徐煜城 張志強(qiáng)

[摘要]?目的?探討百草枯中毒后機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)變化及受影響的信號(hào)通路。方法?采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)檢測百草枯中毒大鼠肺組織中差異表達(dá)蛋白，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因本體論（gene?ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）分析。結(jié)果?百草枯中毒大鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)84種差異蛋白，其中48種上調(diào)，36種下調(diào)。在百草枯中毒早期，差異蛋白主要存在于細(xì)胞外區(qū)域，主要涉及代謝和應(yīng)激，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、2-氧代羧酸代謝途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑和金黃色葡萄球菌感染途徑4條信號(hào)通路受到明顯影響。結(jié)論?差異蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在百草枯致肺損傷早期即可產(chǎn)生變化，可能與炎癥損傷和肺纖維化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]?百草枯中毒；同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)；蛋白質(zhì)組分析；急性肺損傷

[中圖分類號(hào)]?R595.4??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.018

GO?and?KEGG?analysis?for?paraquat?posioned?rats

XU?Yucheng，?ZHANG?Zhiqiang

Department?of?Emergency，?Binzhou?Medical?University?Hospital，?Binzhou?256600，?Shandong，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?changes?of?protein?expression?and?the?affected?signal?pathway?after?paraquat?poisoning.?Methods?The?isobaric?tags?for?relative?and?absolute?quantitation?technique?were?used?to?detect?the?differentially?expressed?proteins?in?the?lung?tissues?of?paraquat?poisoning?rats，?and?the?gene?ontology?（GO）?functional?enrichment?analysis?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?analysis?were?carried?out?for?these?differential?expressed?proteins.?Results?Eighty-four?different?proteins?were?found?in?lung?tissue?of?paraquat?poisoning?rats，?among?which?48?were?up-regulated?and?36?down-regulated.?In?the?early?stage?of?paraquat?poisoning，?differential?proteins?mainly?existed?in?extracellular?regions?and?were?mainly?involved?in?metabolism?and?stress.?Four?signaling?pathways，?including?complement?and?coagulation?pathway，?2-oxycarboxylic?acid?metabolic?pathway，?neuroactive?ligand-receptor?interaction?pathway?and?Staphylococcus?aureus?infection?pathway，?were?significantly?affected.?Conclusion?Differential?proteins?and?signal?transduction?pathways?can?be?changed?in?the?early?stage?of?paraquat?induced?lung?injury，?which?may?be?related?to?inflammatory?injury?and?pulmonary?fibrosis.

[Key?words]?Paraquat?poisoning;?Isobaric?tags?for?relative?and?absolute?quantitation?technique;?Proteomic?analysis;?Acute?lung?injury

在過去的幾十年里，超過120個(gè)國家使用百草枯除草，尤其是亞洲。誤食百草枯對(duì)患者的危害極大[1]。百草枯對(duì)成年人的致死劑量為20～40mg/kg，百草枯誤食后，大部分被小腸吸收，經(jīng)血液轉(zhuǎn)運(yùn)至多個(gè)器官并導(dǎo)致功能障礙[2]。因百草枯的特殊結(jié)構(gòu)，肺泡上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞中特有的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)體會(huì)主動(dòng)攝入，并使其在肺中蓄積[3]。實(shí)驗(yàn)表明，通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)最終肺中百草枯濃度可達(dá)血漿的10倍[4-5]。在中毒初期，肺組織受損，隨即出現(xiàn)肺水腫及炎癥細(xì)胞浸潤[6]；在5d至數(shù)周的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)肺Ⅱ型上皮細(xì)胞代償增生及肺纖維化[7-8]。因無特效解毒藥，治療主要通過催吐、利尿、洗胃和血液灌流以減少其吸收或增強(qiáng)其代謝[9-10]。為研究百草枯中毒動(dòng)物肺組織中蛋白質(zhì)含量的變化，筆者通過同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric?tags?for?relative?and?absolute?quantitation，iTRAQ）技術(shù)篩選百草枯染毒大鼠肺組織中的差異蛋白。通過生物信息學(xué)分析差異蛋白，找出與其相關(guān)的信號(hào)通路，為后續(xù)進(jìn)一步研究百草枯中毒所致的急性肺損傷提供檢測指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)方向。

1??材料與方法

1.1??中毒模型建立

本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：20220128-98）。于濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)大鼠18只，自由飲食，正式實(shí)驗(yàn)前于SPF條件下飼養(yǎng)7d。將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（T1、T2、T3）和對(duì)照組（C1、C2、C3），每組各3只。參照前期基礎(chǔ)研究，實(shí)驗(yàn)組大鼠行腹腔注射百草枯30mg/kg，對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水[11-12]。給藥后大鼠在常規(guī)環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)1周，到采集標(biāo)本前無大鼠死亡，實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、口唇發(fā)紺、食欲下降，與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，考慮建模成功[13]。

1.2??肺組織蛋白提取

處死大鼠，收集每只大鼠的右肺中葉。每一組的3個(gè)肺組織剪碎后混為1管。使用試劑盒提取每一組肺組織的蛋白質(zhì)，并對(duì)其所含蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定。

1.3??iTRAQ標(biāo)記與肽段鑒定

從每一組中取200μg蛋白質(zhì)預(yù)處理后于37℃下酶解12h獲得肽段。各組取100μg肽段，按照試劑盒說明書進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記。將標(biāo)記后的樣本復(fù)溶，漩渦震蕩，離心后取上清液，使用高效液相色譜法分離，取60個(gè)1.5ml?EP管，從第5分鐘開始依次收集洗脫液。將收集到的洗脫液真空冷凍干燥離心，為使肽段分布均勻，使用5μl?0.5%的甲酸重溶EP管中的樣品并交叉混合，再次離心，取上清液10μl，每份樣品采用納升級(jí)超高效液相色譜儀進(jìn)行分離后使用質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。最后使用Proteome?Discover軟件查找每種蛋白質(zhì)的信息。根據(jù)FC<0.667或FC>1.5和P<0.05找到差異蛋白。獲得所有蛋白質(zhì)信息后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體論（gene?ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）分析。

2??結(jié)果

2.1??差異蛋白鑒定結(jié)果

獲得9009個(gè)肽段，通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，鑒定出84種差異表達(dá)蛋白，其中48種高表達(dá)，36種低表達(dá)，見圖1、圖2。此外，上調(diào)的蛋白質(zhì)差異較大，最多可達(dá)4倍，其中前4個(gè)上調(diào)最明顯的蛋白質(zhì)分別是A0A0G2K9B1（LOC299282）、Q5PQU1（Kng2）、G3V729（Prg2）及A0A0G2JVQ5（Kng1）。

2.2??GO功能富集分析

對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，差異蛋白主要涉及生物過程、分子功能和細(xì)胞成分。根據(jù)含有的差異蛋白數(shù)量，選取前30個(gè)GO條目，繪制氣泡圖，見圖3。在百草枯中毒早期，差異蛋白主要存在于細(xì)胞外區(qū)域，主要涉及代謝和應(yīng)激，而分子功能所涉及的差異蛋白則較少。

2.3??KEGG分析

為明確差異蛋白的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果顯示4種通路的差異蛋白均上調(diào)，其中Ko04610（補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路）中差異蛋白數(shù)量最多，分別為K03990（補(bǔ)體C3）、K01313（凝血因子Ⅱ）、K01315（纖溶酶原）、Kng（激肽原）和K01328（凝血因子Ⅻ）。Ko01210（2-氧代羧酸代謝途徑）富集到2個(gè)差異蛋白，分別為K00031（異檸檬酸脫氫酶1）和K00814（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）。Ko04080（神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑）富集到2個(gè)差異蛋白，分別為K01315和K01313。Ko05150（金黃色葡萄球菌感染途徑）富集到2個(gè)差異蛋白，分別為K01315和K03990，見圖4。

3??討論

4種上調(diào)最明顯的蛋白均涉及炎癥反應(yīng)和促細(xì)胞凋亡，特別是差異倍數(shù)最高的A0A0G2K9B1，其可減輕炎癥反應(yīng)并減少細(xì)胞凋亡，推測這是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制[14]。其他3種差異蛋白均可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)并促進(jìn)纖維化進(jìn)程[15-16]。研究表明，百草枯進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞后，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中充當(dāng)電子載體，主要攻擊細(xì)胞的線粒體膜，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，并通過改變線粒體膜電位促使細(xì)胞凋亡[2，17]。GO功能富集分析進(jìn)一步印證上述觀點(diǎn)。KEGG分析提示補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)通路所包含的差異蛋白最多，考慮該途徑受到的影響最大，在百草枯中毒中起主要作用，補(bǔ)體系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，同時(shí)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活與炎癥和免疫疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，補(bǔ)體可通過3條不同的途徑激活：經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑，3條途徑共同的起始部分為C3的裂解和活化，經(jīng)激活后產(chǎn)生補(bǔ)體激活產(chǎn)物和膜攻擊復(fù)合物[18-19]。近期研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒所致肺部感染的患者，其體內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)被過度激活，通過抑制補(bǔ)體可減少血栓形成及減輕急性肺損傷[20]。綜上，筆者推測，C3作為補(bǔ)體級(jí)聯(lián)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可能在百草枯中毒所致的急性肺損傷中發(fā)揮重要作用，如增強(qiáng)炎癥反應(yīng)及對(duì)細(xì)胞的損傷，既往有研究表明降低C3表達(dá)可明顯抑制肺中性粒細(xì)胞浸潤和降低促炎細(xì)胞因子水平[21]。

其余三條通路，筆者認(rèn)為神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑最有意義。在該途徑中，與激動(dòng)蛋白酶激活受體（proteinase-activated?receptor，PAR）相關(guān)的蛋白顯著上調(diào)，PAR共有4種亞型，PAR1作用最為顯著，在急性肺損傷中，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)被激活，同時(shí)交叉激活PAR[22-23]。PAR1的激活可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的募集、細(xì)胞因子的過度釋放和內(nèi)皮屏障的破壞，增加肺部炎癥反應(yīng)，PAR1還可通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化和介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成進(jìn)一步增強(qiáng)肺纖維化[24]。研究表明，對(duì)敲除PAR1小鼠使用博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化，其纖維化程度及肺部炎癥明顯減輕[25]。余下的兩條通路，在百草枯中毒中的作用沒有明確文獻(xiàn)支持，且其中的差異蛋白在其他通路也有表達(dá)，推測是匹配算法的機(jī)制，故暫不予討論。

通過百草枯中毒小鼠的差異蛋白分析發(fā)現(xiàn)，體液免疫、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路的過度激活在百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷的早期發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些通路除增加肺部炎癥損傷外還可導(dǎo)致纖維化的進(jìn)程發(fā)展，即出現(xiàn)急性肺損傷的同時(shí)肺纖維化即已經(jīng)發(fā)生，這方面的進(jìn)一步研究有望為百草枯中毒的治療提供新的策略和方向。

綜上，基于iTRAQ技術(shù)在百草枯中毒大鼠中鑒定出84個(gè)差異蛋白和4個(gè)潛在的信號(hào)通路，這些通路及蛋白提示早期急性肺損傷伴隨肺纖維化出現(xiàn)，可能是判斷疾病嚴(yán)重程度或制定診療計(jì)劃的有價(jià)值的標(biāo)志物。

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