張旭歡, 王阿玲, 李文奎,2, 吳 華,2, 雷 鵬,2,馮俊濤,2, 王 勇*,,2, 馬志卿,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON) 侵染所引起的土傳真菌病害，在西瓜的全生長期均可發(fā)病，其中伸蔓期至開花坐果期是感染該病的敏感期[1-2]。幼苗期染病癥狀通常表現(xiàn)為子葉及真葉失水萎蔫、褪綠壞死直至植株死亡[3]。

圖式1 檜木醇結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of hinokitiol

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器設(shè)備 JSM-6360LV 掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子株式會社)；WT5003CH 萬分之一電子天平 (常州萬泰天平儀器有限公司)；HYC-940 醫(yī)用冷藏箱 (青島海爾特種電器有限公司)；ZFD-5140 全自動新型鼓風(fēng)干燥箱 (上海智城分析儀器制造有限公司)；FE28-Standard pH 計及FE38-Standard 電導(dǎo)率儀 (梅特勒-托利多儀器 (上海) 有限公司)；1525 高效液相色譜儀 (HPLC，美國Waters 公司)；SW-CJ-2FD 超凈工作臺 (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；SPX-250 型智能生化培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠)；RSB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；MH-LC 52 中高壓制備液相一體機 (賽普瑞斯 (北京) 科技有限公司)。

1.1.2 供試病原菌和植物 西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp.niveum由陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心提供，于PDA 培養(yǎng)基上4℃保存。

供試植物：西瓜苗 (農(nóng)科大11 號)。

1.1.3 藥劑及培養(yǎng)基 95%多菌靈 (carbendazim)

原藥和97%檜木醇 (hinokitiol) 原藥，均購于百靈威科技有限公司，分別用0.1 mo/L 的鹽酸及甲醇溶解、配制為母液，備用。鐮刀菌酸 (fusaric acid，F(xiàn)A) 標準品 (純度 > 99%) 購于Sigma 公司。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉16 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH 值為7.0；PDB 培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH 值為7.0；水瓊脂培養(yǎng)基 (WA)：瓊脂粉40 g，用蒸餾水定容至1 L，取每100 mL分裝至一個錐形瓶，封口；蔡氏培養(yǎng)基 (Czapek-Dox Medium)：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀10 g，七水合硫酸鎂0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，用蒸餾水定容至1 L。培養(yǎng)基均高溫高壓滅菌后常溫保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 檜木醇對西瓜枯萎病菌的抑制活性測定

1.2.1.1 對菌絲生長的抑制活性 采用菌絲生長速率法[10]測定。將等體積不同濃度的檜木醇與加熱融化后的50 mL PDA 培養(yǎng)基混合均勻，制成檜木醇終濃度分別為質(zhì)量濃度 0、6.25、12.5、25、50 和100 μg/mL 的含藥培養(yǎng)基。以不含藥劑的培養(yǎng)基作為空白對照。每處理設(shè)3 個重復(fù)。將西瓜枯萎病菌在PDA 平板上于25℃培養(yǎng)6 d 后，用直徑5 mm 的打孔器打取菌餅，分別轉(zhuǎn)接于上述各含藥和空白PDA 培養(yǎng)皿中央，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑，根據(jù)公式 (1) 計算菌絲生長抑制率 (Im，%)。

式 (1) 中：D0為空白對照組菌落直徑，mm；Dt為藥劑處理組菌落直徑，mm。

1.2.1.2 對孢子萌發(fā)的抑制活性 采用孢子萌發(fā)法[11]測定。取10 塊直徑5 mm 的菌餅，放入含有100 mL PDB 培養(yǎng)液的錐形瓶中，于25℃、180 r/min 下?lián)u床培養(yǎng)6 d 后，用雙層滅菌紗布過濾，將濾液在157g下離心5 min，用無菌水重懸，制得孢子懸浮液。將WA 培養(yǎng)基融化，加入一定濃度的檜木醇藥液搖勻，制成檜木醇終濃度分別為質(zhì)量濃度0、6.25、12.5、25、50 和100 μg/mL 的含藥培養(yǎng)基，以不含藥劑的WA 平板為空白對照。用無菌水稀釋上述孢子懸浮液，配制成在40 倍鏡下每視野20 個孢子左右的菌懸液，吸取100 μL 菌懸液于不同濃度含藥及空白對照WA 平板上并涂布均勻，每處理3 個重復(fù)。將各處理WA 平板密封后置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，12 h 時取出，置于高倍鏡 (1000 倍) 下觀察孢子萌發(fā)情況：若芽管長度大于孢子短半徑即視為萌發(fā)，反之則為未萌發(fā)。每皿觀察3 個視野，每次觀察不少于100 個孢子，結(jié)果取平均值。依據(jù)公式 (2) 計算孢子萌發(fā)抑制率 (Is，%)。

式 (2) 中：S0為空白對照組孢子萌發(fā)率；St為藥劑處理組孢子萌發(fā)率。

上述試驗數(shù)據(jù)均采用DPS 標準統(tǒng)計軟件進行處理，獲得毒力回歸方程及有效抑制中濃度(EC50) 值。

1.2.2 檜木醇對西瓜枯萎病的盆栽防治效果測定 將催芽萌發(fā)的西瓜種子移至育苗盤中進行壯苗后，選取長勢健壯的幼苗移栽至塑料盆中，基質(zhì)為常規(guī)的育苗基質(zhì)。待培養(yǎng)至兩葉一心期時，采用傷根法進行接種，每株澆灌10 mL 孢子懸浮液 (1 ×105/mL)，并將其移至人工氣候箱中，在相對濕度90%、溫度28 ℃、光照時間12 h/d 的條件下培養(yǎng)。將檜木醇用甲醇稀釋，配制成有效成分質(zhì)量濃度分別為250、500 和1000 μg/mL，并設(shè)有效成分質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的多菌靈陽性對照及清水空白對照。接種病原菌24 h后，每株分別澆灌10 mL 檜木醇、多菌靈藥液或清水。每處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)10 株，隨機區(qū)組排列，于施藥后14 d 調(diào)查發(fā)病情況。

采用分級計數(shù)法進行病害調(diào)查，參照文獻方法，將西瓜枯萎病害分為以下5 級[12]：0 級，植株無發(fā)病癥狀；1 級，1 片或2 片子葉輕微發(fā)黃，但生長正常；2 級，植株葉片出現(xiàn)黃化，子葉和葉片出現(xiàn)萎蔫；3 級，植株中等發(fā)病，葉片出現(xiàn)中等萎蔫；4 級，植株葉片萎蔫，但未枯死；5 級，植株枯死。病情指數(shù)及防治效果分別采用公式 (3) 和(4)[12]計算。

式 (3) 中：R為病情指數(shù)；Ni為i病級對應(yīng)的病株數(shù)；i為病級數(shù)；N為調(diào)查總株數(shù)。

式 (4) 中：P為防治效果，%；R0為空白對照區(qū)病情指數(shù)；Rt為藥劑處理區(qū)病情指數(shù)。

1.2.3 西瓜枯萎病菌生理生化指標測定

1.2.3.1 相對電導(dǎo)率測定 將培養(yǎng)6 d 的西瓜枯萎病菌菌株沿菌落邊緣打取10 個菌餅，放入100 mL PDB 培養(yǎng)基中，于25℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)6 d；用雙層紗布過濾收集菌絲，并用滅菌水沖洗2 次，取0.5 g 收集的菌絲樣品分別懸浮于含有0 和EC50濃度檜木醇的25 mL 滅菌水中；分別在0、30、60、90、120、150、180、210 和240 min時測定各處理菌懸液電導(dǎo)率，并在240 min 后煮沸菌絲5 min，測定最終電導(dǎo)率。每個處理設(shè)3 個重復(fù)，按照文獻方法計算菌絲的相對電導(dǎo)率[13]。

1.2.3.2 鐮刀菌酸含量測定 將西瓜枯萎病菌菌餅轉(zhuǎn)接到含有100 mL 蔡氏培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，每瓶10 個菌餅，于25℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)6 d。分別添加不同濃度 (0、EC50、EC70、EC90) 的檜木醇后繼續(xù)搖床培養(yǎng)8 d，得到混懸液。將混懸液于2683g離心10 min，取上清液，用2 mol/L HCl 溶液調(diào)pH 值至2.5，以相同體積的色譜級乙酸乙酯萃取3 次，合并有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥；殘留物用5 mL 色譜級甲醇溶解，即得到粗毒素樣品。

采用HPLC 方法測定鐮刀菌酸毒素的含量。流動相V(乙腈)∶V(0.4% H3PO4) = 30∶70，柱溫40℃，流速1 mL/min，紫外檢測器波長280 nm，進樣量10 μL，出峰時間約為5 min。所有樣品進樣前均通過0.45 μm 的過濾器過濾除去雜質(zhì)。鐮刀菌酸標準品用色譜級甲醇溶解，并分別稀釋配制成500、200、100、50、25 及12.5 μg/mL 質(zhì)量濃度梯度，樣品出峰時間與標準品對應(yīng)。以得到的毒素吸收峰面積作為響應(yīng)值，通過對比標準品的峰面積，計算得到樣品中鐮刀菌酸毒素的含量[14]。

1.2.4 菌絲形態(tài)觀察 將西瓜枯萎病菌菌餅分別轉(zhuǎn)接至含有EC50濃度檜木醇 (處理組) 和不含檜木醇 (空白對照組) 的PDA 培養(yǎng)皿中，于25 ℃下培養(yǎng)5 d。于上述菌落邊緣切下10 mm × 10 mm 的菌絲塊，置于2.5% 戊二醛溶液中固定過夜。然后用PBS 緩沖液漂洗，再經(jīng)過梯度濃度的乙醇脫水、CO2臨界點干燥、乙酸異戊酯和噴金處理后，在掃描電子顯微鏡下觀察各組的菌絲形態(tài)，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 檜木醇對西瓜枯萎病菌的抑制活性

菌絲生長速率法測定結(jié)果 (表1 和圖1) 表明：在檜木醇質(zhì)量濃度為6.25～100 μg/mL 時，西瓜枯萎病菌菌絲生長均受到抑制，且隨藥劑質(zhì)量濃度增加，抑制效果增強，100 μg/mL 時抑制率達到89.9%。其EC50值為31.1 μg/mL。

圖1 檜木醇對西瓜枯萎病菌菌絲生長的影響Fig.1 The effect of hinokitiol on mycelial growth of F. oxysporum f.sp.niveum

表1 檜木醇對西瓜枯萎病菌的抑制作用Table 1 The virulence of hinokitiol to Fusarium oxysporum f.sp.niveum

孢子萌發(fā)法測定結(jié)果 (表1 和圖2) 表明：在檜木醇質(zhì)量濃度為6.25～100 μg/mL 時，西瓜枯萎病菌的孢子萌發(fā)均受到抑制，相應(yīng)EC50值為45.2 μg/mL。

圖2 檜木醇對西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.2 The effect of hinokitiol on spore germination of F. oxysporum f.sp.niveum

2.2 檜木醇對西瓜枯萎病的盆栽防治效果

結(jié)果 (表2) 表明：500 和1000 μg/mL 兩個測試質(zhì)量濃度下，檜木醇對西瓜枯萎病均有顯著的防治效果。其中，當(dāng)檜木醇質(zhì)量濃度為1000 μg/mL時，防效與多菌靈500 μg/mL 處理無顯著差異。

表2 檜木醇對西瓜枯萎病的盆栽防效Table 2 The control efficacy of hinokitiol to watermelon fusarium wilt in pots

2.3 檜木醇對西瓜枯萎病菌生理生化指標的影響

2.3.1 對細胞膜通透性的影響 測定結(jié)果 (圖3A)

圖3 檜木醇對西瓜枯萎病菌電導(dǎo)率及鐮刀菌酸含量的影響Fig.3 The relative conductivity and fusaric acid content in F. oxysporum f.sp.niveum treated with hinokitiol

表明：隨時間延長，對照組和處理組菌絲的相對電導(dǎo)率均逐漸升高，且檜木醇處理組相對電導(dǎo)率均高于對照組，表明檜木醇可以破壞病原菌細胞膜的完整性，增大其細胞膜的通透性。

2.3.2 對鐮刀菌酸含量的影響 測定結(jié)果 (圖3B)顯示：不同濃度檜木醇處理組西瓜枯萎病菌菌絲中鐮刀菌酸含量均顯著低于對照組，且具有劑量效應(yīng)，即隨著藥劑質(zhì)量濃度增加，鐮刀菌酸含量顯著降低。說明檜木醇可影響鐮刀菌酸的代謝過程，明顯抑制了西瓜枯萎病菌鐮刀菌酸的生物合成或促進了其降解。

2.4 檜木醇對西瓜枯萎病菌菌絲形態(tài)的影響

通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，檜木醇對西瓜枯萎病菌菌絲形態(tài)有明顯影響：對照組菌絲呈舒展、分散、較為均勻的生長狀態(tài) (圖4A、4B、4C)，而檜木醇處理后菌絲呈現(xiàn)變形、扭曲、纏繞、成團生長等不規(guī)則形態(tài) (圖4D、4E、4F)。

3 討論與結(jié)論

枯萎病是限制西瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸，該病害不僅造成西瓜嚴重減產(chǎn)，更重要的是會導(dǎo)致西瓜品質(zhì)下降[2,15-17]。由于缺乏較好的抗病品種，目前對西瓜枯萎病的田間防治仍主要以施用化學(xué)藥劑為主，但因其病原體可在土壤中長期生存、積累且進化迅速，化學(xué)藥劑防控效果通常并不理想，使得對該病的有效防治變得十分困難[18-20]。

Amini 等[21]報道，咪鮮胺 (prochloraz)、糠菌唑 (bromuconazole)、苯菌靈 (benomyl) 和多菌靈(carbendazim) 能顯著抑制尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum菌絲生長；Chung 等[22]發(fā)現(xiàn)，由于耐藥性的差異，不同的尖孢鐮刀菌分離株對苯菌靈、甲基硫菌素 (thiophanate-methyl)、多菌靈和噻菌靈(thiabendazole) 的敏感性各不相同；Reid 等[23]在溫室中評估了苯菌靈、咯菌腈 (fludioxonil) 和噻菌靈對西瓜枯萎病的盆栽防效，發(fā)現(xiàn)與對照相比，3 種殺菌劑都降低了植株的死亡率。近年來隨著綠色健康農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，生物農(nóng)藥特別是植物源農(nóng)藥受到社會廣泛關(guān)注。檜木醇具有超強的滲透力和吸附性，施入土壤后，可迅速滲透聚集到作物根部形成保護膜，因而在土傳病害防治方面表現(xiàn)突出。多年的田間試驗表明，檜木醇對由土傳病原菌引起的立枯、青枯、根腐及軟腐等病害的防治效果均較突出，被稱為“植物癌癥克星”[9,24-26]。

由于檜木醇突出的抗菌、抗病毒和抗腫瘤活性，其作用機制也受到廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，檜木醇可通過誘導(dǎo)特定基因發(fā)生時間特異性差異表達 (如P53基因的上調(diào)，BMI1基因和M D R 1基因的下調(diào))、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK) 途徑或誘導(dǎo)活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生而激活細胞內(nèi)在的凋亡通路[27-29]或細胞自噬通路[30-32]；通過抑制蛋白酶的活性或增強細胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性，最終誘導(dǎo)細胞死亡[33-35]；通過調(diào)節(jié)表觀修飾，如DNA 甲基化以及組蛋白去乙?；榷T導(dǎo)細胞凋亡[36-38]；還可以調(diào)控與生物膜發(fā)育相關(guān)的特定基因的表達水平，抑制細胞膜的代謝，調(diào)控細胞膜的通透性，抑制呼吸作用等而促使細胞死亡[39-41]；此外，檜木醇還可通過其羥基酮部分結(jié)合細胞內(nèi)的Fe3+，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I 和II 的活性[42]，推測檜木醇可能誘發(fā)了一種新的死亡機制——鐵死亡[43-45]。因此，檜木醇可能存在多種誘導(dǎo)細胞死亡的途徑。

本研究通過離體及活體試驗，測定了植物源天然產(chǎn)物檜木醇對西瓜枯萎病菌的抑制活性及對西瓜枯萎病的盆栽防效。結(jié)果表明，檜木醇對西瓜枯萎病菌的抑制效果明顯，其對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50值分別為31.1 和45.2 μg/mL；在1000 μg/mL 時，檜木醇對西瓜枯萎病菌的防效為75.2%，與對照藥劑多菌靈500 μg/mL 的防效相當(dāng)。表明檜木醇對西瓜枯萎病菌具有較強的抑制活性，可考慮作為潛在替代藥劑用于防治西瓜枯萎病。

細胞膜的完整性對于細胞和菌絲的生長具有重要意義，其在維持細胞形態(tài)、傳遞信息和與外界進行物質(zhì)交換等過程中均起到重要作用[46-48]。本研究表明，檜木醇可明顯影響病原菌菌絲體的正常生長，破壞細胞膜的完整性，使得其通透性發(fā)生改變，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，相對電導(dǎo)率升高，這與用檜木醇處理灰霉病菌和炭疽病菌[49]的研究結(jié)果一致。表明檜木醇對西瓜枯萎病菌的作用機制可能歸因于其破壞細胞膜的能力，使細胞內(nèi)容物滲漏，破壞滲透平衡，最終導(dǎo)致病原菌細胞死亡。鐮刀菌酸是由西瓜枯萎病菌產(chǎn)生的一種毒力因子，在病原菌致病及癥狀發(fā)展過程中起到主導(dǎo)作用[50-52]。經(jīng)檜木醇處理后，病原菌體內(nèi)鐮刀菌酸含量顯著下降，表明檜木醇能夠顯著抑制鐮刀菌酸的生物合成或促進其降解，改變鐮刀菌酸的代謝過程以降低病原菌的致病力。

綜上所述，檜木醇不僅能顯著抑制西瓜枯萎病菌菌絲的生長及孢子萌發(fā)，更重要的是能夠明顯抑制其致病因子鐮刀菌酸的產(chǎn)生，具有抑菌與“降毒”雙重功效。檜木醇的主要作用機制可能是通過破壞病原菌細胞膜的完整性、干擾病原菌次生代謝物的合成而最終發(fā)揮抑菌作用，但其具體的抑菌分子靶標仍值得深入研究。本研究表明，檜木醇作為植物源天然產(chǎn)物，具有開發(fā)為植物源殺菌劑用于防治西瓜枯萎病的巨大潛力。