雷公藤甲素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞分化影響及機(jī)制

范文強(qiáng) 郭占非 張超 邊彩月 高曉 許振丹

［摘要］ 目的 探討雷公藤甲素（TP）對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）破骨細(xì)胞（OC）分化的影響及其機(jī)制。

方法 選取2019年9月—2020年8月到我院進(jìn)行治療的RA病人20例，分離RA病人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），通過核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M－CSF）誘導(dǎo)培養(yǎng)為OC，分別用不同濃度的TP（濃度為10、20、40 nmol/L）干預(yù)OC，記為TP各劑量組，未經(jīng)過TP干預(yù)的OC作為對(duì)照組。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK－8）法測(cè)定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測(cè)相關(guān)炎癥因子表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT－PCR）測(cè)定標(biāo)志性基因和分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡（Western blot）測(cè)定p－IκB蛋白以及分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)。

結(jié)果 與對(duì)照組比較，TP各組RA－OC存活率及炎癥因子表達(dá)呈劑量效應(yīng)關(guān)系降低（F=95.702～185.246，P<0.01），RA－OC凋亡率升高（F=306.798，P<0.01）；而Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表達(dá)下調(diào)（F=141.455～266.411，P<0.01），NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表達(dá)均降低，p－IκB蛋白表達(dá)也相應(yīng)降低（F=130.683～351.640，P<0.01）。

結(jié)論 TP可能通過抑制NF－κB信號(hào)通路減輕RA病人OC分化，并抑制細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，以及誘導(dǎo)OC凋亡。

［關(guān)鍵詞］ 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；雷公藤甲素；破骨細(xì)胞；細(xì)胞分化；NF－κB；信號(hào)通路

［中圖分類號(hào)］ R593.22;R284

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096－5532（2023）02－0232－05

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因未明的慢性、以滑膜炎為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性疾病，其特征是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。破骨細(xì)胞（OC）是骨吸收的主要功能細(xì)胞，在骨發(fā)育、生長、修復(fù)、重建中具有重要的作用，它起源于血系單核－巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，是一種特殊的終末分化細(xì)胞，它可由其單核前體細(xì)胞通過多種方式融合形成巨大的多核細(xì)胞。有研究表明，RA病人OC增殖活性增加，OC還能介導(dǎo)骨破壞，是RA關(guān)節(jié)破壞的主要原因。雷公藤甲素（TP）是雷公藤的主要活性成分之一，它具有抗氧化、抗老年性癡呆癥、抗癌等功效。TP還能減緩RA大鼠關(guān)節(jié)損傷。但是關(guān)于TP對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎－破骨細(xì)胞（RA－OC）的影響及其機(jī)制還不清楚，本實(shí)驗(yàn)主要研究TP對(duì)RA－OC分化的影響及其潛在的調(diào)控通路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 人體外周血標(biāo)本 2019年9月—2020年8月，選取到我院進(jìn)行治療的RA病人20例，其中男10例，女10例，平均年齡（55.64±8.31）歲。采集外周靜脈血8 mL。 病人到我院之前均未接受過治療（病情無活動(dòng)）。RA診斷均符合2010年的ACR/EULAR分類標(biāo)準(zhǔn)，排除了患有嚴(yán)重心血管疾病、肝腎功能障礙、惡性腫瘤及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等其他免疫疾病的病人。本研究已經(jīng)獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2020－142），所有病人均知情同意。

1.1.2 試劑和藥物 DMEM培養(yǎng)液購自美國HyClone公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國BD公司；核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M－CSF）購自美國Pepro Tech公司；CCK－8試劑盒購自日本Dojindo公司；膜聯(lián)蛋白V－異硫氰酸熒光素（Annexin V－FITC）和碘化丙啶（PI）試劑盒均購自美國Bio－Rad公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量（qRT－PCR）試劑盒購自美國Invitrogen公司；RIPA裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、PVDF膜購自瑞士Roche公司。TP購自美國Sigma公司（批號(hào)：MKBQ7748V）。

1.2 研究方法

1.2.1 TP試劑的配制 取TP藥物1 mg溶解于277.8 μL的DMSO溶液中，配制成10 mmol/L溶液，取其中1 μL配制成10 μmol/L溶液。最終將TP稀釋成10、20、40 nmol/L的溶液。

1.2.2 RA－OC培養(yǎng) 采用密度梯度離心法分離RA病人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），將PBMC接種于培養(yǎng)皿中，密度為2×106 /cm2，孵育3 h。用胰蛋白酶將消化后的貼壁細(xì)胞接種于24孔板中，密度為2×105/cm2。用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清及RANKL（100 μg/L）、M－CSF（50 μg/L）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)PBMC，每2～3 d換液1次，最終形成RA－OC。采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、TRAP染色及骨吸收試驗(yàn)對(duì)RA－OC進(jìn)行鑒定。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將RA－OC接種于96孔培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組（A組）和3個(gè)不同濃度TP干預(yù)組（B組、C組、D組），每組3例。A組加入相應(yīng)濃度的DMSO，TP濃度為0 nmol/L；B組、C組、D組分別用不同濃度TP（10、20、40 nmol/L）干預(yù)。每組做3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 CCK8法測(cè)定RA－OC存活率 RA－OC細(xì)胞以1×107/L密度接種至96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的CCK－8試劑，孵育2 h，終止培養(yǎng)，在490 nm波長下檢測(cè)細(xì)胞吸光度（A）值。細(xì)胞存活率（%）=待測(cè)樣品A490/對(duì)照A490×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定RA－OC凋亡率 RA－OC細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌，重懸于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整密度為1×109/L。取100 μL細(xì)胞懸液添加到5 mL的流式管中，分別加入5 μL的Annexin V/FITC和PI，孵育15 min，取400 μL的1×結(jié)合緩沖液添加到試管中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子α（TNF－α）和白細(xì)胞介素6（IL－6）表達(dá) RA－OC離心后收集細(xì)胞上清液，然后按照TNF－α試劑盒和IL－6試劑盒說明書操作步驟檢測(cè)其表達(dá)水平。

1.2.7 qPT－PCR方法測(cè)定RA－OC中Trap、Ctsk、CTR、MMP－9、NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA表達(dá)? 用Trizol提取各組RA－OC總RNA，再將其合成cDNA，最后，按照qRT－PCR試劑盒要求進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，使用2－△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。循環(huán)條件：95 ℃、15 min，94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。所用引物名稱及其序列見表1。

1.2.8 Western blot測(cè)定p－IκB蛋白及分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液裂解RA－OC并提取細(xì)胞中的總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。SDS－PAGE試劑盒分離細(xì)胞蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。以質(zhì)量濃度50 g/L脫脂牛奶封閉膜后，在4 ℃條件下與適當(dāng)?shù)囊豢狗跤^夜。然后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育膜，滴加ECL化學(xué)顯色、定影。以β－actin為內(nèi)參照，利用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)目的蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s形式表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP對(duì)RA－OC增殖影響

與A組比較，B組、C組和D組RA－OC的存活率顯著降低（F=159.408，P<0.01），并呈濃度依賴性。見表2。

2.2 TP對(duì)RA－OC凋亡影響

與A組比較，B組、C組和D組 RA－OC的凋亡率顯著升高（F=306.798，P<0.001），并呈濃度依賴性。見表2和圖1。

2.3 TP對(duì)RA－OC炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)影響

與A組相比較，B組、C組和D組 RA－OC的TNF－α和IL－6表達(dá)水平顯著降低（F=185.246、95.702， P<0.01），且呈濃度依賴性。見表3。

A：對(duì)照組（TP為0 nmol/L）；B：10 nmol/L的TP干預(yù)組；C：20 nmol/L的TP干預(yù)組；D：40 nmol/L的TP干預(yù)組。

與A組細(xì)胞比較，B組、C組和D組RA－OC的Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表達(dá)明顯降低（F=141.455～266.411，P<0.01），并呈濃度依賴性。見表4。

2.5 TP對(duì)RA－OC中分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)影響

與A組細(xì)胞比較，B組、C組和D組RA－OC的NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（F=173.559～351.640，P<0.01），呈濃度依賴性。見表5和圖2。

2.6 TP對(duì)NF－κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白p－IκB表達(dá)影響結(jié)果表明，A組、B組、C組與D組RA－OC的p－IκB蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.95±0.09、0.76±0.07、0.53±0.05和0.40±0.03。與A組相比較，B組、C組和D組RA－OC的p－IκB蛋白表達(dá)明顯降低（F=130.683，P<0.01），且呈濃度依賴性。見圖3。

3 討論

RA是一種嚴(yán)重的慢性自身免疫性炎癥性疾病，關(guān)節(jié)炎的病理改變主要有滑膜襯里細(xì)胞增生、間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，以及微血管新生及軟骨和骨組織破壞等。OC的形成、分化及活化會(huì)加重RA對(duì)骨破壞的程度，如果出現(xiàn)OC將會(huì)出現(xiàn)骨破壞的病變。

雷公藤，又名黃藤，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛風(fēng)通絡(luò)、消腫止痛、清熱解毒等功效，對(duì)炎癥和自身性免疫疾病具有顯著療效。RA在中醫(yī)學(xué)中屬于“痹癥”范疇，在《滇南本草》中已經(jīng)有雷公藤治療RA的記載，TP可有效抑制RA發(fā)病過程中促炎因子的異常升高及炎癥遞質(zhì)的上調(diào)。研究結(jié)果顯示，TP能改善RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，并減輕大鼠關(guān)節(jié)組織的炎癥反應(yīng)。TP還能抑制RA炎癥反應(yīng)和骨破壞。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，TP處理RA－OC后，細(xì)胞存活率及炎癥因子TNF－α、IL－6表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率增加，提示TP可明顯抑制RA－OC增殖和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)其凋亡。

OC是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，若其功能改變可導(dǎo)致骨質(zhì)吸收異常。已經(jīng)有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP不僅對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的OC分化及骨吸收功能具有抑制作用，并且對(duì)Tregs－OC共培養(yǎng)體系中OC的分化及骨吸收功能也有明顯的抑制作用。標(biāo)志性因子抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、組織蛋白酶K（Ctsk）、CTR、MMP－9等是一系列與OC吸收有關(guān)的酶。TRAP參與了OC介導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換過程，而Ctsk可以影響OC中TRAP的運(yùn)輸。MMP－9是降解OC外基質(zhì)、參與骨重建的重要蛋白酶，在增強(qiáng)OC的骨吸收中起重要作用。已經(jīng)有研究表明，高遷移率族蛋白1誘導(dǎo)的OC中TRAP活性顯著升高，而TP可以降低其活性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示，TP處理RA－OC后可以降低Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表達(dá)?；罨疶細(xì)胞核因子（NFATc1）在OC中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，c－Fos和c－Jun與NFATc1結(jié)合可組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，TP可顯著降低RA－OC的NFATc1、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表達(dá)，提示TP可抑制RA－OC分化。

NF－κB具有介導(dǎo)免疫應(yīng)答的生理功能，炎癥反應(yīng)的發(fā)生與NF－κB信號(hào)通路激活有關(guān)，NF－κB在炎性因子的誘導(dǎo)等多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能。NF－κB信號(hào)通路參與了機(jī)體RA的調(diào)節(jié)機(jī)制，藥物干預(yù)可以抑制該通路的活性，從而達(dá)到治愈疾病的目的。有研究表明，TP能通過NF－κB信號(hào)通路抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷。NF－κB信號(hào)通路激活能抑制RA－OC分化及骨吸收。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，TP可降低RA－OC中p－IκB蛋白表達(dá)，提示TP可能通過NF－κB信號(hào)通路影響RA的發(fā)展。

綜上所述，TP通過抑制NF－κB信號(hào)通路減輕RA－OC分化，抑制細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為治療RA提供了理論基礎(chǔ)。但是，本研究也存在一些局限性，比如沒有采用NF－κB的激動(dòng)劑進(jìn)行TP作用的復(fù)驗(yàn)證，沒有建立小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。今后，我們將進(jìn)行這些研究進(jìn)一步驗(yàn)證本文的結(jié)論。

［參考文獻(xiàn)］

穆培霞，馬玲，付冬冬，等. 艾拉莫德對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡及炎癥因子水平的影響.? 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2020，55（3）：364－368.

宣依依，楊晶，向勇，等. 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小劑量甲氨蝶呤治療藥物監(jiān)測(cè)及基因多態(tài)性研究進(jìn)展.? 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2019，54（4）：538－542.

JARRAR H， ALTINDAL D ， GM DERELIOLU M. Effect of melatonin/BMP－2 co－delivery scaffolds on the osteoclast activity.? Journal of Materials Science： Materials in Medicine， 2021，32（4）：32.

YANG J C， WANG S H， ZHANG G J， et al. Static magnetic field （2－4 T） improves bone microstructure and mechanical properties by coordinating osteoblast/osteoclast differentiation in mice.? Bioelectromagnetics， 2021，42（3）：200－211.

徐子涵，蔡佳宇，李婧，等. 姜黃素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞分化中核因子κB受體活化因子基因及蛋白表達(dá)的影響.? 安徽醫(yī)藥， 2019，23（10）：1917－1920，2121.

FU J M， ZANG Y D， ZHOU Y， et al. Exploring a novel triptolide derivative possess anti－colitis effect via regulating T cell differentiation.? International Immunopharmacology， 2021，94：107472.

LI F Q， CUI H Z， JIN X， et al. Triptolide inhibits epithelial－mesenchymal transition and induces apoptosis in gefitinib－resistant lung cancer cells.? Oncology Reports， 2020，43（5）：1569－1579.

馮悅，鐘萌，羅見春，等. 18F－FDG PET/CT技術(shù)監(jiān)測(cè)雷公藤甲素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)損傷的改善作用.? 中國藥房， 2018，29（22）：3059－3062.

ALETAHA D， NEOGI T， SILMAN A J， et al. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria： an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism colla－

borative initiative.? Arthritis and Rheumatism， 2010，62（9）：2569－2581.

蔡輝，徐子涵，商瑋，等. 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者破骨細(xì)胞分化情況及其與骨破壞的關(guān)系.? 中國免疫學(xué)雜志， 2019，35（5）：604－607.

PAN T， CHENG T F， JIA Y R， et al. Anti－rheumatoid arthritis effects of traditional Chinese herb couple in adjuvant－induced arthritis in rats.? Journal of Ethnopharmacology， 2017，205：1－7.

SATO K， TAKAYANAGI H. Osteoclasts， rheumatoid arthritis， and osteoimmunology.? Current Opinion in Rheumatology， 2006，18（4）：419－426.

張?jiān)娪辏瑥堨o，高攀，等. 雷公藤甲素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究.? 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2021，32（7）：1537－1541.

申巧燕，胡國紅，陳妙娟，等. 雷公藤多苷片聯(lián)合艾拉莫德對(duì)老年活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床療效.? 中成藥， 2021，43（2）：384－387.

鄒燕，吳憲鳴，徐亞沛，等. 雷公藤甲素干預(yù)前后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者炎癥表達(dá)、關(guān)節(jié)腫脹疼痛度的變化.? 國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)， 2016，22（12）：1687－1689.

范文強(qiáng)，呂書龍，馬玲，等. 雷公藤甲素治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制及安全性分析.? 中草藥， 2019，50（16）：3866－3871.

郭占非，齊路霞，張超，等. 基于RANKL－RANK－OPG信號(hào)通路探討雷公藤甲素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的作用機(jī)制.? 湖北民族大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2021，38（4）：45－48，52.

KIM J M， LIN C J， STAVRE Z， et al. Osteoblast－osteoclast communication and bone homeostasis.? Cells， 2020，9（9）：2073.

郭占非，齊路霞，張超，等. 雷公藤甲素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的抑制作用及對(duì)患者類風(fēng)濕因子、APN水平的影響.? 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)， 2021，44（5）：62－63，65.

林紫微，楊菲，黃天一，等. 芍藥苷干預(yù)成骨細(xì)胞凋亡抗骨質(zhì)疏松作用研究.? 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019，35（4）：426－431.

馮佳，龔書識(shí)，夏燕，等. 艾拉莫德對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血破骨細(xì)胞分化及破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響.? 中國骨質(zhì)疏松雜志， 2019，25（1）：97－102.

王貴，郭明慧，徐慧慧，等. 雷公藤甲素對(duì)高遷移率族蛋白1誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的影響. 中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào)， 2017，31（2）：102－106，130.

李忠浩，丁寧，楊全增，等. 破骨細(xì)胞中NFATc1相關(guān)調(diào)節(jié)研究進(jìn)展.? 中國骨質(zhì)疏松雜志， 2017，23（5）：695－700.

鄧麗，文振華，田鋒，等. 艾拉莫德通過TLR4/NF－κB通路抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型凋亡及炎癥反應(yīng).? 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2023，44（3）：316－321.

萬海山，代偉宏，黃澤曉，等. 蒲公英甾醇對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡及TLR4/NF－κB信號(hào)通路的影響.? 醫(yī)學(xué)研究雜志， 2020，49（11）：126－131.

鄧杰忠，楊宇生，何晉月，等. 1，25（OH）2D3通過抑制IκB/NF－κB信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞生成.? 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021，43（14）：1339－1345.

（本文編輯 于國藝）