張麗欣，梁旭方，武佳琪

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/鱖魚研究中心，湖北 武漢 430070）

Fos基因家族由c-fos、fosb、fosl1、fosl2等4 個成員組成。早期基因c-fos被第二信使誘導(dǎo)激活，作為第三信使接收信號，參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老、衰老相關(guān)分泌表型（SASP）、FCERI 介導(dǎo)的MAPK 激活、AP-1 轉(zhuǎn)錄因子家族的激活[1]和白細(xì)胞介素-4 和白細(xì)胞介素-13 信號傳導(dǎo)等信號通路，屬于原癌基因家族中的一員，在細(xì)胞生長、分化和信息傳導(dǎo)中有重要作用[2]，在學(xué)習(xí)記憶[3-4]、牙齒和骨骼異常[5]、免疫[6]等方面發(fā)揮重要功能。大鼠（Rattus norνegic）水迷宮空間訓(xùn)練研究發(fā)現(xiàn)，在大腦區(qū)域c-fos免疫反應(yīng)神經(jīng)元核數(shù)量的增加與空間訓(xùn)練有關(guān)[7]。大鼠莫里斯迷宮位置導(dǎo)航和空間探測試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8 周游泳訓(xùn)練，大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高，c-fosmRNA 表達(dá)上調(diào)17%[8]。果蠅（Drosophila melanogaster）通過反復(fù)同時暴露于氣味和電擊來形成厭惡嗅覺關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)果蠅中的長期記憶印跡細(xì)胞是通過細(xì)胞自主ERK 依賴性c-fos/CREB 循環(huán)建立的[9]。

目前，在魚類中只在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）腦中鑒定c-fos相關(guān)基因并對該基因進(jìn)行神經(jīng)激活誘導(dǎo)，從虹鱒大腦中分離出兩個部分cDNA克?。≧T-fos1和RT-fos2），它們編碼與高等脊椎動物的C-FOS 蛋白同源的蛋白質(zhì)[10]。另外，c-fos基因序列已在其他五種魚類基因組中鑒定出兩個同源序列fosaa與fosab。

翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）為中國一類重要的經(jīng)濟(jì)淡水魚。底棲生長的翹嘴鱖僅攝食活餌料魚，拒絕攝食人工飼料與死餌[11-12]，在人工養(yǎng)殖過程中，馴化[13]變得尤為重要。鑒于c-fos在學(xué)習(xí)記憶方面的重要作用，研究早期基因c-fos在翹嘴鱖中的學(xué)習(xí)記憶功能有助于攻克這一難題。梁慧等[14]克隆了翹嘴鱖fosaa，發(fā)現(xiàn)翹嘴鱖基因fosaa的表達(dá)影響了食欲相關(guān)基因pomc和npy的表達(dá)，可能參與了其攝食調(diào)控[14]。翹嘴鱖在死餌料魚馴食實驗（學(xué)習(xí)組）中，與活餌料魚組相比，fosabmRNA 表達(dá)量顯著上升[15]。本研究克隆翹嘴鱖fosab基因亞型的編碼區(qū)，分析fosaa、fosab的分子特征，以及兩個亞型在不同組織及投喂飼料不同時期腦中mRNA 表達(dá)量，為c-fos學(xué)習(xí)記憶功能研究提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用健康翹嘴鱖成魚（180 g ± 10 g）及幼魚（20～30 g）取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心，取成魚腦、眼、鰓、肝、胃、腸、脾、腎、心、鰾、精巢、腸系膜脂肪、肌肉和皮膚14 個組織；幼魚經(jīng)過馴化[13]成功攝食飼料，馴化流程如表1 所示，每天9:00、17:30 飽食投喂飼料，選取飼料馴食7 d（短期組）和56 d（長期組）的翹嘴鱖（每組6 尾魚），取其腦于液氮暫存，保存在-80 ℃下備用。使用Trizol（TaKaRa,Tokyo,Japan）法提取各組織總RNA。用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行cDNA合成，保存在-20 ℃待用。

表1 馴食人工飼料技術(shù)流程Table 1 Domestication process of artificial feeding

1.2 翹嘴鱖fosaa、fosab基因序列分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、翹嘴鱖全基因組數(shù)據(jù)庫（http://genomes.igb-berlin.de/）中獲取翹嘴鱖fosaa與fosab全基因組和氨基酸序列。利用Gene Structure Display Server 2.0 在線工具繪制蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。使用在線網(wǎng)站NPSA-PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/），輸入翹嘴鱖fosaa和fosab基因的fasta 格式氨基酸序列，預(yù)測翹嘴鱖FOSAA和FOSAB蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)。

1.3 翹嘴鱖fosab基因克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析

用Primer Premier 6.0 軟件根據(jù)fosab編碼區(qū)設(shè)計引物（表2），PCR 擴(kuò)增翹嘴鱖fosab基因的開放閱讀框（ORF）區(qū)，將片段大小正確的PCR 產(chǎn)物送到擎科公司（北京擎科生物科技有限公司）測序驗證。利用MEGA 5.0 軟件對魚類和高等脊椎動物中fosaa、fosab亞基進(jìn)行多重比對，構(gòu)建fosaa、fosab的系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用NJ 分析法得到類似的樹形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，節(jié)點(diǎn)值表示從1 000 次復(fù)制中獲得可信度百分比。利用Megaline 軟件進(jìn)行蛋白序列比對，對fosaa、fosab同線性分析。

表2 所用PCR引物Table 2 PCR primers information

1.4 實時熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析

利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計翹嘴鱖fosaa、fosab基因特異性引物（表2），以rpl13a為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR 檢測fosaa、fosab基因在健康成魚各組織以及馴化后幼魚腦中的表達(dá)，每組樣品重復(fù)3 次。擴(kuò)增反應(yīng)程序為95 °C 3 min；95 °C 30 s，退火30 s，退火溫度見表1，共39個循環(huán)。采用單因素方差分析實時熒光定量結(jié)果。

用SPSS Statistics 24.0 軟件對fosaa、fosab基因的相對表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗，數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，當(dāng)P＜0.05時，差異顯著；當(dāng)P＜0.01時，差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 翹嘴鱖fosaa和fosab序列分析

經(jīng)克隆并測序驗證獲得fosab的基因編碼區(qū)序列，通過數(shù)據(jù)庫基因組序列得到fosab基因全長2 498 bp，ORF 區(qū)的長度1 152 bp；根據(jù)翹嘴鱖全基因組數(shù)據(jù)庫，fosaa基因全長2 871 bp，ORF 區(qū)的長度1 143 bp；fosaa、fosab均有四段外顯子（圖1），DNA 序列相似性40.4%?；騠osaa和fosab均定位于翹嘴鱖第16號染色體上，翹嘴鱖FOSAA蛋白含α螺旋34.83%，β 折疊0.79%，無規(guī)則卷曲55.15%，F(xiàn)OSAB 蛋白含α 螺旋24.80%，β 折疊0.52%，無規(guī)則卷曲63.71%。翹嘴鱖FOSAA 和FOSAB 蛋白bZIP結(jié)構(gòu)域分別位于126～191 bp 和127～192 bp。翹嘴鱖FOSAA 和FOSAB 蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)見圖2、3。

圖1 翹嘴鱖fosaa和fosab基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of gene fosaa and fosab in Siniperca chuatsi

圖2 翹嘴鱖FOSAA、FOSAB蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of protein FOSAA and FOSAB in Siniperca chuatsi

圖3 翹嘴鱖FOSAA、FOSAB蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of protein FOSAA and FOSAB in Siniperca chuatsi

2.2 翹嘴鱖FOSAA和FOSAB進(jìn)化分析

圖4 可見，翹嘴鱖fosaa和fosab基因與大黃魚（Larimichthys crocea）聚在一起，再與底鳉（Fundulus heteroclitu）、青鳉（Oryzias latipes）聚為一支，最后與其他魚類匯聚，這與脊椎動物分類地位一致。翹嘴鱖FOSAB與哺乳動物C-FOS親緣關(guān)系比與FOSAA關(guān)系更近，魚類的FOSAA 單獨(dú)聚為一支。c-fos基因在親緣關(guān)系排序中，哺乳動物與鳥類、兩棲類、魚類的親緣關(guān)系越來越遠(yuǎn)，可用于物種進(jìn)化辨別基因。c-fos基因在智人、鼠、黑猩猩（Pan troglodytes）、牛（Bos taurus）、綿羊（Oνis aries）、原雞（Gallus gallus）和熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）中相對保守。序列相似性分析（表3）表明，翹嘴鱖FOSAB 與魚類以外其他物種C-FOS 序列相似性在60%左右，而FOSAA 基因與魚類以外其他物種C-FOS 序列相似性在45%左右。翹嘴鱖FOSAB 進(jìn)化比FOSAA 更保守，其FOSAA 與FOSAB 蛋白序列相似性為46.0%（表3），與圖4 結(jié)果一致。同線性分析（圖5）表明，翹嘴鱖C-FOS處于tmed10和jdp基因之間，與其他魚類相似。所選三種魚類中fosab基因與智人等動物的c-fos在FOS 左側(cè)均有tmed10，而三種魚類中fosaa基因與人等動物的c-fos基因在FOS 右側(cè)均有jdp，在魚類中c-fos進(jìn)化相對保守。

圖4 翹嘴鱖與其他魚類、哺乳動物、鳥類、兩棲動物C-FOS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of C-FOS in Siniperca chuatsi and other fishes,mammals,birds and amphibians

圖5 翹嘴鱖與其他魚類、哺乳動物、鳥類、兩棲動物c-fos同線性Fig.5 Gene c-fos of Siniperca chuatsi is linear with that of other fishes,mammals,birds,and amphibians

表3 翹嘴鱖C-FOS 氨基酸序列與其他魚類、哺乳動物、鳥類、兩棲動物的相似性Table 3 Amino acid sequence similarity of C-FOS between Siniperca chuatsi and other fishes,mammals,birds,amphibians

2.3 翹嘴鱖fosaa與fosab健康組織表達(dá)

圖6 表明，fosaa和fosab基因在健康翹嘴鱖不同組織中的表達(dá)模式不同，fosaa和fosab基因在腦和皮膚中均有較高的表達(dá)量，其中fosaa在腦中表達(dá)量最高，fosab在皮膚中相對表達(dá)量最高。翹嘴鱖fosaa基因在鰾、鰓、肝、肌肉和脂肪中表達(dá)量極低或者不表達(dá)，fosab基因在鰾、心和脂肪中相對表達(dá)量極低或無。

圖6 翹嘴鱖fosaa和fosab基因的組織表達(dá)Fig.6 Tissue expression of fosaa and fosab genes in Siniperca chuatsi

2.4 翹嘴鱖投喂飼料后fosaa 和fosab mRNA 表達(dá)水平

圖7 顯示，翹嘴鱖投喂飼料56 d 時，fosaa基因表達(dá)量比7 d時顯著升高（P ＜0.05），而fosab基因相對表達(dá)量在飼料投喂7、56 d 時無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 翹嘴鱖投喂飼料后fosaa和fosab基因相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of fosaa and fosab genes in Siniperca chuatsi after feed domestication

3 討論

3.1 翹嘴鱖fosaa和fosab基因生物信息學(xué)分析

本研究表明，翹嘴鱖fosaa與fosab基因序列差異較大，fosaaDNA 序列及氨基酸序列與fosab的相似性均低于50%。翹嘴鱖FOSAB 與魚類以外其他物種C-FOS 序列相似性在60%左右，而其FOSAA與魚類以外其他物種C-FOS 序列相似性在45%左右，其FOSAB 進(jìn)化比FOSAA 更保守。斑馬魚（Danio rerio）C-FOS同源物中保護(hù)率最高的區(qū)域是bZIP 結(jié)構(gòu)域，而FOSAB 的C-DEST 區(qū)域比FOSAA更保守[15]，與本研究結(jié)果一致。進(jìn)化分析表明，翹嘴鱖fosaa和fosab基因與其他魚類匯聚為一分支，這與其他脊椎動物分類地位一致。翹嘴鱖FOSAB 蛋白與哺乳動物、鳥類和兩棲類中C-FOS 親緣關(guān)系比與FOSAA關(guān)系更近，其fosab基因可能與哺乳動物、鳥類和兩棲類的功能更為相似。在斑馬魚FOS 分支中，c-FOS、FOSB 和FOSL2 蛋白有一個明顯的亞分支，c-FOS 旁系fosaa與fosab相比差異甚大[16]。相同基因的不同亞型可能發(fā)揮著不同的功能，翹嘴鱖fosaa基因和fosab基因可能發(fā)揮不同功能。

3.2 翹嘴鱖fosaa和fosab基因健康組織表達(dá)

基因在不同組織中的表達(dá)模式是探究基因功能的基本手段之一[17]。本研究表明，翹嘴鱖fosaa和fosab基因在腦和皮膚中表達(dá)量均較高，斑馬魚中有相同結(jié)果[16]，翹嘴鱖fosaa與fosab在眼、腎、脾、胃、腸均有中等表達(dá)水平，在鰾和脂肪中表達(dá)量均較低，與斑馬魚fosaa和fosab基因在腎、眼有中等表達(dá)量的結(jié)果一致[16]，其中fosaa在腦中表達(dá)含量最高，fosab在皮膚中相對表達(dá)量最高。這可能與c-fos調(diào)節(jié)多種不同類型細(xì)胞對刺激的反應(yīng)，并參與細(xì)胞對表皮生長因子及神經(jīng)生長因子的反應(yīng)[18-19]有關(guān)。fosaa和fosab在翹嘴鱖眼中均有表達(dá)，可能與視網(wǎng)膜等組織功能相關(guān)，c-fos+/+和c-fos-/-小鼠的視網(wǎng)膜在強(qiáng)光照射（15 000 lx,2 h）長達(dá)10 d 后，在c-fos-/-小鼠中，視桿不受影響，僅在c-fos+/+小鼠中觀察到桿中的線粒體損傷，c-fos控制光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光感受器凋亡[20-21]。另外，翹嘴鱖c-fos基因在心和腎組織中的中等表達(dá)水平可能與心臟[22]和腎臟[23]等疾病有關(guān)。

3.3 翹嘴鱖投喂飼料馴化后fosaa 和fosab mRNA腦中表達(dá)水平

本研究表明，fosaa基因在短期（7 d）、長期（56 d）投喂飼料的翹嘴鱖腦中表達(dá)量有差異，在長期投喂組顯著升高，是短期組的1.6 倍，而短期、長期飼料投喂組間fosab表達(dá)量均無顯著差異。雛雞在記憶檢索訓(xùn)練結(jié)束后1和24 h觸發(fā)了大腦中c-fos大量表達(dá)[24]，大鼠在學(xué)習(xí)社會傳播食物偏好（STFP）實驗中，短期記憶測試均表現(xiàn)出對實驗所選食物的顯著偏好；在長期記憶測試中，注入c-fos反義寡脫氧核苷酸的大鼠對實驗所選食物沒有偏好，而注入c-fos寡脫氧核苷酸或鹽水的大鼠則保持偏好，表明c-fos寡脫氧核苷酸對于鞏固非空間海馬依賴性記憶是必要的[25]。通過社會學(xué)習(xí)，翹嘴鱖c-fos、mch基因表達(dá)量升高，pomc基因表達(dá)量降低，CaMKII-c-fospomc可促進(jìn)鱖食性從攝食活魚轉(zhuǎn)變?yōu)閿z食死魚，進(jìn)而獲得新的進(jìn)食習(xí)慣，并大大提高食物攝入比率[15,26]。綜上可見，翹嘴鱖fosaa與fosab基因在學(xué)習(xí)記憶中可能發(fā)揮不同功能，學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因fosaa可能在馴食中發(fā)揮著更重要作用。

4 結(jié)論

1）本研究克隆翹嘴鱖fosab基因，通過進(jìn)化樹分析和蛋白同源性比對發(fā)現(xiàn)，翹嘴鱖fosaa和fosab基因分屬進(jìn)化樹不同枝，差異較大，相同基因不同亞型的功能不盡相同。

2）翹嘴鱖fosaa和fosab基因在不同組織中表達(dá)不同，兩者在腦和皮膚中表達(dá)量均較高，在鰾和脂肪中表達(dá)量均很弱，在眼、腎、脾、胃、腸均有中等表達(dá)水平。

3）對翹嘴鱖投喂飼料馴化后，二基因在短期、長期馴化組腦中fosaa和fosabmRNA 表達(dá)水平不同，fosaa基因在長期組表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），翹嘴鱖學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因fosaa在馴食中發(fā)揮著更重要作用。