中的添加平均回收率和相對標準偏差Table 4 The average recoveries and relative standard deviations (RSD) of 15 target compounds in raw milk

2.6 實際樣品監(jiān)測

對我國牛生乳主產區(qū) (內蒙古、新疆和寧夏)進行抽檢，每地采樣10 份，共30 份樣本。檢測結果表明：有22 份樣品中僅檢出乙螨唑1 種農藥殘留，最大為0.0036 mg/kg，其余14 種目標化合物均未檢出。

3 結論

本研究對牛生乳中12 種農藥及其3 種代謝物的檢測方法基于QuEChERS 方法，樣品經體積分數(shù)為1%的甲酸乙腈提取，NaCl 鹽析，渦旋、離心后取上清液，冷凍5 h 后過C18凈化，經HPLCMS/MS 測定。結果表明，15 種目標化合物在牛生乳中的基質效應為 -31%～11%，在0.01～1 mg/L線性范圍內，決定系數(shù) (R2) ≥0.9954，表明各目標化合物的質量濃度與其對應的色譜峰面積間呈良好的線性關系。在0.01、0.1 和1 mg/kg 添加水平下，15 種目標化合物的平均回收率在87%～109%之間，RSD 在0.30%～11%之間，LOD 為0.0003～0.003 mg/kg，LOQ 為0.001～0.01 mg/kg，滿足農藥殘留分析的要求。本方法簡單、快速、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可有效去除基質的干擾，實現(xiàn)多種目標化合物的同時快速分析。該研究結果也可為其他動物源性基質中農藥殘留分析方法的建立提供借鑒，并為我國牛生乳中12 種農藥MRL 值的建立及膳食風險評估提供參考。