基于核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路探討鐵包金巴布膏治療腰椎間盤突出癥的作用機制

安娟 李振宇 常裕紳 張子鳴 葉子豐 匡浩銘 匡建軍 戎寬

腰椎間盤突出癥(lumber disc herniation,LDH)是指由于椎間盤組織在外力或退行性病變的作用下,纖維環(huán)破裂,髓核向外突出,導(dǎo)致單側(cè)或雙側(cè)坐骨神經(jīng)受壓或受刺激而引起的腰背痛、下肢放射性疼痛、麻木等為主要癥狀的一種疾病[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[2],疼痛是由于髓核突出誘導(dǎo)自身免疫介導(dǎo)所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)而引發(fā)的。大部分患者的腰部疼痛呈自限性,所以臨床上多以保守治療作為本病的首選方法[3]。中醫(yī)學(xué)外治法具有操作方便、毒副作用小、療效確切等優(yōu)點,患者易于接受[4]?！独礤壩摹分赋?“外治之理,即內(nèi)治之理;外治之藥,即內(nèi)治之藥。”藥膏外貼屬于體表給藥,經(jīng)皮膚吸收后,能讓藥效直至病所。鐵包金巴布膏為湖南省中醫(yī)藥研究院匡建軍教授經(jīng)過長期臨床實踐而得出的經(jīng)驗膏方,在臨床上能有效緩解腰椎間盤突出癥患者的癥狀[5],前期也有實驗[6]表明此中藥藥膏有確切的抑制炎癥的作用,但其對LDH的作用機制尚未研究。故本研究采用自體髓核移植法制備大鼠LDH模型,探討鐵包金巴布膏的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級3月齡雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量200～250 g,購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,合格證號:SYXK(湘)2019-0009。所有大鼠均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物房大鼠實驗室,室溫23～25℃,濕度50%～60%,12小時交替明暗周期,標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。本實驗通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗藥物

鐵包金巴布膏由湖南省中醫(yī)藥研究院制劑室制備,組成:鐵包金10 g、生川烏6 g、生草烏6 g、肉桂8 g、木瓜4 g、三棱4 g、莪術(shù)4 g、木鱉子4 g、木通4 g、當(dāng)歸4 g、白蘞4 g、赤芍4 g、透骨草4 g、血竭2 g。將本處方藥物濃縮后水提,在水域恒溫中加熱攪拌均勻,再涂至無紡布上,蓋襯。規(guī)格7 cm×9.5 cm每片,每10 g藥膜中含2 g生藥材。

雙氯芬酸二乙胺乳膠劑(扶他林軟膏)(北京諾華制藥有限公司,批號:VP2727,規(guī)格20 g/支)。

1.3 主要實驗試劑與儀器

蘇木素、伊紅(珠海貝索細(xì)胞科學(xué)技術(shù)有限公司,貨號分別為BA4097、BA4098);大鼠腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)試劑盒(睿信生物科技有限公司,貨號分別為RX302058R、RX302869R);超純總RNA提取試劑盒、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海近岸生物科技有限公司,貨號分別為E096-01A、E047-01B)。PW-812型全自動酶標(biāo)洗板機、MB-530型多功能酶標(biāo)分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司),GL-88B型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司),5810R型臺式高速離心機(Eppendorf 艾本德公司),HS50型病理切片掃描儀,CFX96型Real-Time PCR檢測儀(美國BIO-RAD伯樂公司)。

1.4 實驗方法

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,采用隨機數(shù)字表法從40只大鼠中抽取10只作為正常組。剩余30只建立LDH大鼠模型:參照Cho HK等[7]自體髓核移植法建立動物模型,術(shù)后切口處理:手術(shù)部位涂抹少量紅霉素,避免術(shù)后傷口愈合過程中瘙癢大鼠自行撕咬;傷口清潔敷料包扎后用網(wǎng)套固定,避免大鼠過度活動導(dǎo)致傷口暴露感染。術(shù)后3天內(nèi)所有大鼠均左側(cè)臀部肌肉注射青霉素,400000 IU/kg,1次/日,以預(yù)防感染。正常組不做處理。術(shù)后觀察大鼠情況,若存在右下肢腫脹,行走時無力代償性拖動或出現(xiàn)跛行即表明造模成功。造模成功后第3天,采用隨機數(shù)字表法將其分為模型組、鐵包金巴布膏組、陽性藥物組3組,每組10只,進(jìn)行給藥。按照體表面積比換算出鐵包金巴布膏的大小為1.54 cm×2.09 cm[8],外貼L5椎旁,每日上午1次,6小時后蘸生理鹽水擦凈;陽性藥物組以扶他林軟膏外涂L5椎旁,每日上午1次,6小時后蘸生理鹽水擦凈;正常組及模型組均以生理鹽水涂抹,每日上午1次,共給藥30天。

1.5 神經(jīng)功能測定

神經(jīng)功能評分依照Siegal的方法[9],分別觀察大鼠干預(yù)前、干預(yù)第10天、干預(yù)第20天、干預(yù)第30天右側(cè)后肢的神經(jīng)功能情況。該功能評分共有6級:0級,運動正常,記2分;1級,甩尾無力,記4分;2級,后肢無力,行走有輕度困難,記6分;3級,后肢無力,行走時存在明顯不穩(wěn)定性,記8分;4級,站立不穩(wěn),但后肢可移動,記10分;5級,癱瘓,后肢無自主移動,記12分。

1.6 取材

各組大鼠給藥干預(yù)30天后,禁食1小時,麻醉大鼠,腹主動脈采集血液,每只采取6 mL左右,并暴露右側(cè)L5神經(jīng)根,冷凍臺上取受壓神經(jīng)根后處死大鼠。所取血液常溫靜置45分鐘后,4℃,3000 r/min離心15分鐘取上清,通過液氮轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存用于酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。再取L5神經(jīng)根組織,分為2份,一份存放在凍存管中,-80℃冰箱保存用于實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)檢測,另外一份用多聚甲醛固定用于蘇木精-伊紅(hematoxylin -eosin, HE)染色檢測。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 HE染色觀察神經(jīng)根的形態(tài)學(xué) 先將取下的L5神經(jīng)根組織放入4%多聚甲醛中固定2天后脫鈣,再進(jìn)行石蠟包埋,切片(5 μm),脫蠟后HE染色。每張切片均按要求嚴(yán)格進(jìn)行,最后中性樹膠封片,常溫晾干后在顯微鏡下觀察大鼠L5神經(jīng)根形態(tài)的變化。

1.7.2 ELISA檢測血清炎癥因子IL-1β及TNF-α含量 取待測血清,冰上解凍,按照說明書進(jìn)行操作,不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品各加50 μL,設(shè)空白孔及待測樣品孔,將板放置37℃溫箱孵育后,加底物A、底物B各50 μL,顯色后再加終止液50 μL,終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀中讀取并記錄OD值。

1.7.3 qRT-PCR檢測髓樣細(xì)胞分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κ B,NF-κB)P65的mRNA表達(dá)水平 將凍存的大鼠神經(jīng)根組織快速剪斷后轉(zhuǎn)移到一個干凈的1.5 mL離心管中,加入500 μL Buffer TL,用研磨棒研磨,再加500 μL Buffer TL、200 μL lBuffer EX及70%無水乙醇等混勻攪拌,取混合液600 μL加入至核酸純化柱中,反復(fù)離心后,棄純化柱,留洗脫的RNA。提取總RNA后,將純化的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,均按說明書的步驟進(jìn)行。最后在熒光定量器中設(shè)置反應(yīng)時間:95℃ 1分鐘,95℃ 20秒,60℃ 20秒,72℃ 30秒。查看溶解曲線圖,統(tǒng)計Ct值,采用2-△△Ct計算法計算各組基因的相對表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參引物,所有引物均在上海生工生物股份有限公司合成,詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

干預(yù)前,與模型組比較,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。在干預(yù)第10、20和30天,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組神經(jīng)功能評分較模型組下降(P<0.05)。鐵包金巴布膏組、陽性藥物組在治療第10、20和30天的神經(jīng)功能評分均較干預(yù)前下降(P<0.05)。提示干預(yù)前大鼠LDH模型神經(jīng)功能評分升高,經(jīng)鐵包金巴布膏干預(yù)后,神經(jīng)功能評分下降。見表2。

表2 各組LDH模型大鼠干預(yù)前后的神經(jīng)功能評分比較分)

2.2 各組大鼠神經(jīng)根形態(tài)觀察

HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠神經(jīng)根結(jié)構(gòu)形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞核均勻,核仁清晰,胞漿內(nèi)的尼氏小體均勻排列;模型組結(jié)構(gòu)形狀不規(guī)則,細(xì)胞腫脹,細(xì)胞漿內(nèi)存在較多的空泡狀改變,尼氏小體排列不均;與模型組相比,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組結(jié)構(gòu)形態(tài)較規(guī)則,細(xì)胞核較均勻,胞漿空泡狀數(shù)量較少,尼氏小體排列較均。見圖1。

注:A 正常組;B 模型組;C 鐵包金巴布膏組;D 陽性藥物組。

2.3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比較

與正常組比較,模型組、鐵包金巴布膏組、陽性藥物組大鼠血清IL-1β及TNF-α含量水平均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組的大鼠血清IL-1β及TNF-α含量水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與鐵包金巴布膏組比較,陽性藥物組的大鼠血清IL-1β及TNF-α含量水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組LDH模型大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量比較

2.4 各組大鼠神經(jīng)根組織NF-κB p65及MyD88的mRNA表達(dá)比較

與正常組比較,模型組、鐵包金巴布膏組、陽性藥物組NF-κB p65及MyD88的mRNA表達(dá)均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組NF-κB p65及MyD88的mRNA表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與鐵包金巴布膏組比較,陽性藥物組NF-κB p65及MyD88的mRNA表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組LDH模型大鼠神經(jīng)根組織NF-κB p65、MyD88的mRNA表達(dá)比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)將LDH歸屬于“腰痛”“痹證”范疇,是由于受風(fēng)寒濕之邪困阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致經(jīng)氣不行,氣滯而血瘀,加之正氣不足,邪氣乘虛而入引發(fā)的腰痛。本病的治療以祛風(fēng)除濕、扶正祛瘀為主。鐵包金巴布膏主要的藥物包括鐵包金、生川烏、生草烏、肉桂、三棱、莪術(shù)、木瓜等,方中鐵包金又名多花勾兒茶,始載于《嶺南采藥錄》,其性平,味苦、澀,具有益氣固腎、消腫解毒、化瘀止血等功效。藥理學(xué)研究表明其具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化的作用,這和鐵包金內(nèi)含有黃酮類和多酚類成份密切相關(guān)[10]。生川烏、生草烏性熱、味苦,具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒止痛等功效。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),這兩味藥能降低炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α的表達(dá),抗炎效果明顯[11-12]。肉桂,味辛、甘,性大熱,具有溫經(jīng)通脈、散寒止痛等功效。有研究者應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),發(fā)現(xiàn)肉桂通過正調(diào)控一氧化氮生物合成過程、細(xì)胞遷移、褐色脂肪細(xì)胞分化等治療LDH,與其抗氧化、抗炎抗菌的藥理作用一致[13]。三棱味苦,性平;莪術(shù)味苦,性溫,均具有行氣止痛等功效,是常用的藥對。三棱乙酸乙酯萃取物的鎮(zhèn)痛效果最明顯,三棱莪術(shù)復(fù)方的抗炎活性更顯著[14]。木瓜味酸,性溫,具有舒筋活絡(luò)等功效,有藥理研究顯示木瓜的提取物木瓜苷有較強的鎮(zhèn)痛抗炎及提高免疫力的作用[15]。扶他林軟膏是常用的外搽藥,其通過抑制環(huán)氧酶,阻斷前列腺素的合成,減少外周痛覺感受器刺激而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,是恰當(dāng)?shù)年栃运幬铩?/p>

NF-κB信號通路是一種經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)通路,當(dāng)NF-κB信號通路激活后,可誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá),加重靶器官炎癥反應(yīng)[16]。有學(xué)者的研究證實,NF-κB信號傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)慢性炎癥和壓力誘導(dǎo)的椎間盤退變中起重要作用[17]。NF-κB p65似乎是激活促炎介質(zhì)表達(dá)的主要途徑,因此阻斷此種途徑特有的p65亞基可能是抑制炎性的最佳策略[18]。MyD88是Toll樣受體和1L-1R成員炎癥信號中經(jīng)典的銜接蛋白[19],Liu等[20]研究者使用MyD88條件性敲除小鼠,建立慢性壓迫性神經(jīng)痛模型,發(fā)現(xiàn)慢性壓迫損傷誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中MyD88和趨化因子C-C基序配體2表達(dá)的上調(diào),巨噬細(xì)胞浸潤到背根神經(jīng)節(jié)中,以及野生型小鼠脊髓背角中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化,但在條件性基因敲除小鼠中未見明顯變化,說明MyD88能上調(diào)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),并維持持續(xù)的神經(jīng)病理性疼痛。

此前的實驗研究顯示,鐵包金巴布膏可降低LDH大鼠模型的脊背根神經(jīng)根的炎性細(xì)胞因子磷脂酶A2的活性,減緩腰椎間盤突出癥大鼠的癥狀[6],但未具體研究作用機制。磷脂酶A2是一種炎癥介質(zhì)和致痛物質(zhì),炎癥作為一種正常的防御反應(yīng),能應(yīng)對病原微生物及外部損傷,而炎癥應(yīng)答為機體識別受體識別病原微生物分子模式及外部損傷分子模式,通過啟動相關(guān)的信號傳導(dǎo),可激活轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控基因表達(dá),最后引發(fā)炎癥,NF-κB就為參與炎癥反應(yīng)相關(guān)表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一[21]。故此次研究以NF-κB為切入點,更深入的探討鐵包金巴布膏治療LDH大鼠的作用機制是否與調(diào)節(jié)NF-κB信號通路有關(guān)。

本實驗結(jié)果表明,干預(yù)前后各時間點模型組、鐵包金巴布膏組和陽性藥物組大鼠神經(jīng)功能評分依次降低,提示經(jīng)鐵包金巴布膏和陽性藥物治療后大鼠損傷的神經(jīng)組織逐漸修復(fù);HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠神經(jīng)根結(jié)構(gòu)不規(guī)則,神經(jīng)元細(xì)胞腫脹,胞漿內(nèi)存在較多空泡狀改變,經(jīng)鐵包金巴布膏和陽性藥物治療后此類病理改變較少,提示鐵包金巴布膏可減輕大鼠受損腰部神經(jīng)根病理變化;鐵包金巴布膏組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量及神經(jīng)根組織中的NF-κB p65、MyD88的mRNA相對表達(dá)量顯著下降,提示鐵包金巴布膏通過下調(diào)NF-κB信號通路中相關(guān)分子的表達(dá)水平,減少炎癥因子的釋放,起到鎮(zhèn)痛的作用。

綜上所述,鐵包金巴布膏治療LDH可能與抑制NF-κB信號通路相關(guān),這可能是鐵包金巴布膏起到治療作用的機制之一。本實驗應(yīng)用的是中藥復(fù)方,其膏藥成分復(fù)雜,作用機制存在多樣性,且僅驗證了鐵包金巴布膏對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用,無法全面系統(tǒng)地揭示鐵包金巴布膏治療LDH的科學(xué)內(nèi)涵。因此,今后將進(jìn)一步探討鐵包金巴布膏治療LDH的其它參與調(diào)節(jié)的信號通路,并探索出其治療LDH的主要活性成分。