郝良玉，郭衍冰，劉沂霖，尚麗元，馮 凱，浩佳藝，李昱潔，王改麗

吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春 130062

犬瘟熱是犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種急性、高度接觸性、嚴(yán)重發(fā)熱性傳染病。CDV 為副黏病毒科麻疹病毒屬成員，有多種細(xì)胞趨向性，導(dǎo)致全身感染。病毒粒子呈高度多形性，直徑約150 nm，通常為橢圓形或球形、不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA(ssRNA)。CDV 基因組包含15 690 個(gè)核苷酸，由6個(gè)獨(dú)立且非重疊轉(zhuǎn)錄單位(N-P-M-F-H-L)構(gòu)成基因組結(jié)構(gòu)，N 基因是核衣殼的主要組成部分，具有較強(qiáng)保守性，不僅與病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和復(fù)制相關(guān)，而且在病毒逃避宿主先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞、毒株及樣品

MDCK 細(xì)胞、犬瘟熱病毒疫苗株CDV3由中國(guó)農(nóng)科院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物病原與免疫實(shí)驗(yàn)室保存，犬細(xì)小病毒（CPV）滅活疫苗株由本實(shí)驗(yàn)室保存，犬冠狀病毒（CCV）由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑

Premix Taq 酶、反轉(zhuǎn)錄試劑均購(gòu)自Takara 公司；病毒核酸提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于天根公司；SYBR GreenI 染料購(gòu)自Roche 公司。

2 方法

2.1 設(shè)計(jì)引物

參考CDV3N 基因序列（GenBank 登錄號(hào)：EU7 26268.1）的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，P1：5'-T GAGCCACGCCACGACA-3'，P2：5'-TCCCAGGTTGACTGAG CATCT-3'，目的基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為116 bp。

2.2 擴(kuò)增N 基因

取低溫保存的CDV3病毒液，參照病毒RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒RNA，隨即將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)以cDNA 為模板，待反應(yīng)完成后向2%的瓊脂糖凝膠加入擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用于電泳檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增條件及反應(yīng)體系如表1 所示。

表1 PCR 擴(kuò)增條件及反應(yīng)體系

2.3 制備標(biāo)準(zhǔn)品

回收、純化擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD18-T 載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，接種在含氨芐抗性的固體培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)過(guò)夜，取單菌落接種于含氨芐抗性的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，PCR 鑒定質(zhì)粒后送往生工測(cè)序。利用Qubit3 熒光定量?jī)x測(cè)定質(zhì)粒濃度，并按拷貝數(shù)＝[6.02×1023×濃度(ng/μL)×10-9]/(質(zhì)粒長(zhǎng)度×660)計(jì)算拷貝數(shù)。

2.4 優(yōu)化反應(yīng)條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)梯度稀釋后作為模板，采用單變量法依次優(yōu)化引物濃度、退火溫度、復(fù)性時(shí)間等，按照SYBR GreenI 說(shuō)明書配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增體系，總體系為20 μL，多次重復(fù)以確定最佳反應(yīng)條件并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 靈敏度試驗(yàn)

以倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，陰性對(duì)照選用無(wú)菌去離子水代替模板，以Ct 值＜35 且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線的濃度作為本方法的最低檢測(cè)限度。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

不同稀釋度分別設(shè)置3 個(gè)樣品進(jìn)行熒光定量PCR 重復(fù)性試驗(yàn)，通過(guò)變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）/平均數(shù)，計(jì)算組內(nèi)和組間各Ct 值的變異系數(shù)。

2.7 特異性試驗(yàn)

用病毒RNA 提取試劑盒提取CCV 基因組RNA，隨即反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用病毒DNA 試劑盒提取CPV基因組DNA。應(yīng)用優(yōu)化SYBR GreenI 熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置陰性對(duì)照，驗(yàn)證并比較其特異性。

3 結(jié)果與分析

3.1 CDV3 N 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

提取CDV3基因組，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，利用針對(duì)N 基因所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，得到與目的片段116 bp 大小一致的擴(kuò)增片段。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

優(yōu)化后擴(kuò)增總體系20 μL，其中SYBR 酶10 μL，上、下游引物各1 μL，質(zhì)粒模板1 μL，無(wú)菌去離子水7 μL，最終反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min；熒光檢測(cè)95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，運(yùn)行40 個(gè)循環(huán)。該反應(yīng)體系可獲得良好擴(kuò)增曲線，PCR 產(chǎn)物呈單條帶。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度測(cè)定及拷貝數(shù)計(jì)算

使用Qubit3 熒光定量?jī)x測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為35.2 ng/μL，經(jīng)公式計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為2.77×1012拷貝/μL。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分 別 以2.77×101～2.77×107拷 貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，循環(huán)數(shù)（y）與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)（lgC）關(guān)系式為y=2.4857X+15.524，擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)R2=0.9865。結(jié)果表明，本方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，各稀釋度間相關(guān)性強(qiáng)，誤差較小，可準(zhǔn)確反應(yīng)目的基因的擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熔解曲線結(jié)果為單峰型曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物在77 ℃出現(xiàn)單一波峰，無(wú)引物二聚體和非特異擴(kuò)增峰。

3.5 靈敏度試驗(yàn)

倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度后進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)為2.77 拷貝/μL 時(shí)，才有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，而2.77×10-1拷貝/μL 無(wú)擴(kuò)增曲線，故本方法最低檢出限度為2.77 個(gè)拷貝。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果見表2，組內(nèi)Ct 值變異系數(shù)為0.77% ～1.31%，組間Ct 值變異系數(shù)為0.89%～1.21%，表明本方法復(fù)現(xiàn)性強(qiáng)。

表2 CDV3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 重復(fù)性結(jié)果

3.7 特異性試驗(yàn)

本方法檢測(cè)犬細(xì)小病毒DNA 及犬冠狀病毒cDNA均無(wú)熒光信號(hào)，表明方法特異性良好，對(duì)犬細(xì)小病毒及犬冠狀病毒均無(wú)特異性擴(kuò)增，不會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

4 討論與結(jié)論

犬瘟熱呈世界性分布，發(fā)病率及死亡率很高，臨床以雙相熱、胃腸炎、急性呼吸系統(tǒng)炎癥和神經(jīng)癥狀為主。其病毒宿主范圍不斷擴(kuò)大，對(duì)各地的野生動(dòng)物和瀕危物種保護(hù)構(gòu)成威脅。CDV、CPV 和CCV都可引起嚴(yán)重腹瀉，特點(diǎn)是傳染性極強(qiáng)、感染后發(fā)病速度快、死亡率高。受感染犬從患病初期無(wú)癥狀到亞臨床、急性發(fā)病期的感染癥狀十分相似，難以鑒別診斷。因此，建立快速準(zhǔn)確鑒定這些病毒的新型診斷方法一直是研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

檢測(cè)犬瘟熱病毒主要有免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)[1]、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)[2]及基因芯片檢測(cè)技術(shù)等方法。在PCR 反應(yīng)體系中加入指示DNA 片段擴(kuò)增過(guò)程的熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的積累，通過(guò)檢測(cè)病毒核酸達(dá)到檢測(cè)目的，即為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法。與探針法相比，染料法簡(jiǎn)便且成本更低，單PCR 產(chǎn)物可與多分子染料相結(jié)合，因此SYBR GreenI 染料法靈敏度高，信噪比高，樣品熒光信號(hào)強(qiáng)。檢測(cè)結(jié)束后通過(guò)熔解曲線分析產(chǎn)物，進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體的識(shí)別，以區(qū)分是否存在非特異擴(kuò)增，保證檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本試驗(yàn)針對(duì)CDV3N 基因的保守序列片段設(shè)計(jì)了特異引物，經(jīng)單變量法優(yōu)化條件建立SYBR GreenI熒光定量PCR 方法，該方法特異性強(qiáng)，與CPV、CCV 常見犬腸道病毒無(wú)交叉反應(yīng)。本方法最低檢測(cè)限為2.77 拷貝/μL，優(yōu)于傳統(tǒng)PCR 方法；組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗(yàn)Ct 值的變異系數(shù)均低于1.21%，表明本方法重復(fù)性良好，在臨床診斷中具有可行性，能夠應(yīng)用于犬瘟熱病毒檢測(cè)及分子流行病學(xué)調(diào)查。