李旋 黃燕 趙衛(wèi)峰 楊永峰 甘建和

肝豆?fàn)詈俗冃?(hepatolenticular degeneration,HLD)又名 Wilson病 (WD),是一種常染色體隱性遺傳的單基因、可治性疾病,致病基因 ATP7B定位于染色體 13q14,3,編碼一種銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶[1,2]。ATP7B基因缺陷導(dǎo)致銅代謝障礙,銅在身體多處沉積,以肝臟和大腦最明顯。流行病學(xué)資料顯示W(wǎng)D在世界范圍發(fā)病率為1/3萬～1/10萬,我國發(fā)病率高達(dá)6/10萬,其致病基因攜帶率約為1/90[3,4]。WD好發(fā)于青少年,男比女稍多?，F(xiàn)報(bào)道1例無明顯臨床癥狀、僅出現(xiàn)以AFP升高為主要表現(xiàn)的成人肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床特點(diǎn),分析ATP7B基因突變的遺傳學(xué),為該病的診斷和治療提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

中年女性,49歲,因AFP升高2月余,僅上腹部輕微不適就診。無黃疸及其他特殊不適。2018年6月10日查AFP 95.82 ng/mL,ALT 73.51 U/L, AST 63.07 U/L, GGT 200.43 U/L。胃鏡示膽汁反流性胃炎。保肝降酶、隨訪觀察。2018年8月3日查AFP 97.47 ng/mL。肝炎病毒全套陰性?？购丝贵w+自身免疫肝病抗體全套陰性。腹部MRI平掃: 肝硬化伴多發(fā)再生結(jié)節(jié)。MRCP:未見明顯異常。2018年8月14日查血常規(guī): WBC 4.79×109/L, Hb 130 g/L, PLT 151×109/L。生化: TBil 19.28 μmol/L, ALT 105.9 U/L, AST 77.7 U/L, GGT 334.6 U/L, Alb 39.5 g/L, Glb 25 g/L,AFP 124.5 ng/mL。以肝硬化、肝細(xì)胞癌?收治入院。既往膽囊結(jié)石手術(shù)史10余年,否認(rèn)病毒性肝炎、糖尿病、腎臟病、高血壓病史、飲酒史、長期藥物使用史、遺傳病史、有毒有害物質(zhì)接觸史。體格檢查:血壓 112/60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),BMI=20.81 kg/m2。TBil 23.9 μmol/L, ALT 103.6 U/L, AST 79.5 U/L, GGT 358.7 U/L, Alb 40.7 g/L, Glb 27.8 g/L, 血脂正常。AFP 163 ng/mL。凝血功能: PT 14.1 s, Fbg 1.76 g/L, INR 1.11?？购丝贵w+自身免疫肝病抗體全套:陰性。CMV DNA+EBV DNA 陰性。2018年8月16日普美顯MRI+MRCP:肝硬化伴多發(fā)再生結(jié)節(jié)形成,MRCP未見明顯異常?；颊叱霈F(xiàn)AFP進(jìn)行性升高,但無明顯腫瘤消耗癥狀,同時(shí)影像學(xué)檢查未見腫瘤表現(xiàn)。為進(jìn)一步明確診斷于2018年8月21日肝組織穿刺病理活檢示:肝硬化伴肝細(xì)胞重度脂肪變性。結(jié)合臨床及病理高度懷疑肝豆?fàn)詈俗冃?隨后完善相關(guān)特異性檢查,銅藍(lán)蛋白 0.07 g/L(正常<200 mg/L);眼角膜K-F環(huán):陰性;血清銅 381.6 μg/L(正常700～1400 μg/L);24 h尿銅含量 176.5 μg/24 h(正常15～60 μg/24 h);頭顱CT未見明顯異常。

二、研究方法

(一)臨床資料 收集患者臨床資料,包括一般資料、臨床表現(xiàn)、生化指標(biāo)、影像學(xué)資料,肝組織病理資料,基因檢測結(jié)果等。

(二)外顯子捕獲測序 基因檢測有助于WD的早期診斷及治療。在獲得患者知情同意后,通過二代測序(NGS)技術(shù)篩查致病基因,以明確診斷。用EDTA抗凝管采集患者外周血2 mL。按照QIAamp DNA提取試劑盒說明書抽提患者基因組DNA,并建立含有與肝豆?fàn)詈俗冃韵嚓P(guān)基因的全基因組文庫,利用MiSeq測序儀(illumina Inc,USA)進(jìn)行高通量測序。利用生物信息學(xué)軟件工具對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因序列分析,找出致病基因并且預(yù)測變異的致病性。

(三)突變前后的蛋白空間結(jié)構(gòu)對(duì)比分析 用SWISS-MODEL構(gòu)建ATP7B野生型和突變型蛋白序列所對(duì)應(yīng)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,并比對(duì)模型間的構(gòu)象差異,判斷基因突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。

結(jié) 果

一、MRI普美顯+MRCP結(jié)果

肝臟表面凹凸不平,肝左葉增大,T2WI肝臟內(nèi)多發(fā)低信號(hào)結(jié)節(jié),增強(qiáng)未見異常強(qiáng)化,普美顯延遲期未見明顯低信號(hào)。門脈主干及分支顯影正常,肝內(nèi)外膽管未見擴(kuò)張。腹膜后和腸系膜區(qū)未見腫大淋巴結(jié)。脾臟體積增大。肝硬化伴多發(fā)再生結(jié)節(jié)。見圖1。

圖1 MRI普美顯+MRCP影像學(xué)表現(xiàn)

二、肝活組織病理檢查結(jié)果

肝小葉結(jié)構(gòu)中度紊亂,肝細(xì)胞輕中度濁腫伴點(diǎn)灶性壞死,肝細(xì)胞大泡性脂肪變性,肝細(xì)胞糖原性空泡核形成,玫瑰花結(jié)形成,匯管區(qū)輕中度擴(kuò)大,炎性細(xì)胞浸潤,纖維組織增生,中度慢性肝炎G2-3,S1-2 伴部分自身免疫性肝炎。見圖2。

注:A為HE染色,4X; B為HE染色,4X; C為HE染色,10X

三、遺傳學(xué)分析結(jié)果

外顯子組捕獲測序在患者ATP7B基因檢測到兩個(gè)突變,分別是Exon15 c.3316G>A p.(Val1106Ile)和 Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)。見表1。

表1 基因分析結(jié)果

四、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

通過對(duì)比正常堿基序列,并進(jìn)一步采用SWISS-MODEL同源建模,構(gòu)建預(yù)測蛋白質(zhì)模型。見圖3、圖4。

注:p.(Arg778Leu)突變前后ATP7B蛋白結(jié)構(gòu)飄帶圖,A為野生型ATP7B蛋白(Arg);B為突變型ATP7B蛋白(Leu)。p.(Val1106Ile)突變前后ATP7B蛋白結(jié)構(gòu)飄帶圖;C為野生型ATP7B蛋白(Val);D為突變型ATP7B蛋白(Ile)

注:p.(Arg778Leu)突變前后 ATP7B蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測圖,A為野生型 ATP7B蛋白結(jié)構(gòu)模型;B為突變型ATP7B蛋白結(jié)構(gòu)模型,第778位氨基酸由精氨酸(圖A)變?yōu)榱涟彼?圖B);C顯示突變后可能會(huì)影響a螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,進(jìn)而可能影響蛋白結(jié)構(gòu)或者功能。p.(Val1106Ile)突變前后 ATP7B蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測圖;D為野生型 ATP7B蛋白結(jié)構(gòu)模型;E為突變型ATP7B蛋白結(jié)構(gòu)模型,第1106位氨基酸殘基由纈氨酸(圖D)變?yōu)楫惲涟彼?圖E);F顯示突變后的氨基酸與周圍氨基酸存在相互排斥,可能由此影響蛋白功能

五、治療及轉(zhuǎn)歸

基因檢測結(jié)果顯示存在ATP7B基因突變。根據(jù)WD的Leipzig評(píng)分系統(tǒng)為7分,最終診斷為Wilson病。給予青霉胺+葡萄糖酸鋅聯(lián)合治療后,效果確切,患者ALT、AST、AFP水平明顯下降,見圖5和圖6,并逐漸恢復(fù)至正常,肝纖維化程度亦下降,見圖7,患者肝功能得到好轉(zhuǎn),病情穩(wěn)定后出院。

圖5 患者治療前后ALT、AST變化

圖6 患者治療前后AFP變化

注:患者治療后經(jīng)Fibroscan檢測,肝臟硬度值明顯下降,脂肪衰減值亦明顯下降

討 論

WD致病基因 ATP7B定位于染色體 13q14,3,編碼的銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶參與銅的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),將銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)給銅藍(lán)蛋白前體以合成全銅藍(lán)蛋白,使銅離子能夠從肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至膽汁, 經(jīng)膽道排出體外[5-7]。如果該酶功能缺陷,血清銅藍(lán)蛋白合成減少,銅離子經(jīng)膽汁排出障礙,多余的銅沉積于肝臟, 并分泌入血,沉積在腦、腎、骨、角膜等器官組織,從而導(dǎo)致肝臟損傷、神經(jīng)和精神系統(tǒng)異常、腎臟損傷、骨關(guān)節(jié)病,以及角膜K-F環(huán)等多種臨床表現(xiàn)。以肝臟或神經(jīng)系統(tǒng)的損傷為主。肝病表現(xiàn)通常早于神經(jīng)系統(tǒng),臨床上可表現(xiàn)為無癥狀、急性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化等多種形式[5]。肝臟損傷后,動(dòng)員肝前體細(xì)胞增殖分化,此過程引起AFP的分泌。正常人血清中AFP<20 μg/L。肝細(xì)胞癌,活動(dòng)性肝炎等都會(huì)導(dǎo)致AFP升高。AFP在肝臟慢性炎癥中的增高反映肝細(xì)胞炎癥、壞死和再生。在肝損傷患者中,AFP的數(shù)值常呈一過性升高,經(jīng)保肝等治療后,AFP常能恢復(fù)正常。若AFP增高幅度過大,數(shù)值過高,應(yīng)高度警惕原發(fā)性肝癌[8]。本例患者AFP雖較正常明顯升高,但無腫瘤消耗性表現(xiàn),影像學(xué)不支持,病理未見腫瘤細(xì)胞,最新的AFP數(shù)據(jù)下降明顯,均不支持肝癌診斷,所以活動(dòng)性肝炎可能性更高。其影像學(xué)和病理學(xué)均提示肝硬化表現(xiàn),進(jìn)而排查肝硬化的可能病因:患者女性,無飲酒史,排除酒精性脂肪肝;HV-M陰性,CMV+EBV 陰性,排除病毒性肝炎;無長期用藥及毒物接觸史,排除藥物或中毒性肝炎;無其他免疫相關(guān)疾病,多次查自免肝抗體陰性,排除自身免疫性肝病?；颊唧w型瘦,BMI低,血糖、血脂、尿酸正常,臨床表現(xiàn)不明顯,排除了諸多肝硬化的病因,再結(jié)合肝細(xì)胞大泡性脂肪變性的病理結(jié)果,綜合考慮WD的可能性較大。隨后完善了WD相關(guān)特異性檢查(銅藍(lán)蛋白、眼角膜K-F環(huán)、血清銅、24h尿銅含量、頭顱CT等),并進(jìn)行了基因檢測?；蚍治鼋Y(jié)果顯示ATP7B基因突變c.3316G>A 和c.2333G>T的復(fù)合雜合子;蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示突變c.2333G>T是ATP7B蛋白的致病性突變。由于錯(cuò)義突變,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,氫鍵的位置和數(shù)量明顯改變,最終出現(xiàn)氨基酸的錯(cuò)譯。ATP7B 基因 Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)錯(cuò)義雜合突變,致2333位鳥嘌呤(G)突變?yōu)樾叵汆奏?T)[9],致所編碼的蛋白質(zhì)第778位氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)榱涟彼?Leu)。文獻(xiàn)報(bào)道該變異降低了細(xì)胞內(nèi)銅離子的外排作用,并影響ATP7B蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和運(yùn)輸,綜合考慮,認(rèn)為該變異為致病性變異。Exon15 c.3316G >A p.(Val1106 Ile)錯(cuò)義雜合突變,致3316位鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A),致翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)第1106位氨基酸殘基由纈氨酸(Val)變?yōu)楫惲涟彼?Ile)。Val1106位點(diǎn)雖位于保守序列,但屬于罕見的多態(tài)性位點(diǎn),影響WD患者的表現(xiàn)度,也有研究顯示該變異對(duì)其功能無顯著影響。綜合考慮,該變異的臨床意義未明。有研究發(fā)現(xiàn)WD的基因型和表型存在一定的相關(guān)性,其中R778L突變可能與較早的發(fā)病年齡、低水平的血清銅藍(lán)蛋白有關(guān),也可能與更嚴(yán)重的肝功能損傷有關(guān)[10,11]。本例患者存在R778L突變, 是肝豆?fàn)詈俗冃约膊〉臒狳c(diǎn)之一。

綜上所述,本例WD患者以AFP升高為主要表現(xiàn),其突變基因ATP7B(13q14) Exon15 c.3316G>A p.(Val1106Ile),ATP7B(13q14) Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)的發(fā)現(xiàn)為確診、治療以及家系遺傳咨詢提供了遺傳學(xué)依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。