賈 麗，邵雅婷，羅繼分，胡佳振，郭 嬌，徐世才*，羅 坤*

（1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西 延安 716000）

延安地處黃土高原的中南部，東傍黃河，屬溫帶半干旱區(qū)，土層深厚，日照充足，完全符合蔬菜生長的多項(xiàng)主要?dú)夂蛑笜?biāo)。近幾年，延安地區(qū)設(shè)施蔬菜種植面積達(dá)22.09 萬畝，設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)已成為延安農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民持續(xù)增長的高效產(chǎn)業(yè)，在脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮了巨大作用。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，病蟲害種群數(shù)量也隨之增加，成為設(shè)施蔬菜提質(zhì)發(fā)展的一道阻礙，對設(shè)施蔬菜行業(yè)健康發(fā)展造成極大的威脅。

小菜蛾（Plutella xylostellaL.）屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），又名兩頭尖、吊絲蟲，是危害上海青、白菜、甘藍(lán)等十字花科蔬菜的重要害蟲［1］。該蟲年發(fā)生世代多，繁殖率高，世代間蟲口數(shù)量增長快，危害極為嚴(yán)重，主要以幼蟲形態(tài)進(jìn)行危害，共計(jì)4個(gè)齡期，其中4齡幼蟲食量最大［2］，可在短時(shí)間內(nèi)將蔬菜葉片啃食干凈，所以蟲害一旦暴發(fā)，菜田會遭到大面積破壞［3］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，對于小菜蛾的防治主要依賴于殺蟲劑，但由于使用頻次多且藥物種類單一，導(dǎo)致小菜蛾抗藥性發(fā)生和發(fā)展速度急劇加快［4-6］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，小菜蛾大約已對50 多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性［7-8］。另外，殺蟲劑在造成農(nóng)藥殘留的同時(shí)，還會對生態(tài)環(huán)境造成污染，并將自然環(huán)境中小菜蛾的天敵殺害［9］，此外，隨著人們健康觀念的改變，使得市場對綠色無公害蔬菜的需求量逐年增加。因此，探尋綠色無公害的防治手段調(diào)控小菜蛾的群體數(shù)量，已成為新時(shí)期設(shè)施蔬菜提質(zhì)發(fā)展的迫切要求。

近幾十年來，隨著遠(yuǎn)距離電力傳輸、醫(yī)療和通信設(shè)備的高速發(fā)展，導(dǎo)致環(huán)境中的靜電場強(qiáng)度顯著增加［10］。在靜電生物學(xué)領(lǐng)域中最早被關(guān)注的就是高壓靜電場（High voltage electro static fields，HVEF）對種子的生物學(xué)效應(yīng)［11］。已有研究表明，外加適當(dāng)強(qiáng)度的靜電場可以改變植物應(yīng)對脅迫的能力。例如前人利用高壓靜電場處理作物或蔬菜的種子，由此來改變種子內(nèi)部的抗氧化酶系的活性，從而提高種子的萌發(fā)率，加速植物的生長，增加產(chǎn)量，改變植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的含量［12-14］。此外，前期研究結(jié)果表明：將普通小麥種子直接暴露于強(qiáng)度為4 kV/cm的高壓靜電場處理20 min，顯著增強(qiáng)了宿主的抗蚜性［15］，為了進(jìn)一步研究高壓靜電場處理麥種調(diào)控麥蚜的種群數(shù)量的潛在生化基礎(chǔ)，對小麥葉片組織中抗氧化酶系的活性進(jìn)行了深入的分析，研究表明，高壓靜電場處理主要通過提高小麥葉片的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）與過氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性以增強(qiáng)宿主的抗蟲性［16-17］。這些研究結(jié)果為制定小菜蛾幼蟲的無公害防治措施提供了重要線索。本研究將上海青種子直接暴露于強(qiáng)度為5.0 kV/cm 的HVEF 中于不同的處理時(shí)間，研究取食HVEF 處理后的上海青對小菜蛾種群的間接效應(yīng)，以此探究該物理方法在小菜蛾無公害防治中的可行性，為發(fā)展小菜蛾的綠色防控手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試植物及處理

本研究中使用的上海青種子由山東晟遠(yuǎn)種業(yè)公司提供。挑選大小均勻，籽粒完整的上海青種子，將其隨機(jī)分成7組，每組100粒種子，進(jìn)行3次重復(fù)，其中1組為空白對照（未用電場處理），其余放置于強(qiáng)度為5.0 kV/cm的高壓靜電場中進(jìn)行處理，處理時(shí)間分別為5、10、15、20、40、60 min。

1.2 供試?yán)ハx處理

小菜蛾采自陜西省延安市寶塔區(qū)正大宏園林綠化有限公司，將蟲源帶回試驗(yàn)室穩(wěn)定繁殖5 代后作為供試蟲源。蟲源飼養(yǎng)于溫度25±1 ℃，相對濕度55%±10%，光周期12 L∶12 D 的人工氣候箱內(nèi)。將HVEF 處理之后的上海青種子進(jìn)行種植。待上海青成熟后采集新鮮葉片飼養(yǎng)小菜蛾同日卵孵化出的一齡幼蟲，為了保證小菜蛾的生長和發(fā)育不受食物的影響，每天更換一次新鮮菜葉。飼養(yǎng)一齡幼蟲直至全部成蟲羽化，在此過程中收集小菜蛾的4 齡幼蟲，使用液氮冷凍后放置于-80 ℃冷凍保存用于酶活測定。將羽化后的成蟲按照雌∶雄=1∶1配對后飼養(yǎng)于一次性塑料杯中，飼養(yǎng)條件同上。每隔24 h 補(bǔ)充10%的蜂蜜水，更換產(chǎn)卵紙并記錄成蟲產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵周期、前期及雌雄蟲存活天數(shù)，每個(gè)處理30 對成蟲。

1.3 儀器與試劑

WJ-Ⅱ高壓靜電發(fā)生器（江蘇省無錫博雅電子技術(shù)有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（Tecan，Sunrise），2X-600低速離心機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HC-2518 高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

BCA 蛋白濃度測定試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量測定試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 抗氧化酶活性測定

粗酶液制備：將10 頭初發(fā)育為4 齡幼蟲的小菜蛾放入2 mL離心管中使用液氮速凍，然后使用電子天平準(zhǔn)確稱取重量，按照質(zhì)量體積比為1∶9 加入生理鹽水，冰水浴條件下使用研磨器進(jìn)行機(jī)械勻漿，制成10%的組織勻漿，使用低速離心機(jī)2 500 r/min離心10 min，用移液槍吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，放入超低溫冰箱備用。

酶活性測定：總蛋白濃度、CAT、T-SOD、POD活性和MDA含量均根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，并略作調(diào)整。

1.5 數(shù)據(jù)處理

從軟件中導(dǎo)出的產(chǎn)卵前期（Adult preoviposition period，APOP）、產(chǎn)卵期（Oviposition period，OP）、產(chǎn)卵天數(shù)（Oviposition days，OD）、逐日產(chǎn)卵量（Daily fecundity）、每雌產(chǎn)卵量等文件后和酶活數(shù)據(jù)使用TWOSEX-MSChart 軟件進(jìn)行生殖相關(guān)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算。使用26.0 版SPSS 軟件的單因素方差進(jìn)行方差分析，各處理的比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）法進(jìn)行多重比較，各處理間的顯著性差異均設(shè)為P＜0.05水平。使用Graph Pad 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小菜蛾種群繁殖參數(shù)的影響

以強(qiáng)度為5.0 kV/cm的HVEF中處理上海青菜種，可顯著的影響小菜蛾的繁殖與發(fā)育參數(shù)。如表1所示，隨著處理時(shí)間延長，小菜蛾的產(chǎn)卵前期和產(chǎn)卵期均逐漸延長，且不同處理時(shí)間下小菜蛾產(chǎn)卵前期均顯著長于對照組。在所有不同處理時(shí)間的比較中，10、20和40 min處理下小菜蛾的產(chǎn)卵前期顯著延長（F=6.293，d.f.=6，P＜0.05），其中10 min處理下達(dá)到最大值6.26 d。不同處理時(shí)長并未顯著影響成蟲的產(chǎn)卵期（F=1.514，d.f.=6，P＜0.05），但相比對照組，處理組的產(chǎn)卵期均有所延長。在不同處理時(shí)間下產(chǎn)卵天數(shù)在短時(shí)處理下有所上升，5 min 處理下產(chǎn)卵天數(shù)甚至高于對照組，但當(dāng)處理時(shí)間大于10 min后，產(chǎn)卵天數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，最低降至4.91 d，但處理組與對照組無顯著差異（F=2.038，d.f.=6，P＜0.05）。這也說明上海青種子處理時(shí)間越久，對小菜蛾生殖影響越大。主要體現(xiàn)在小菜蛾逐日產(chǎn)卵量隨時(shí)間延長而逐漸減少，在15 min處理下逐日產(chǎn)卵量達(dá)到最低值7.93粒。另外，平均產(chǎn)卵量在不同處理下均呈下降趨勢，最低達(dá)到55.43 粒/雌，其中短時(shí)處理比長時(shí)處理下降更為劇烈。

表1 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾的繁殖參數(shù)

2.2 小菜蛾體內(nèi)抗氧化酶系的活性變化

單因素方差分析結(jié)果表明，當(dāng)小菜蛾取食不同時(shí)間HVEF 處理的上海青之后，體內(nèi)SOD 活性顯著高于對照組（F=60.960，d.f.=6，P＜0.05）（圖1）。并且隨著處理時(shí)間的延長，SOD 活性呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，其中60 min 處理時(shí)間下SOD 達(dá)到最大值68.768 7 U/mg。這表明HVEF 的間接作用對小菜蛾產(chǎn)生了一定的影響，因此小菜蛾體內(nèi)的超氧化物歧化酶作出應(yīng)答，從而使多余的超氧陰離子歧化產(chǎn)生H2O2在體內(nèi)聚集。各處理中，10 min 處理組的響應(yīng)最弱，不能及時(shí)分解多余活性氧，從而在蟲體內(nèi)積累。

圖1 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)SOD活性變化

通過單因素方差分析可知，當(dāng)小菜蛾取食HVEF處理15、20 和40 min 的上海青之后，蟲體內(nèi)POD 活性顯著低于對照組（F=46.618，d.f.=6，P＜0.05），其中15 min 下降最為顯著，POD 活性為14.408 3 U/mg（圖2），這表明在這幾個(gè)處理組中小菜蛾體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)中POD 活力和平衡受到破壞，進(jìn)一步使得機(jī)體內(nèi)氧自由基大量積累，同時(shí)在SOD 酶幫助下歧化的超氧陰離子產(chǎn)生的H2O2無法及時(shí)被進(jìn)一步分解，導(dǎo)致小菜蛾的生殖受到影響，產(chǎn)卵天數(shù)減少并且每雌產(chǎn)卵量大幅度下降。多重比較結(jié)果可知，60 min 長時(shí)處理下與其他處理時(shí)間均有差異，POD 活性顯著上升，且達(dá)到最大值25.323 3 U/mg，在分解H2O2時(shí)起到重要作用。

圖2 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)POD活性變化

由圖3 可知，取食HVEF 處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)CAT活性的變化與POD 有相似的趨勢，不同的是，在15 min 處理時(shí)間下CAT 顯著上升，這也表明在此處理時(shí)間下CAT 在清除H2O2中起到重要作用。隨著處理時(shí)間增加，處理組CAT 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中20、40 和60 min 顯著下降（F=58.673，d.f.=6，P＜0.05），在60 min 處理下有POD 活性達(dá)到最低值113.547 5 U/mg，因此在上述處理時(shí)間下H2O2無法被CAT 酶分解。上述結(jié)果表明，CAT 酶也參與抗氧化系統(tǒng)調(diào)控，但與SOD 酶不同，短時(shí)處理組中CAT活性顯著高于長時(shí)處理組。

圖3 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)CAT活性變化

圖4 取食HVEF處理的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA含量變化

在取食不同處理時(shí)間的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA 的含量不同，其中10 和20 min 處理時(shí)間下小菜蛾MDA 含量顯著高于對照組（F=19.020，d.f.=6，P＜0.05），這表明在使用這兩個(gè)處理時(shí)間下的上海青飼喂小菜蛾后機(jī)體內(nèi)有細(xì)胞損傷，對其產(chǎn)生了不利影響。在取食5和15 min處理下的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA 含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05），這主要是因?yàn)榻?jīng)SOD 歧化產(chǎn)生的H2O2被CAT 和POD 正常分解了，極大程度上減少了對蟲體造成的損傷，對生殖的影響也隨之減弱。

3 討論和結(jié)論

有諸多研究表明，經(jīng)過靜電處理后，植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長都會受到影響，并且這種影響會延續(xù)至植物幼苗中同時(shí)對昆蟲產(chǎn)生間接影響。早在20 世紀(jì)70 年代，國內(nèi)學(xué)者就已開始探索高壓靜電對種子萌發(fā)活力、生理生化變化、植株生長和抗逆能力的影響［18-19］。研究證明，高壓靜電能使黃瓜種子的發(fā)芽率，生長力得到增強(qiáng)［20］。高壓靜電場作用下，小麥種子抗凍害能力顯著提升，植物中營養(yǎng)物質(zhì)的含量亦發(fā)生了一定的改變［21］。此外，已有研究證明靜電場處理可以促進(jìn)菠菜新、陳種子的萌發(fā)及苗期生長，其中50 kV/5 cm×20 s 處理顯著提高了菠菜新種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)，同時(shí)高壓靜電也可提升陳化水稻種子活性指數(shù)，降低電導(dǎo)率，提升抗氧化酶活性［22］。本研究中利用高壓靜電處理上海青的種子，研究表明在適宜的處理時(shí)間下，能提升種子的發(fā)芽率，減少種子萌發(fā)的時(shí)間，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可以減少種子在土壤中被蟲害侵害的概率。

最初，進(jìn)行電場生物學(xué)效應(yīng)的研究主要是為探究環(huán)境電場改變能否對作物的生長乃至經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量有促進(jìn)作用，確定最佳的電場處理方式，誘發(fā)最大的生物學(xué)效應(yīng)，從而開發(fā)出行之有效的農(nóng)業(yè)物理新技術(shù)［23］。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)高壓靜電的效應(yīng)不僅作用于植物自身，而且該效應(yīng)還能間接作用于昆蟲。研究表明，將小麥種子直接放置于4 kV/cm 的高壓靜電場處理后對麥長管蚜的性能產(chǎn)生不利影響［15］。另外，有研究通過測定小麥及麥長管蚜體內(nèi)3 種抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）的變化，并對麥長管蚜的種群數(shù)量動態(tài)和模型進(jìn)行分析，明確高壓靜電對小麥及蚜蟲的作用［16］。植物體內(nèi)抗氧化酶活性以及與抗性相關(guān)物質(zhì)含量的變化改變了植物體內(nèi)原本的微環(huán)境。當(dāng)昆蟲取食HVEF處理的植物后，高壓靜電作為一種脅迫因子使昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡，但當(dāng)ROS積累過多時(shí)，就會引起脂質(zhì)過氧化，從而對生物體造成損害，因此酶活力的變化能夠反映生物體所受環(huán)境脅迫的狀態(tài)和氧化損傷的程度［24-25］。與此同時(shí)，機(jī)體內(nèi)的氧自由基能夠攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA），引發(fā)脂質(zhì)過氧化后形成脂質(zhì)過氧化物，如醛基（MDA）、酮基等，這些物質(zhì)會引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［26］。因此MDA 含量的變化常常作為細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的衡量指標(biāo)，與抗氧化酶系的活性水平一起反映機(jī)體清除自由基的能力和受到脅迫的嚴(yán)重程度。本研究中在取食不同處理時(shí)間的上海青之后小菜蛾體內(nèi)MDA 的含量不同，其中10、20 min處理時(shí)間下小菜蛾MDA 含量顯著上升并且高于對照組，該結(jié)果與酶活結(jié)果保持一致，在10、20 min 處理時(shí)間下，SOD 酶響應(yīng)脅迫活性顯著上升，SOD 分解超氧陰離子后產(chǎn)生的H2O2在機(jī)體內(nèi)積累，但機(jī)體內(nèi)分解H2O2的CAT和POD活性卻呈現(xiàn)下降趨勢，導(dǎo)致H2O2在機(jī)體內(nèi)大量積累，從而攻擊細(xì)胞膜，造成脂質(zhì)過氧化，因此脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA 含量提升，進(jìn)一步反映出蟲體受到嚴(yán)重的損傷，最終對小菜蛾幼蟲的繁殖產(chǎn)生不良影響，使小菜蛾種群得到控制。在本研究中40 min 處理時(shí)間下MDA 含量的結(jié)果是出乎意料的，在此時(shí)間下CAT和POD 活性都是下降的，無法分解機(jī)體內(nèi)積累的H2O2，導(dǎo)致細(xì)胞受損，因此MDA含量應(yīng)該上升，但結(jié)果卻與之相反，這值得我們進(jìn)一步探究機(jī)體內(nèi)其他的與ROS 分解相關(guān)的物質(zhì)。

因此，利用高壓靜電場對上海青種子進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的處理，可以提高種子的萌發(fā)率，并能有效的抵抗小菜蛾，使其生長和發(fā)育受到不利影響，從而為調(diào)控小菜蛾的種群數(shù)量，制定生態(tài)防控小菜蛾的策略提供新的思路。在生產(chǎn)上減少農(nóng)藥的使用頻次，降低生產(chǎn)成本，減少3R 問題的發(fā)生，更加綠色高效地提高上海青的產(chǎn)量和品質(zhì)。