郝梓添，付小巧，李燁，方雯靖，劉小艷，邢春玉

（天津天獅學(xué)院，天津 301700）

隨著社會經(jīng)濟的高速發(fā)展，水污染問題日漸突出，對我國的工農(nóng)業(yè)發(fā)展和國民經(jīng)濟造成了嚴重的影響，如何有效地控制水體中的氮、磷仍是當前亟待解決的問題[1-3]。對富營養(yǎng)化水體進行修復(fù)的方法主要有物理、化學(xué)、生物等方法，其中微生物技術(shù)憑借著對環(huán)境污染小和操作難度低等優(yōu)勢被廣泛使用，這在一定程度上解決了物理或化學(xué)技術(shù)成本高、治理效果不理想、易引起二次污染等問題[4]。

固定化微生物技術(shù)是20 世紀80 年代發(fā)展起來的新興技術(shù)，并顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，近年來已逐漸發(fā)展成為一種主要的生物修復(fù)手段。該技術(shù)是采用物理或化學(xué)的方法將菌株固定在有限空間區(qū)域[5]，與游離微生物技術(shù)相比，固定化微生物具有密度高、不易流失[6]，清除氮磷效果好，對環(huán)境耐受力強等優(yōu)點，在凈化富營養(yǎng)水體的試驗中具有重要的研究價值[7-8]。慕慶峰等[9]將一株假單胞菌（Pseudomonas putida）進行固定并應(yīng)用于濕地水體修復(fù)，對水體中氮、磷具有良好的去除效果。尹艷娥等[10]以活性炭纖維（ACF）固定微生物用于污染水體的治理，其對氨氮和亞硝酸鹽有較好的去除作用，去除率可以達到60%-90%。劉娥等[11]將2%SV 與6%CaCl2交聯(lián)24 h 作為最適條件，包埋蛋白核小球藻和光和細菌，研究結(jié)果表明菌藻結(jié)合且合理固定可顯著提高對養(yǎng)殖廢水的凈化效率。

固定化微生物載體材料可以對固定化效果產(chǎn)生直接影響，因此材料的選擇至關(guān)重要。通常選擇成本低，容易獲得，且不會被微生物降解的材料[12]。聚乙烯醇（PVA）具有機械強度好、成本低等特點，常被選作微生物固定的載體材料。海藻酸鈉（SA）具有良好的生物相容性、經(jīng)濟環(huán)保且可降解，但其力學(xué)性能較差[13]，使用存在一定局限性，因此常和PVA 一起使用。

本研究以反硝化聚磷菌為研究對象，采用海藻酸鈉（SA）和聚乙烯醇（PVA）對菌株進行包埋，形成固定化微球，以清除富營養(yǎng)化水體中總氮、總磷為評價指標，通過正交試驗，探討菌株包埋固定的最優(yōu)條件。將固定化微球投放入富營養(yǎng)化水體中，通過監(jiān)測TN、TP、COD 等指標，評價固定化微球的使用性能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗所用菌株 實驗室篩選的具有脫氮除磷能力的反硝化聚磷菌菌株（Bacillussp.）A16。

1.1.2 培養(yǎng)基及模擬廢水（1）BPM 培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.0、121 ℃滅菌20 min。

（2）模擬廢水（g·L-1）：葡萄糖0.28 g、(NH4)2SO40.3 g、K2HPO40.06 g、微量元素2 mL、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株擴大培養(yǎng)及菌體收集 無菌條件下，將A16 菌株接種于BPM 培養(yǎng)基，30 ℃，160 r·min-1條件下培養(yǎng)至對數(shù)期。取對數(shù)期菌液，5 000 r·min-1，離心10 min，得到菌體沉淀，稱取菌體濕質(zhì)量，加入無菌水，制成10 mL 菌懸液。

1.2.2 SA 和PVA 濃度的確定（質(zhì)量體積比，m·v-1）PVA 濃度為1.0%時，SA 濃度分別設(shè)置為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，將混合的凝膠用注射器滴入經(jīng)NaHCO3調(diào)節(jié)至pH 為7.0 的2.0%CaCl2飽和H3BO3溶液中，固化30 min，觀察微球形態(tài)，測定破碎率、彈性等指標，確定SA 的使用濃度。

固定SA 濃度為2.0%，控制單一變量為PVA 濃度，考查PVA 濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%時成球效果，按上述同樣的方法制備微球并測定破碎率、彈性等指標，確定PVA 的使用濃度。

為排除當SA、PVA 濃度均為1.0%時，有可能是因為PVA 濃度過低而形成不規(guī)則易粘連微球的不確定性，再次選擇SA 濃度為1.0%時，考查PVA濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%時微球成型效果。

1.2.3 固定化微球性能測試 （1）成球難易：顆粒能否形成大小均勻的圓球形，且不出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

（2）破碎率：取50 個固定化微球，置于盛有100 mL 蒸餾水的錐形瓶中，30 ℃、160 r·min-1條件下震蕩24 h，記錄微球的破碎個數(shù)并計算破碎率。

（3）彈性：按壓小球后是否可恢復(fù)原狀且速度較快。

1.2.4 固定化脫氮除磷菌微球的制備 稱取2.0 g SA 和4.0 g PVA，置于燒杯中，加入90 mL 熱蒸餾水，待充分溶解后，冷卻至30 ℃，形成SA-PVA 凝膠。將菌懸液與SA-PVA 凝膠混合，充分攪拌至混合均勻，用10 mL 注射器緩慢滴入經(jīng)NaHCO3調(diào)節(jié)至pH 值為7.0 左右的具有一定濃度的CaCl2飽和H3BO3溶液中，形成直徑約為3 mm 的固定化微球，固化30 min 后除去CaCl2硼酸溶液，用無菌水反復(fù)沖洗，收集微球。固定化微球存儲于4 ℃冰箱內(nèi)，備用。

用去離子水代替菌懸液，按上述方法制備空白微球。

1.2.5 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以去除廢水中的總氮、總磷能力為評價指標進行3 因素3 水平正交試驗設(shè)計L9（34），考查菌體添加量、CaCl2濃度、固化時間對固定化微球成球效果及清除氮磷能力的影響。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

表2 PVA、SA 濃度對成球效果的影響

1.2.6 固定化微球?qū)δM廢水的修復(fù) 將按照優(yōu)方案固定的微球（如圖1 所示）投放到模擬廢水中，觀測微球的實際凈水能力。具體操作步驟為：將100 g 微球投放到盛有250 mL 模擬廢水的錐形瓶中，將錐形瓶置于搖床上，30 ℃、80 r·min-1條件下震蕩，每8 h檢測水體中TN、TP 和COD 的含量，并計算去除率。

圖1 固定化脫氮除磷菌株微球

1.2.7 水體指標的測定方法及數(shù)據(jù)處理 總氮和總磷的測定分別采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法和鉬銻抗分光光度法，COD 的測定采用重鉻酸鉀法[14]。采用sigmaplot 14.0 進行繪圖，SPSS20.0 進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化微球性能評價

試驗中先確定PVA 濃度為1.0%，控制單一變量為SA 濃度。SA 濃度為1.0%時，形成不規(guī)則微球，易粘連，微球彈性差，24 h 破碎率為48.0%，如圖2-A所示；SA 濃度為2.0%時，形成規(guī)則微球，彈性較好，24 h 破碎率為12.0%；SA 濃度為3.0%和4.0%時，均形成帶尾不規(guī)則微球，彈性較差，24h 破碎率分別為8.0%和6.0%，如圖2-B、圖2-C 所示。由此確定，SA的最佳使用濃度為2.0%。

圖2 不同濃度SA 成球效果

固定SA 濃度為2.0%，控制單一變量為PVA 濃度。結(jié)果表明，當PVA 濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%時，均可形成規(guī)則微球，如圖3 所示。從20 cm 高處自由下落彈跳高度分別為8.2 cm、8.6 cm、10.3 cm、14.2 cm，24 h 破碎率分別為12.0%、14.0%、10.0%和8.0%。由此得出，固定化微球最佳的PVA濃度為4.0%。

圖3 不同濃度PVA 成球效果

為排除SA、PVA 濃度均為1.0%時，因PVA 濃度過低而形成不規(guī)則、易粘連微球的不確定性，再選擇SA 濃度為1.0%，控制單一變量為PVA 濃度。當PVA 濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%時，均不能形成規(guī)則微球。由此確定，SA 濃度為1.0%時均不能形成規(guī)則微球。固定化微球的最佳條件為：SA 濃度為2.0%，PVA 濃度為4.0%。

SA 和PVA 形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)構(gòu)成了固定化微球的基本骨架。當SA 濃度增大時，微球強度增加，但彈性差，結(jié)構(gòu)致密，導(dǎo)致傳質(zhì)性能降低。PVA 濃度偏低時，成球性較差，當濃度增大時，微球彈性良好，但成球性差，傳質(zhì)性能也會降低[15]。因此，SA 與PVA 聯(lián)合使用可以避免成球困難和傳質(zhì)阻力大的不足。

2.2 正交試驗結(jié)果分析

表3 為正交試驗結(jié)果與極差分析，其中k1，k2，k3 代表試驗結(jié)果平均值，R 代表該列的極差。結(jié)果表明，試驗號為2、5、8 的成球效果最好。各因素對TN、TP 去除的影響由主到次排列為：A＞B＞C（即菌體添加量（g·L-1）＞CaCl2濃度（%）＞固化時間（min））。根據(jù)極差分析可以得出，對TN 去除較優(yōu)的方案為A3B2C2，即菌體添加量為6 g·L-1，CaCl2濃度為2%，固化時間為30 min；對TP 去除較優(yōu)的方案為A3B2C1，即微生物用量為6 g·L-1，CaCl2濃度為2%，固化時間為45 min。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，在總氮去除方面菌體添加量、CaCl2濃度各水平間表現(xiàn)出明顯的差異（P＜0.05），固化時間各水平之間差異不顯著。在總磷去除方面，菌體添加量各水平間表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），CaCl2濃度和固化時間各水平之間差異不顯著。由此可見，菌體添加量是固定化微球清除氮磷能力的關(guān)鍵影響因素。

表3 正交試驗結(jié)果

2.3 驗證試驗結(jié)果分析

由表4 可知，方案A3B2C2對總氮的去除率為68.73%，對總磷的去除率為70.54%；方案A3B2C1對總氮、總磷的去除率分別為67.94%和68.23%。因此，選定脫氮除磷菌株固定化的優(yōu)方案為A3B2C2，即菌體添加量為6 g·L-1，CaCl2濃度為2.0%，固化時間為30 min，SA 用量為2%，PVA 用量為4%。

表4 驗證試驗結(jié)果

圖4 顯示了3 種因素對TN、TP 去除率的影響趨勢。由圖4 可知，菌體添加量越大，清除總氮、總磷的能力越強，但菌體添加量不可過高。研究發(fā)現(xiàn)，當達到6 g·L-1時，對TN、TP 的去除能力趨于平緩，原因可能是微生物包埋固化在SA+PVA 微球內(nèi)，生存空間有限，密度過高，菌體繁殖會受到限制[16]。因此，在現(xiàn)有研究條件下，控制菌體濕質(zhì)量6 g·L-1的濃度較為合理。CaCl2濃度為2%時，TN、TP 的去除效果較好，當濃度升高時去除能力開始下降，過量的CaCl2會導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)緊密，從而影響營養(yǎng)鹽的進入，造成傳質(zhì)性能降低[17]。固化時間達到30 min 時，微球?qū)N、TP 的去除效果最好，隨著固化時間的延長，過飽和的Ca2+會造成微球過度固化，影響傳質(zhì)，同時過多的Ca2+也會影響微生物的生長[18]，進而影響對氮、磷的去除能力。

圖4 3 種因素對TN、TP 去除率的影響趨勢

本研究使用CaCl2-H3BO3作為交聯(lián)劑，CaCl2溶液中Ca2+與SA 中的-COONa 作用形成-COOCaOOC-的結(jié)構(gòu)。PVA 通過硼酸溶液中的B(OH)4-進行交聯(lián)作用，形成-OB(OH)O-結(jié)構(gòu)[19]。PVA 與硼酸反應(yīng)的速度較慢，因此容易聚集成團[20]，使用含有CaCl2的飽和H3BO3溶液作為交聯(lián)劑，可以避免PVA 顆粒聚集，增強成球能力。

2.4 固定化微球?qū)δM廢水的凈化

將固定化微球投放到模擬富營養(yǎng)化水體中，對TN、TP、COD 的清除情況見圖5。從圖5 可以看出，微球在24 h 對TN、TP、COD 的去除率達到較高水平，TN 去除率在32 h 達到最大值（69.53%）；TP 去除率在40 h 達到最高值（70.50%），之后去除能力保持平穩(wěn)；COD 清除率在48 h 達到最大值（73.26%）。結(jié)果表明，固定化微球可以在較長時間內(nèi)對富營養(yǎng)化水體保持良好的凈化能力。

圖5 固定化微球?qū)δM廢水的凈化效果

3 討論與結(jié)論

（1）通過對固定化微球彈性、破碎率、成球效果等指標的研究結(jié)果表明，當PVA 為1.0%時，在不同濃度的SA 條件下，成球效果均不夠理想。低濃度時，破碎率將近50%，這也證實SA 凝膠脆性大，單獨使用成球效果不佳[21]。PVA 與SA 的復(fù)合使用，彌補了SA 單獨使用的不足，提高了凝膠的機械性能[22]，破碎率明顯降低。因此，當SA 濃度為2.0%、PVA濃度為4.0%時，固定化微球成球良好，且具有較好性能。（2）正交試驗結(jié)果表明，菌體添加量為6 g·L-1、CaCl2濃度為2%、固化時間為30 min 時，對水體中總氮、總磷具有較好的清除效果，清除率分別達到68.73%和70.54%。CaCl2濃度低時，交聯(lián)度低，微球機械強度差，菌體包埋不充分，容易流失；濃度高時，造成交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密，傳質(zhì)性能下降。因此，CaCl2濃度為選擇2%較為合適。固化時間對微球成球性能的影響表現(xiàn)為固化時間短，造成Ca2+置換Na+反應(yīng)不充分，導(dǎo)致微球容易破碎。固化時間長，SA 凝膠結(jié)合位點達到飽和，顆粒網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)過于緊密，導(dǎo)致菌體酶活性降低[23]，脫氮除磷效率下降。因此，固化時間控制在30 min 較為合適。（3）固定化微球在模擬廢水中對TN、TP、COD 的去除試驗表明，24 h 即可達到較高的凈化水平，在72 h 內(nèi)微球?qū)λw的凈水能力保持平穩(wěn)，對富營養(yǎng)化水體總氮、總磷、COD 各項指標清除率最高可達到69.53%、70.50%、73.26%。