武潔　陳彥　陶然　費文婷　王金鳳　張建軍　張悅　田世民　鄭立新　王林元

摘要 目的：以常潤茶為例研究蒽醌類物質(zhì)的加水量及浸泡次數(shù)等服用方法對有效成分溶出及通便作用的影響。方法：利用紫外分光光度法建立總蒽醌的含量測定方法，利用高效液相色譜法建立番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸的含量測定方法，考察不同浸泡次數(shù)、加水量下常潤茶水浸液中有效物質(zhì)的含量變化。利用洛哌丁胺復(fù)制便秘模型進(jìn)行通便作用的驗證并探究常潤茶對腸動力及黏液分泌的影響，觀察不同浸泡次數(shù)、加水量對小鼠小腸推進(jìn)率、首粒排黑便時間、5 h黑便粒數(shù)、糞便含水量以及結(jié)腸胃動素（MTL）、促胃液素（GAS）、生長抑素（SS）、P物質(zhì)（SP）的影響。結(jié)果：加水量與蒽醌類物質(zhì)的溶出正相關(guān)，加水60～100倍蒽醌類物質(zhì)溶出差異不大；浸泡1次可將大部分蒽醌類物質(zhì)溶出，從第2次浸泡開始，總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸的含量均明顯減小。動物實驗結(jié)果顯示加水倍數(shù)為40倍、60倍、100倍時，常潤茶均可有通便作用，未出現(xiàn)腹瀉等不良反應(yīng)，60倍、100倍水量通便作用顯著。加水100倍，反復(fù)沖泡多次通便作用不優(yōu)于浸泡1次。結(jié)論：本實驗為產(chǎn)品的精準(zhǔn)應(yīng)用提供實驗依據(jù)，對于規(guī)范蒽醌類產(chǎn)品具有積極意義。

關(guān)鍵詞 常潤茶；通便；蒽醌；高效液相色譜法；紫外分光光度法；番瀉苷A；番瀉苷B；大黃酸

Effect of Taking Methods of Besunyen Detox Tea on Dissolution of Anthraquinones and Laxation

WU Jie1，CHEN Yan1，TAO Ran1，F(xiàn)EI Wenting1，WANG Jinfeng1，ZHANG Jianjun2，ZHANG Yue3，Tian Shimin3，4，ZHENG Lixin3，4，WANG Linyuan1

（1 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 3 Chinese Academy of Inspection and Quarantine Comprehensive Test Center，Beijing 100123，China; 4 CAIQTEST（Beijing） Co.，Ltd.，Beijing 100176，China）

Abstract Objective：To observe the effect of taking methods of Besunyen Detox Tea（water addition and soaking times） on dissolution of anthraquinones and laxation.Methods：The content determination method of total anthraquinone was established by ultraviolet spectrophotometry（UV），and that of sennoside A，sennoside B and rhein was established by high-performance liquid chromatography（HPLC），to investigate the content variation of effective substances in Besunyen Detox Tea under different soaking times and water addition.The constipation model was constructed by loperamide to verify the laxative effect of Besunyen Detox Tea and explore its effect on intestinal motility and mucus secretion.The influence of different soaking times and water addition on propulsion rate of mouse small intestine，first melena time，melena times within 5 h，fecal water content，and colon motilin（MTL），gastrin（GAS），somatostatin（SS） and substance（SP） was also investigated.Results：Water addition was proportional to the dissolution of anthraquinones，and there was little difference in the dissolution of anthraquinones when the water addition was 60～100 times.Most anthraquinones were dissolved by soaking once，and from the second soaking，the contents of total anthraquinone，sennoside A，sennoside B and rhein were decreased significantly.The animal experiments revealed that when the water addition was 40 times，60 times and 100 times，Besunyen Detox Tea produced a laxative effect，and no adverse reactions such as diarrhea occurred.The laxative effect of Besunyen Detox Tea added with water of 60 times and 100 times was obvious.Moreover，water addition of 100 times and repeated brewing failed to be better than soaking once in laxative effect.Conclusion：This experiment provided a basis for precise application of the product and had positive significance for the standardization of anthraquinone products.

Keywords Besunyen Detox Tea; Laxation; Anthraquinone; High-performance liquid chromatography（HPLC）; Ultraviolet spectrophotometry（UV）; Sennoside A; Sennoside B; Rhein

中圖分類號：R256.35文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.005

便秘是臨床常見腸道疾病，蒽醌類中藥如番瀉葉、蘆薈、決明子等由于其作用強、起效快被廣泛應(yīng)用。臨床研究與現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，長期使用蒽醌類中藥可能會造成消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的毒性，引起結(jié)直腸黑變病、藥物性肝損傷、藥物性腎損傷等不良反應(yīng)，蒽醌類物質(zhì)的安全性也引起了關(guān)注和爭議。

蒽醌類物質(zhì)既是發(fā)揮通便功能的有效成分，也是引起爭議的潛在毒性成分［1］?；诖耍狙芯恳院蟹瑸a葉、決明子等藥味的常潤茶為例，建立常潤茶水浸液中蒽醌類總成分及番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸單一成分含量測定方法，將藥學(xué)實驗與動物實驗相結(jié)合優(yōu)化服用方式，探討中藥復(fù)方蒽醌類成分與通便作用及機制的關(guān)聯(lián)，為含蒽醌類中藥復(fù)方的精準(zhǔn)應(yīng)用提供實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級4～6周齡健康雄性昆明小鼠，體質(zhì)量20～22 g，采購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0011，飼養(yǎng)于中國檢驗檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心SPF級動物房，實驗期間小鼠自由飲水，動物房室溫為20～22 ℃，相對濕度60%～70%，12 h燈照、黑暗模擬晝夜交替。實驗符合相關(guān)倫理要求（倫理審批號：2021-FD-003）。

1.1.2 藥物 常潤茶（北京澳特舒爾保健品研究公司，批號：01200703）；洛哌丁胺膠囊（西安楊森制藥有限公司，批號：LFJ8473）。

1.1.3 試劑與儀器 番瀉苷A對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）（批號：J09J12T136760）、番瀉苷B對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）（批號：Y21A11Y121808）、大黃酸對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）（批號：T06J10F92311）、1，8-二羥基蒽醌（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）（批號：M21GB149395），以上均采購自上海源葉生物科技有限公司；小鼠胃動素酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（批號：20220301-20682A）、小鼠生長抑素酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（批號：20220301-20618A）、小鼠P物質(zhì)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（批號：20220301-20732A）、小鼠促胃液素酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（批號：20220301-20684A），以上試劑盒均采購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；總蛋白定量測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20210301-95871C）；Waters高效液相色譜儀（Waters公司，美國，型號：Waters E2695型），紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號：T6新世紀(jì)型），電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：101-1AB型），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：SYG-A2-6型），電子天平（慈溪市華徐衡器實業(yè)有限公司，型號：SB5002型），精密電子天平（上海浦春計量儀器有限公司，型號：BSA224S型）等。

1.2 方法

1.2.1 總蒽醌的含量測定

1.2.1.1 對照品溶液的制備 1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱取1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg（精確至0.01 mg），置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.2 mg/mL的溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 稱取常潤茶內(nèi)容物1.0 g，置空白包裝袋中，加水100 mL，于90 ℃水浴鍋上浸提15 min，提取液置水浴鍋上蒸干，加入甲醇-鹽酸（10∶1）混合溶液25 mL，稱重，在80 ℃水浴中加熱回流30 min，放冷，甲醇補足失重，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液15 mL至分液漏斗中，加水25 mL，用二氯甲烷萃取3次（50 mL、40 mL、30 mL），合并提取液，用水洗滌3次，每次40 mL，洗至中性，棄去水洗液，二氯甲烷層移至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻。

1.2.1.3 顯色與測定 精密量取供試品溶液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加混合堿溶液稀釋并定容至刻度，混勻，作為待測液。該溶液于暗處放置30 min顯色，顯色結(jié)束后用0.45 μm微孔濾過濾，以混合堿溶液作空白對照，測定吸光度并計算總蒽醌含量。

1.2.2 番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～5 min，40%A；5～25 min，40%～45%A；25～32 min，45%～80%A；32～47 min，80%～100%A；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。檢測波長為254 nm。

1.2.2.2 溶液制備 1）供試品溶液配制：取常潤茶內(nèi)容物，混合均勻后精密稱重1.0 g，置于空白包裝袋中，加水100 mL置90 ℃水浴鍋中浸提15 min，濃縮，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。2）混合對照品溶液配制：精密稱取大黃酸對照品5.13 mg，置于50 mL容量瓶中，加0.1%NaHCO3水溶液溶解并定容至刻度，即得大黃酸對照品溶液。另精密稱取番瀉苷A 9.21 mg、番瀉苷B 6.19 mg，置于10 mL容量瓶中，精密移取4 mL大黃酸對照品溶液，0.1%NaHCO3水溶液溶解并稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。3）陰性對照品溶液配制：按照常潤茶處方比例稱取除番瀉葉、決明子之外的其他藥材，依照常潤茶制備工藝及供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。

1.2.3 不同浸泡水量對常潤茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 取出同一批次的常潤茶樣品，拆開包裝將其混勻后等分，從每一份中精密稱取1.0 g，重新封入干凈的茶包。分別用10 mL、20 mL、40 mL、60 mL、80 mL、100 mL純凈水于90 ℃水浴加熱15 min，提取1次，分別得10倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍浸泡水量的常潤茶水浸液，同一加水量平行操作2份，繼續(xù)按照上述方法制備供試品溶液，測定水浸液中總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量。

1.2.4 不同浸泡次數(shù)對常潤茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 取出同一批次的常潤茶樣品，拆開包裝后將其混勻后等分，從每一份中精密稱取1.0 g，重新封入干凈的茶包。用100 mL純凈水于90 ℃水浴加熱15 min，分別提取1次、2次、3次、4次，得不同浸泡次數(shù)的常潤茶水浸液，同一浸泡次數(shù)平行操作2份，繼續(xù)按照上述方法制備供試品溶液，測定水浸液中總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量。

1.2.5 動物實驗研究

1.2.5.1 藥物配制 不同浸泡水量常潤茶受試物的制備：取1 g樣品于常壓條件下，分別加水40 mL、60 mL、100 mL于95 ℃水浸泡15 min，提取1次，配制成濃度為0.008 3 g/mL的藥液（常潤茶規(guī)格為2.5 g/袋，2袋/d，以人體推薦10倍用量為小鼠等效劑量，人體質(zhì)量以60 kg計，小鼠日服用量為0.083 3 g/kg體質(zhì)量），分別為40倍、60倍、100倍浸泡水量的常潤茶受試液，4 ℃冷藏，備用。不同浸泡次數(shù)常潤茶受試物的制備：取1 g樣品于常壓條件下，加100 mL水（100倍浸泡水量）浸泡15 min，分別提取1次、2次、4次，將提取液合并，蒸發(fā)濃縮至一定體積，配制成濃度為0.008 3 g/mL的藥液，即得不同浸泡次數(shù)的常潤茶受試液，4 ℃冷藏，備用。洛哌丁胺混懸液的制備：將洛哌丁胺膠囊溶于水，超聲加熱使其混合均勻，分別配制成濃度為0.4 mg/mL、0.7 mg/mL的混懸液。4 ℃冷藏，用前搖勻。

1.2.5.2 分組與模型制備 雄性昆明小鼠112只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后隨機分為7組，即空白組、便秘模型組（模型組）、常潤茶40倍水量組（常40組）、常潤茶60倍水量組（常60組）、常潤茶100倍水量浸泡1次組（常100組）、常潤茶浸泡2次組（常2次組）、常潤茶浸泡4次組（常4次組），每組16只。造模方法：末次灌胃后每組隨機選擇8只小鼠禁食不禁水20 h，除空白組外各組一次性灌胃洛哌丁胺混懸液7 mg/kg，觀察小鼠首粒排黑便時間和5 h黑便粒數(shù)，剩余小鼠禁食不禁水16 h，除空白組外各組一次性灌胃洛哌丁胺混懸液4 mg/kg，空白組給蒸餾水，測定小鼠小腸推進(jìn)率及結(jié)腸胃腸激素相關(guān)指標(biāo)。灌胃體積為0.01 mL/g。

1.2.5.3 給藥方法 各給藥雄性昆明小鼠每天上午灌胃常潤茶水浸液，以常潤茶40倍水量（常40組）、常潤茶60倍水量（常60組）、常潤茶100倍水量浸泡1次（常100組）、常潤茶浸泡2次（常2次組）、常潤茶浸泡4次進(jìn)行給藥，空白組和模型組小鼠每天灌胃等體積蒸餾水，灌胃體積為0.01 mL/g，連續(xù)給藥7 d。

1.2.5.4 檢測指標(biāo)與方法 1）一般狀態(tài)觀察及小鼠體質(zhì)量：每天觀察各組小鼠皮毛色澤、自主活動及精神狀態(tài)，分別在給藥第0天、第4天、第7天上午記錄各組小鼠體質(zhì)量的變化。2）首粒排黑便時間、5 h黑便粒數(shù)：灌胃洛哌丁胺0.5 h后，空白組和模型組小鼠用墨汁灌胃，常潤茶各劑量小鼠給予含受試樣品的墨汁，從灌胃墨汁開始記錄每只動物首粒排黑便時間、5 h內(nèi)排黑便粒數(shù)，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進(jìn)食。3）小腸推進(jìn)率：灌胃洛哌丁胺后0.5 h后，各劑量小鼠分別給予含相應(yīng)受試樣品的墨汁，空白組和模型組用墨汁灌胃。25 min后摘眼球取血后立即脫頸椎處死動物，測定小腸推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率（%）=墨汁推進(jìn)長度（cm）/小腸總長度（cm）×100%。4）糞便含水量：于給藥第7天上午灌胃后將每組小鼠單獨置于飼養(yǎng)籠中，禁食禁水20 min，避開被水或者小鼠尿液浸泡的糞便，選取新鮮糞便置于離心管中，稱取糞便濕重并記錄，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，迅速取出樣品稱取干重，計算糞便含水量。糞便含水量（g）=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重。5）結(jié)腸胃腸激素指標(biāo)檢測：小鼠脫頸處死后，在結(jié)腸處取1～3 cm長的腸組織，立即液氮凍存。按組織∶生理鹽水=1∶9比例冰上勻漿，以3 000 r/min，離心半徑6 cm，低溫離心15 min，取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測胃動素（Motilin，MTL）、促胃液素（Gastrin，GAS）、生長抑素（Somatostatin，SS）、P物質(zhì)（Substance P，SP）。

1.2.5.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性采用最小顯著性差異（LSD）法進(jìn)行統(tǒng)計分析；方差不齊性采用Dunnett′s T3進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 分析與結(jié)果

2.1 總蒽醌的含量測定

2.1.1 測定波長的選擇 按照“1.2.1.2”項下方法制備樣品并按照“1.2.1.3”項下方法顯色，在400～800 nm波長范圍內(nèi)對供試品和對照品顯色后的溶液進(jìn)行掃描。見圖1。標(biāo)品溶液在（524±2）nm范圍有最大吸收波長，供試品溶液在522 nm處有最大吸收波長，混合堿液在400～800 nm范圍無干擾，最終選擇522 nm為檢測波長。

2.1.2 方法學(xué)考察 分別精密吸取1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL于25 mL容量瓶中，制備供試品并測定吸光度。以濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=0.018 4X，r=0.999 2，在0～0.016 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

制備供試品并顯色，分別于0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min進(jìn)行測定吸光度，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.81%，提示供試品在90 min內(nèi)顯色穩(wěn)定性良好。取對照品溶液，連續(xù)6次測定吸光度，RSD為0.21%，說明該檢測儀器精密度良好。稱取樣品6份，每份約1 g，制備供試品并計算總蒽醌含量?？傒祯骄繛?.48 mg/g，6份樣品含量所得RSD為2.61%，說明該方法重復(fù)性良好。取常潤茶樣品9份，稱量每份樣品500 mg，分別以1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對照品溶液并制備供試品，計算總蒽醌含量，結(jié)果顯示總蒽醌整體加樣回收率范圍在96.22%～102.06%之間，RSD小于3%。

2.2 番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量測定 分別精密吸取“1.2.2.2”項下3種溶液各10 μL，按照“1.2.2.1”項下色譜條件測定。番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸分離度良好，在3種成分對應(yīng)色譜峰附近沒有其他物質(zhì)色譜峰的干擾，說明該方法專屬性良好。見圖2。

精密量取對照品溶液各0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，分別置于2 mL容量瓶中，加0.1%NaHCO3水溶液定容。分別以番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，番瀉苷A的回歸方程分別為Y=684 483 X（r=0.999 4），在0.460 5～9.210 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。番瀉苷B的回歸方程為Y=1 430 954 X（r=0.999 6），在0.309 5～6.190 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。大黃酸的回歸方程為Y=2 003 984 X（r=0.999 7），在0.020 52～0.410 40 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密稱量樣品約1.0 g，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h測定，番瀉苷A峰面積的RSD為1.56%，番瀉苷B峰面積的RSD為1.78%，大黃酸峰面積的RSD為0.76%，供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，6次所得番瀉苷A峰面積的RSD為0.46%，番瀉苷B峰面積的RSD為0.48%，大黃酸峰面積的RSD為0.43%，該檢測儀器精密度良好。稱量樣品約1.0 g，制備樣品6份并進(jìn)行測定，番瀉苷A平均含量為4.41 mg/g，6份樣品含量的RSD為2.98%，番瀉苷B平均含量為2.49 mg/g，6份樣品含量的RSD為2.70%，大黃酸平均含量為0.23 mg/g，6份樣品含量的RSD為2.84%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。取常潤茶樣品9份，精密稱量每份樣品500 mg，分別以1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對照品溶液適量，制備樣品并進(jìn)行檢測，番瀉苷A加樣回收率范圍在96.28～101.96%之間，RSD小于3%，番瀉苷B加樣回收率范圍在96.70～102.13%之間，RSD小于3%，大黃酸加樣回收率范圍在98.13～103.42%之間，RSD小于3%。

2.3 不同浸泡水量對常潤茶中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 含量測定結(jié)果顯示，加水量與蒽醌類物質(zhì)的溶出正相關(guān)，隨著加水量的增加，總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸含量逐漸升高，加水量為40倍時，總蒽醌及番瀉苷A、B的含量曲線趨于平緩，加水量為60倍時，大黃酸的含量曲線趨于平緩。

2.4 不同浸泡次數(shù)對常潤茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 含量測定結(jié)果顯示，浸泡1次可將大部分蒽醌類物質(zhì)溶出，從第2次浸泡開始，總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸的含量均顯著減小。

2.3 動物實驗

2.3.1 一般狀態(tài)觀察及小鼠體質(zhì)量 實驗過程中小鼠未出現(xiàn)腹瀉的情況。各組之間小鼠皮毛色澤、精神狀態(tài)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。實驗第1天，各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。實驗第7天，與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與模型組比較，常2次組和常4次組體質(zhì)量顯著降低（P<0.05，P<0.05）。見圖5。

2.3.2 首粒排黑便時間、5 h黑便粒數(shù) 與空白組比較，模型組小鼠首粒排黑便時間顯著增加（P<0.001），5 h黑便粒數(shù)顯著降低（P<0.001）。與模型組比較，各常潤茶給藥組小鼠首粒排黑便時間顯著降低（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；5 h黑便粒數(shù)顯著增加（P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.01）。與常100組比較，常40組、常60組、常4次組5 h黑便粒數(shù)顯著降低（P<0.01，P<0.05，P<0.01）。見圖6。

2.3.3 小腸推進(jìn)率 與空白組比較，模型組小鼠炭末推進(jìn)距離，小腸推進(jìn)率顯著降低（P<0.001，P<0.001）。與模型組比較，各常潤茶給藥組小鼠炭末推進(jìn)距離均顯著升高（P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001）；與模型組比較，除常40組外，其余各常潤茶給藥組小鼠炭末推進(jìn)率顯著升高（P<0.05，P<0.001，P<0.001，P<0.01）。見圖7。

2.3.4 糞便含水量 與空白組比較，模型組小鼠第7天時糞便含水量降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，除常40組外其余組小鼠糞便含水量均顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.001）。與常100組比較，常4次組小鼠糞便含水量顯著升高（P<0.01）。見圖8。

2.3.5 結(jié)腸胃腸激素指標(biāo)檢測 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸MTL、GAS、SP顯著降低（P<0.05，P<0.001，P<0.001），SS顯著升高（P<0.001）。與模型組比較，除常40組外，各常潤茶給藥組MTL水平顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）；除常4次組外，各常潤茶給藥組GAS水平顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；各

常潤茶給藥組SP水平顯著升高（P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001）；各常潤茶給藥組SS水平顯著降低（P<0.01，P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001）。與常100組比較，常4次組SP水平顯著降低（P<0.05）；常2次、常4次組SS水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見圖9。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇及含量測定方法的建立 常潤茶組方君藥番瀉葉、臣藥決明子可瀉熱行滯，是常潤茶發(fā)揮潤腸通便作用的主要中藥，蒽醌類物質(zhì)是番瀉葉和決明子主要成分也是其瀉下的活性成分［2-3］。蒽醌以結(jié)合型及游離型2種形式存在，常潤茶中結(jié)合型蒽醌主要為番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷等，游離蒽醌以大黃素型蒽醌為主，包括大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、橙黃決明素等。番瀉苷A、B一般分子量較大，結(jié)構(gòu)中的葡萄糖可以保護(hù)苷元不被胃腸水解和破壞，進(jìn)入結(jié)腸后經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化為大黃酸蒽酮，發(fā)揮瀉下功效［4-6］。大黃酸生物利用度高，較為穩(wěn)定，經(jīng)腸道菌群同樣轉(zhuǎn)化為大黃酸蒽酮發(fā)揮瀉下功效［7］，研究表明大黃酸可顯著改善便秘小鼠的腸道傳輸功能，降低便秘小鼠結(jié)腸黏膜AQP3的表達(dá)，緩解便秘［8-10］。本研究選擇番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸作為指標(biāo)成分［11-13］，經(jīng)過方法學(xué)考察，專屬性強、準(zhǔn)確度高，適用于常潤茶水浸出液中蒽醌類物質(zhì)的含量測定。

3.2 浸泡水量及浸泡次數(shù)對常潤茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 根據(jù)每日用量設(shè)置加水倍數(shù)為10倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍。含量測定結(jié)果顯示，加水量與蒽醌類物質(zhì)的溶出正相關(guān)，加水倍量為60倍時，蒽醌類物質(zhì)的含量曲線趨于平緩。因此在實際服用過程中，每袋常潤茶（2.5 g/袋）用150～250 mL熱水浸泡，蒽醌類物質(zhì)溶出較穩(wěn)定。設(shè)置浸泡次數(shù)為1次、2次、3次、4次，研究浸泡次數(shù)對蒽醌類物質(zhì)溶出的影響。含量測定結(jié)果顯示，浸泡一次可將大部分蒽醌類物質(zhì)溶出，第2次、第3次、第4次蒽醌類物質(zhì)的含量均明顯降低，因此在實際服用過程中，浸泡1次即可。

3.3 便秘模型的建立及常潤茶通便作用驗證 洛哌丁胺是動物便秘模型建立中應(yīng)用最多也較為穩(wěn)定的造模藥物［14］，本研究選擇洛哌丁胺為造模藥。便秘是以排便次數(shù)減少、糞便干硬、排便費力等為主要表現(xiàn)的消化系統(tǒng)常見疾病，排便情況的觀察和胃腸傳輸速率是對便秘動物模型最直觀、最常用的評價方法。與空白組比較，模型組小鼠小腸推進(jìn)率及5 h黑便粒數(shù)顯著降低，首粒排黑便時間顯著延長，可判定便秘模型建立成功。

與模型組比較，各常潤茶給藥組小鼠小腸推進(jìn)率及5 h黑便粒數(shù)顯著升高，首粒排黑便時間顯著縮短，初步判斷常潤茶可潤腸通便。其中常100組小鼠5 h黑便粒數(shù)顯著高于常40組、常4次組，與模型組比較，常40組炭末推進(jìn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此可知，浸泡水量與常潤茶通便作用正相關(guān)，浸泡水量為60～100倍時通便作用顯著。常潤茶反復(fù)沖泡通便作用不優(yōu)于浸泡1次，故沒有必要多次浸泡。

3.4 不同浸泡次數(shù)及水量常潤茶對便秘小鼠腸道動力與黏液的影響 便秘的發(fā)生與腸系神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸激素關(guān)系密切［15-16］，其中GAS、MTL、SP屬于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，各常潤茶給藥組小鼠GAS、MTL、SP含量升高，胃排空速率增加，結(jié)腸蠕動能力加快，GAS與SP為腦腸肽，作用于結(jié)腸平滑肌的同時可通過神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)促進(jìn)胃酸分泌，減少胃腸道對水分的吸收，增加糞便含水量，縮短糞便在腸道內(nèi)停留時間，促進(jìn)排便。SS屬于抑制性胃腸激素，給藥小鼠SS含量降低，也可有效抑制腸道蠕動、增加腸液及多肽類激素分泌、加快腸道血流量，促進(jìn)排便。常潤茶可通過調(diào)節(jié)胃腸激素，促進(jìn)腸液分泌，增加糞便含水量，產(chǎn)生排便作用。

番瀉葉可改變腸道蠕動功能，研究表明低濃度番瀉葉瀉下作用溫和，長期應(yīng)用對大鼠體質(zhì)量無影響［17］，隨著浸泡水量增加，常潤茶中蒽醌類物質(zhì)溶出增加，常潤茶通便功能增強，小鼠體質(zhì)量未出現(xiàn)顯著變化。而高濃度番瀉葉瀉下作用峻猛，可顯著減緩體質(zhì)量增長，出現(xiàn)腹瀉等癥狀，可能與腸道SS水平降低及小腸黏膜活性變化有關(guān)［18］，同時臨床不良反應(yīng)報道提示，蒽醌類中藥疊加使用，升高了蒽醌類制劑的安全風(fēng)險，常潤茶中番瀉葉與決明子協(xié)同發(fā)揮作用，隨著浸泡次數(shù)的增加，小鼠體質(zhì)量比較于空白組顯著降低，糞便含水量顯著升高，瀉下功能降低，考慮可能與SS水平顯著降低，腸道內(nèi)水分大量流失有關(guān)。

4 總結(jié)

蒽醌類物質(zhì)的不良反應(yīng)大多與其長期大劑量使用有關(guān)，有效物質(zhì)溶出受到加水量及浸泡次數(shù)的影響。本研究以問題為導(dǎo)向建立了常潤茶水浸液中主要功效成分總蒽醌比色法以及番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量測定方法，并考察了不同浸泡次數(shù)及水量對其溶出的影響，明確了常潤茶通便的物質(zhì)基礎(chǔ)。常潤茶規(guī)格為2.5 g/袋，從有效成分溶出的角度確定2袋/d，建議浸泡水量為150～250 mL（60～100倍），浸泡1次服用即可，無須反復(fù)沖泡。本研究進(jìn)一步結(jié)合動物實驗探究浸泡次數(shù)及水量與其通便作用的量效關(guān)系，從有效性方面證實了通過體外測定有效成分含量確定的常潤茶服用方法，并深入研究了其通便作用機制，表明常潤茶可調(diào)節(jié)MTL促進(jìn)腸道蠕動，增加胃腸傳輸功能，調(diào)節(jié)GAS、SP、SS促進(jìn)腸液分泌，增加糞便含水量。此外蒽醌類物質(zhì)協(xié)同作用致使腸道水分大量流失，提示反復(fù)沖泡可能引起小鼠體質(zhì)量降低。

本研究綜合應(yīng)用藥學(xué)及藥理學(xué)方法對蒽醌類物質(zhì)的溶出及其通便作用進(jìn)行考察，為含蒽醌類成分的中藥復(fù)方精準(zhǔn)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

利益沖突聲明：無。

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（2022-11-15收稿 本文編輯：吳珊）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1706803）作者簡介：武潔（1999.07—），女，碩士，研究方向：中藥開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，E-mail：wj18811382122@163.com通信作者：王林元（1961.10—），男，碩士，教授，研究方向：中藥開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，E-mail：wanglinyuan110@vip.163.com；鄭立新（1980.08—），女，碩士，高級工程師，研究方向：毒理學(xué)及保健食品功能，E-mail：594782086@qq.com