丁鑫,顧悅,王逸凡,申宇航,張宇翔,郭登洲,3*

(1.河北中醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院,河北 石家莊 050200;2.河北醫(yī)科大學(xué) 第三醫(yī)院 消化內(nèi)科,河北 石家莊 050000;3.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院∥河北省中醫(yī)院 腎二科,河北 石家莊 050011)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥,約50%會引起終末期腎臟衰竭［1］。本病常見病理特征為系膜基質(zhì)增生、腎小球硬化及間質(zhì)纖維化［2］,臨床主要表現(xiàn)為連續(xù)蛋白尿和腎小球濾過率下降［3］。其發(fā)病機制較為復(fù)雜,涉及遺傳、免疫、氧化應(yīng)激等多種機制(圖1)。其中,高糖狀態(tài)誘導(dǎo)足細(xì)胞有氧“糖酵解轉(zhuǎn)換”,抑制呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ的表達(dá),進(jìn)而降低線粒體生物發(fā)生在DKD發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］。線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移到氧化應(yīng)激部位。線粒體產(chǎn)生的過多ROS損傷足細(xì)胞是引起糖尿病腎病的關(guān)鍵危險因素［5］。研究表明,激活關(guān)鍵的細(xì)胞能量感受器5’-單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)能減少足細(xì)胞受損,保持腎小球濾過屏障完整［6］;AMPK可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)調(diào)節(jié)線粒體生物裂變及氧化,起到改善細(xì)胞凋亡的作用［7］,提示通過激活A(yù)MPK及PGC-1α表達(dá)可有效改善腎組織損傷,延緩DKD進(jìn)展。

當(dāng)歸補血湯源自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》,方中重用的黃芪益氣固表,當(dāng)歸補血活血?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸補血湯可調(diào)節(jié)線粒體活性,刺激線粒體生物發(fā)生,改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DKD［8］。加味當(dāng)歸補血湯(Modified Danggui Buxuetang,MDBT)在此名方基礎(chǔ)上加用了丹參、地龍二味通絡(luò)活血藥物,可在一定程度上改善微循環(huán)。已有動物實驗證實MDBT可有效抑制ROS誘導(dǎo)的腎組織氧化應(yīng)激,減少腎臟損害［9］。此外,本課題組前期研究結(jié)果亦顯示,當(dāng)歸補血湯及其加味方可通過多條途徑改善炎癥及氧化應(yīng)激,有效緩解DKD進(jìn)展［10-12］。因此,在前期研究條件下,本實驗研究MDBT對 DKD 大鼠腎臟組織病理、AMPK、PGC-1α蛋白及血清中MnSOD活性、MDA水平的影響,探討該方是否通過激活A(yù)MPK、PGC-1α表達(dá)達(dá)到緩解DKD進(jìn)展的作用。

圖1 DKD發(fā)病機制示意圖

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 動物

52只SPF級SD雄性大鼠,42～46 d齡,平均體質(zhì)量(200±20)g,購自北京維通利華實驗公司［動物合格證號:SCKZ(京)2016-0011,許可證號:SCXK(京)2016-0011］。動物飼養(yǎng)環(huán)境條件:溫度23～25 ℃,濕度50%～70%,高糖高脂及普通飼料,自由飲水。本研究已通過河北中醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審批(審批號:DWLL202206004)。

1.1.2 藥物

加味當(dāng)歸補血湯免煎顆粒劑:黃芪30 g(批號:A1069511)、當(dāng)歸6 g (批號:A1069011)、丹參10 g(批號:A1062271)、地龍10 g(批號:A1125281)購自廣東一方制藥廠;厄貝沙坦片(75 mg/片,批準(zhǔn)文號:H20030016)購自浙江華海藥業(yè)公司。

1.1.3 試劑

鏈脲佐菌素(美國Sigma,批號:V900890);蘇木素-伊紅(HE)、高碘酸希夫(PAS)、MASSON染液、4%多聚甲醛、鼠源一抗GAPDH、HRP-山羊抗兔二抗、HRP-山羊抗小鼠二抗、組化DAB顯色劑、5×蛋白還原型上樣緩沖液(武漢Servicebio,貨號分別為:G1003、G1008、G1006、G1101、GB15002、GB23303、GB25301、G1212、G2013);兔源一抗p-AMPK(美國 CST,貨號:2535);鼠源一抗PGC-1a(武漢三鷹,貨號:66369-1-Ig)。

1.1.4 儀器

病理切片機(上海徠卡,型號:RM2016);正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康,型號:Nikon Eclipse E100);掌上離心機(武漢Servicebio,型號:MS600);高速冷凍離心機 (DragonLab,型號:D3024R);酶標(biāo)儀(Rayto,型號:RT-6100);超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝,型號:JY92-11N);血糖儀(美國LifeScan,型號:One Touch)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組與給藥

普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,所有大鼠血糖及尿蛋白檢測未見異常。按隨機數(shù)字表法分為正常組(CON)8只、造模組 44只。予造模組高糖高脂飼料飼養(yǎng)6周。后禁食不禁水12 h,使用枸櫞酸鈉緩沖液溶解STZ制成濃度0.1 mmol/L的溶液,每kg大鼠一次性腹腔注射35 mg,制備DKD動物模型;CON組注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液。72 h大鼠尾靜脈血隨機血糖>16.7 mmol/L,即成功制備糖尿病模型［13］;24 h尿蛋白(24 h-UTP)>30 mg,則成功制備DKD大鼠模型［14］。其中2只大鼠造模48 h后死亡,2只血糖未達(dá)標(biāo)準(zhǔn),予以剔除。將余下40只造模大鼠隨機分為模型組(MOD)、厄貝沙坦組(IRB)、加味當(dāng)歸補血湯高劑量組(MDBTH)、加味當(dāng)歸補血湯中劑量組(MDBTM)、加味當(dāng)歸補血湯低劑量組(MDBTL),8只/組。藥物灌胃量按體表面積公式換算［10］,IRB組每kg大鼠體質(zhì)量灌胃0.017 g厄貝沙坦;MDBTL、MDBTM、MDBTH組依次為2.58、5.16、10.32 g加味當(dāng)歸補血湯藥液;CON組予等體積生理鹽水,持續(xù)20周。體質(zhì)量檢測每周1次,24 h-UTP檢測每4周1次。

1.2.2 檢測24 h-UTP水平、血清MnSOD活性及MDA水平

雙縮脲法檢測24 h-UTP水平;羥胺比色法檢測MnSOD活性;TBA法檢測MDA水平。

1.2.3 HE、PAS、MASSON染色法觀察大鼠腎組織病理改變

大鼠麻醉取出腎臟后,4% 多聚甲醛固定切取的腎皮質(zhì)48 h,脫水、石蠟包埋、切片,HE、PAS、MASSON染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腎組織病理形態(tài)改變。

1.2.4 免疫組化法(IHC)檢測大鼠腎組織p-AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)

將腎組織石蠟切片,脫蠟、水化、抗原修復(fù),置于 3% 過氧化氫溶液,室溫孵育,血清封閉,滴加PBS稀釋好的p-AMPK(Vp-AMPK∶VPBS=1∶100)、PGC-1α(VPGC-1α∶VPBS=1∶100),4 ℃過夜孵育,加HPP標(biāo)記的二抗、室溫孵育、顯色,胞核復(fù)染,脫水封片,鏡下察看采圖。結(jié)果判讀:蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色,DAB 顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。采用 Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片。

1.2.5 Western blot法檢測大鼠腎組織p-AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)

取適量各組大鼠腎組織置于離心管,提取腎組織總蛋白,采用BCA法測量已離心上清液的蛋白質(zhì)量濃度,在蛋白溶液中加入5×還原型蛋白上樣緩沖液(V蛋白溶液∶V上樣緩沖液=4∶1),沸水浴變性,SDS-PAGE電泳分離蛋白,甲醇活化2 min,轉(zhuǎn)膜30 min,PDVF 膜置于TBST孵育槽,加入脫脂牛奶,室溫封閉30 min,加入稀釋好的一抗p-AMPK(Vp-AMPK∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、PGC-1α(VPGC-1α∶V抗體稀釋液=1∶1 000),搖床4 ℃孵育過夜,回收一抗,TBST快速洗脫3次,稀釋的二抗室溫孵育30 min,加ECL溶液顯影。采用Image J軟件定量分析相應(yīng)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況比較

CON組大鼠毛色光澤,活動敏捷,攝水?dāng)z食及尿量均正常,體質(zhì)量隨周齡正常增長。造模組毛色發(fā)黃、光澤降低,部分大鼠眼球渾濁、活動遲緩、精神不振、攝水?dāng)z食及尿量明顯增多,體質(zhì)量減輕。經(jīng)藥物治療后,與MOD組比較,IRB、MDBTL、MDBTM、MDBTH組癥狀均有改善。

2.2 各組大鼠24 h-UTP水平、MnSOD 活性與MDA 水平比較

與CON組比較,MOD組大鼠的24 h-UTP、MDA水平顯著升高,MnSOD 活性顯著降低(P<0.01);與MOD組比較,MDBTH、IRB組24 h-UTP水平顯著降低(P<0.01),MDBTL、MDBTM、MDBTH、IRB組MDA水平顯著降低(P<0.05,P<0.01),MnSOD 活性顯著增加(P<0.05,P<0.01,圖2-3)。

1)與CON組比較,P<0.01;2)與 MOD組比較,P<0.01

A:MnSOD活性變化;B:MDA水平變化。1)與CON組比較,P<0.01;2)與 MOD組比較,P<0.05;3)與 MOD組比較,P<0.01

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)比較

與CON組比較,MOD組HE 染色結(jié)果顯示:腎小管和腎小囊嚴(yán)重分離,腎小球內(nèi)基底膜均勻性增厚,腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增多,腎小管刷狀緣明顯消失;PAS 染色結(jié)果顯示:基底膜均勻性增厚,腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增多,球內(nèi)糖原沉積,腎小管刷狀緣明顯消失;MASSON染色結(jié)果顯示:腎小球與腎小管間質(zhì)膠原蛋白含量異常,區(qū)域性藍(lán)染加重,伴有不規(guī)則變化,腎小球基底膜纖維增生,腎小管間質(zhì)纖維增生。與MOD組比較,MDBTL、MDBTM、MDBTH及IRB組以上病理學(xué)變化均有改善(圖4-6)。

黑色三角:腎小管和腎小囊分離;黑色箭頭:腎小管刷狀緣消失;藍(lán)色三角:腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增多;藍(lán)色箭頭:腎小球內(nèi)基底膜均勻性增厚

黑色三角:腎小球內(nèi)糖原沉積;黑色箭頭:腎小管刷狀緣明顯消失;藍(lán)色三角:腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增多;藍(lán)色箭頭:腎小球基底膜均勻性增厚

黑色箭頭:腎小管間質(zhì)纖維增生;黃色箭頭:腎小球基底膜纖維增生

2.4 各組大鼠腎組織p-AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)水平比較

IHC和Western blot法檢測結(jié)果顯示,與CON組比較,MOD組的p-AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01);與MOD組比較,MDBTL、MDBTM、MDBTH及IRB組的p-AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.05,P<0.01,圖7-8)。

A:p-AMPK蛋白表達(dá)變化;B:PGC-1α 蛋白表達(dá)變化;C:p-AMPK及PGC-1α定位表達(dá)變化的量化。1)與CON組比較,P<0.01;2)與 MOD組比較,P<0.05;3)與 MOD組比較,P<0.01

A:p-AMPK、PGC-1α 蛋白電泳條帶;B:p-AMPK及PGC-1α 蛋白表達(dá)的量化。1)與CON組比較,P<0.05;2)與CON組比較,P<0.01;3)與 MOD組比較,P<0.05;4)與 MOD組比較,P<0.01

3 討論

DKD是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥,也是慢性腎衰竭的主要病因［15］。西醫(yī)多以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷藥物調(diào)節(jié)DKD患者血壓、降低尿蛋白;以降血糖藥物控制血糖;同時通過限制蛋白飲食來延緩腎小球濾過率下降,缺乏特異性治療［16］。研究表明,氧化應(yīng)激及炎癥與DKD進(jìn)展關(guān)系密切［17］。在改善氧化應(yīng)激防治DKD方面,中醫(yī)藥展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢［10,18］。根據(jù)DKD的臨床表現(xiàn)可將其歸入中醫(yī)“腎消”“水腫”等范疇。陳剛等［19］研究發(fā)現(xiàn),DKD基本證候為氣陰兩虛兼血瘀證。本病為消渴所演變,消渴病機為陰虛燥熱,消渴病久可引起氣陰兩虛,津液耗損,致氣血運行無力,血脈瘀阻。絡(luò)脈聚合之所為腎臟,DKD病程綿延,久病入絡(luò),腎絡(luò)受損,又可進(jìn)一步加重DKD。國醫(yī)大師呂仁和教授也認(rèn)為DKD病理改變與腎絡(luò)瘀阻息息相關(guān)［20］。結(jié)合本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn),我們認(rèn)為,中醫(yī)治療DKD關(guān)鍵在于益氣活血、祛瘀通絡(luò)。

當(dāng)歸補血湯方中黃芪與當(dāng)歸的藥量比為5∶1,意在補氣血而化瘀滯。現(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸補血湯有改善免疫及纖維化的作用［21］。MDBT以此名方為基礎(chǔ)加用丹參、地龍二味藥物。黃芪甘溫為君,歸肺、脾二經(jīng),既能補氣又能利尿;當(dāng)歸辛溫甘為臣,歸脾、心、肝經(jīng),能活血補血調(diào)經(jīng);丹參苦微寒,歸心、肝、心包經(jīng),除安神外,更有通絡(luò)活血之功效,為化瘀之圣藥;地龍咸寒,歸肝、脾、膀胱經(jīng),可清熱通絡(luò)利尿;佐以丹參、地龍輔助君、臣藥活血之效,與DKD由消渴演變而來的久病必瘀中醫(yī)病機相吻合。

藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃芪成分可通過多靶點發(fā)揮抗氧化、提高免疫、緩解代謝紊亂的作用,其中槲皮素可有效緩解高糖條件下DKD的腎小球系膜細(xì)胞增生［22］。體內(nèi)外實驗也發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、保護(hù)腎臟等作用［23］;當(dāng)歸具有改善血液循環(huán)及抗氧化、抗炎、止痛的功效［24］。細(xì)胞實驗表明,丹參酮 IIA可以改善高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞焦亡及炎癥［25］;地龍可以緩解微循環(huán)、改善炎癥及氧化,從而減少腎小球系膜細(xì)胞增殖及纖維化［26］。本實驗中,MOD組大鼠腎小管和腎小囊分離,腎小球內(nèi)基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多、糖原沉積,腎小管刷狀緣明顯消失;中藥治療有效改善了腎組織病理及尿蛋白,并且療效隨劑量增加提高,表明MDBT對DKD大鼠有減少蛋白尿,保護(hù)腎功能的作用。

AMPK是關(guān)鍵的營養(yǎng)感應(yīng)激酶調(diào)節(jié)因子,低能量條件下,可以在葡萄糖攝取、脂肪酸氧化等代謝過程中被激活,也可以緩解高糖狀態(tài)下腎小球及腎小管損傷［27］。能量傳感器AMPK由催化性v亞基、調(diào)節(jié)性β亞基及靶向γ亞基構(gòu)成異源三聚體酶,其中AMPK 激活與AMPKα亞基中蘇氨酸殘基的磷酸化密切相關(guān)［28］。高糖狀態(tài)下,細(xì)胞在生成晚期糖基化終末產(chǎn)物過程中,線粒體會產(chǎn)生大量ROS,誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡［29］。PGC-1α是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可刺激線粒體生物發(fā)生和功能,并減少腎纖維化、氧化及足細(xì)胞損傷［30］。AMPK、PGC-1α活性抑制是DKD發(fā)生發(fā)展的重要病機。研究還發(fā)現(xiàn),線粒體產(chǎn)生的過多ROS可消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸從而引起糖酵解瓶頸,通過激活A(yù)MPK/PGC-1α通路可以顯著改善其引起的線粒體功能障礙、氧化從而延緩DKD進(jìn)展［31］。本實驗中,MOD組24 h-UTP、MDA水平提高,MnSOD 活性降低,PGC-1α表達(dá)減少;MDBT干預(yù)后,24 h-UTP、MDA水平明顯降低,MnSOD 活性明顯提高,p-AMPK、PGC-1α表達(dá)均增強,且呈量效對應(yīng)關(guān)系。綜上,MDBT可能通過激活A(yù)MPK、PGC-1α表達(dá),從而改善氧化應(yīng)激,進(jìn)而降低腎臟病理損害,減少蛋白尿,達(dá)到有效保護(hù)腎臟、緩解DKD進(jìn)展的作用。

作者貢獻(xiàn)聲明

丁鑫:設(shè)計實驗,統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),撰寫論文;顧悅、王逸凡、申宇航、張宇翔:提出研究思路和框架;郭登洲:提出研究思路和框架,指導(dǎo)論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。