李季青 江超 段聰聰 王濤 謝長好 侯傳云 李志軍

[摘要]?目的?探究臨床常用的3種不同方法全自動自身抗體分析儀檢測抗核抗體譜結果的差異。方法?選取2021年4月至5月在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院確診為系統(tǒng)性自身免疫?。╝utoimmune?disease，AID）的患者72例作為AID組，留取患者相關項目檢測剩余的血清樣本72份，同時按照性別相同、年齡相近的原則，選取同期體檢無AID的31例健康者作為對照組，留取血清樣本31份。采用目前臨床常用的進口全自動流式點陣發(fā)光免疫分析儀（方法A）、國產(chǎn)全自動流式熒光發(fā)光分析儀（方法B）和多重液相芯片免疫分析儀（方法C）分別檢測兩組患者血清樣本中的10種抗核抗體，比較3種方法的檢測陽性率，分析其陽性符合率、陰性符合率、敏感度、特異性等。為了幫助選擇出對臨床檢驗更可靠的方法學及檢驗設備，對3種方法進行兩兩比較，進行一致性評價。結果?方法A、B和C與間接免疫熒光法檢測的AID組陽性檢出率均顯著高于對照組（P<0.05）。采用方法A、B和C檢測對照組10種抗體的結果均為陰性，AID組10種抗體檢測結果中，方法B、C檢測抗Sm抗體和抗SSA60抗體的陽性率均顯著低于方法A（P<0.05），3種方法檢測的其他抗體陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在方法A與方法B的一致性分析中，二者的平均符合率為92.22%，有1項一致性差，3項一致性一般，6項一致性好；方法A與方法C的一致性分析中，二者的平均符合率為93.89%，有5項一致性一般，5項一致性好；方法B與方法的一致性分析中，二者的平均符合率為92.65%。有1項一致性差，4項一致性一般，5項一致性好。結論?目前兩種國產(chǎn)品牌的全自動流式熒光發(fā)光分析儀和多重液相芯片免疫分析儀與進口全自動流式點陣發(fā)光免疫分析儀檢測自身抗體總符合率較高，但是檢測血清抗Sm抗體的一致性較差，應密切結合臨床與其他實驗室指標綜合判斷。

[關鍵詞]?自身免疫?。豢购丝贵w；抗核抗體譜；多重微球流式熒光免疫技術；多重液相芯片免疫分析技術

[中圖分類號]?R466.11??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.002

Analysis?of?the?results?of?antinuclear?antibody?spectrum?detected?by?three?different?methods?of?automatic?autoantibody?analyzer

LI?Jiqing1，?JIANG?Chao1，?DUAN?Congcong1，?WANG?Tao1，2，?XIE?Changhao1，2，?HOU?Chuanyun1，?LI?Zhijun1，2

1.Department?of?Rheumatology?and?Immunology，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Bengbu?Medical?College，?Bengbu?233000，?Anhui，?China;?2.Anhui?Province?Key?Laboratory?of?Immunology?in?Chronic?Diseases，?Bengbu?233000，?Anhui，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?differences?in?the?results?of?the?antinuclear?antibody?（ANA）?spectrum?of?the?three?different?methods?of?automatic?autoantibody?analyzer?commonly?used?in?clinical?practice.?Methods?A?total?of?72?patients?diagnosed?with?systemic?autoimmune?disease（AID）?in?the?First?Affiliated?Hospital?of?Bengbu?Medical?College?from?April?to?May?2021?were?selected?as?the?AID?group，?and?72?serum?samples?remaining?from?the?patients?relevant?tests?were?retained，?while?31?healthy?individuals?without?AID?in?the?same?period?of?physical?examination?were?selected?as?the?control?group?according?to?the?principle?of?same?gender?and?similar?age，?and?31?serum?samples?were?retained.?The?imported?automatic?flow-type?lattice?luminescence?immunoanalyzer?（method?A），?domestic?automatic?flow-type?fluorescence?analyzer?（method?B）?and?multiple?liquid?phase?chip?immunoanalyzer?（method?C）?were?used?to?detect?10?antinuclear?antibodies?in?the?serum?samples?of?two?groups?of?patients.?The?positive?detection?rates?of?the?three?methods?were?compared，?and?their?positive?compliance，?negative?compliance，?sensitivity?and?specificity?were?analyzed.?In?order?to?help?select?methodologies?and?test?equipment?that?are?more?reliable?for?clinical?testing，?a?two-by-two?comparison?of?the?three?methods?was?conducted?for?consistency?evaluation.?Results?The?positive?detection?rate?of?the?AID?group?by?methods?A，?B?and?C?and?indirect?immunofluorescence?were?significantly?higher?than?those?of?the?control?group?（P<0.05）.?The?results?of?the?10?antibodies?detected?in?the?control?group?by?methods?A，?B?and?C?were?all?negative.?Among?the?10?antibodies?detected?in?the?AID?group，?the?positive?detection?rates?of?anti-Sm?antibody?and?anti-SSA60?antibody?by?methods?B?and?C?were?significantly?lower?than?those?of?method?A?（P<0.05），?and?the?differences?were?not?statistically?significant?when?comparing?the?positive?rates?of?other?antibodies?detected?by?the?3?methods?（P>0.05）.?In?the?concordance?analysis?between?method?A?and?method?B，?the?mean?concordance?rate?between?the?two?was?92.22%，?with?one?poor?concordance，?three?fair?concordances?and?six?good?concordances;?in?the?concordance?analysis?between?method?A?and?method?C，?the?mean?concordance?rate?between?the?two?was?93.89%，?with?five?fair?concordances?and?five?good?concordances，?and?in?the?concordance?analysis?between?method?B?and?method?92.65%.?There?was?one?poor?concordance，?four?fair?concordances?and?five?good?concordances.?Conclusion?At?present，?the?total?coincidence?rate?of?automatic?flow?fluorescence?luminescence?analyzer?and?multi-liquid?chip?immunoanalyzer?of?two?domestic?brands?is?higher?than?that?of?the?imported?automatic?flow?dot?matrix?immunoanalyzer.?However，?the?consistency?of?detecting?serum?anti-Sm?antibodies?is?poor，?and?the?comprehensive?judgment?should?be?closely?combined?with?clinical?and?other?laboratory?indicators.

[Key?words]?Autoimmune?disease;?Antinuclear?antibody;?Antinuclear?antibody?spectrum;?Multiplex?bead-based?flow?fluorescence?immunoassay;?Multiplex?liquidchip?immunoassay?technology

抗核抗體（antinuclear?antibody，ANA）一般是指1組抗核酸（nucleic?acid）和核蛋白抗體的總稱。ANA可特征性地出現(xiàn)于許多自身免疫性疾病中，對自身免疫?。╝utoimmune?disease，AID）的診斷及鑒別診斷、病情評估與療效監(jiān)測等具有重要的臨床應用價值[1]?？购丝贵w檢測的經(jīng)典方法為間接免疫熒光法（indirect?immunofluorescence，IIF），被認為是檢測ANA的金標準[2-4]。IIF檢測結果陽性后再進行成分分析，即位ANA譜測定[5]。ANA譜測定一般采用蛋白質免疫印跡法，該方法人工操作煩瑣，試驗時間長，對檢驗人員技術要求較高，結果只能定性或半定量。為滿足臨床需求，近年來國內外相繼研發(fā)了一些如流失熒光、多重磁珠等新技術應用于ANA譜檢測[6-7]，但是這些新技術應用的確切效果尚在驗證中。為了解目前臨床常用于ANA譜測定的新技術及其主要型號檢測儀的檢測效能與差異，給臨床選用提供參考依據(jù)，本研究采用目前國內臨床應用的3種主流型號免疫分析儀對臨床常用ANA譜中10種常用指標進行了檢測與分析。

1??資料與方法

1.1??一般資料

選取2021年4月至5月在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院確診為系統(tǒng)性自身免疫?。╝utoimmune?disease，AID）的患者72例作為AID組，留取患者相關項目檢測剩余的血清樣本72份，同時按照性別相同、年齡相近的原則，選取同期體檢無AID的31例健康者作為對照組，留取血清樣本31份。納入標準：①符合《2020年中國系統(tǒng)性紅斑狼瘡診療指南》[8]診斷標準；②符合《干燥綜合征診斷及治療指南》[9]診斷標準；③符合Bohan和Peter于1975年提出的多發(fā)性肌炎和皮肌炎診斷標準[10]；④符合1987年修訂的類風濕關節(jié)炎（rheumatoid?arthritis，RA）診斷標準分類舊標準和《2018中國類風濕關節(jié)炎診療指南》[11]；⑤符合《系統(tǒng)性硬化病診斷及治療指南》[12]的診斷標準。排除標準：①非首次確診系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic?lupus?erythematosus，SLE）、原發(fā)性干燥綜合征（primary?dryness?syndrome，pSS）、皮肌炎/多發(fā)性肌炎、RA和系統(tǒng)性硬化癥，以及近期有過甲氨蝶呤、青霉胺、環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑及激素用藥治療史；②妊娠或哺乳期婦女；③精神疾病患者；④惡性腫瘤。觀察組中SLE患者22例、pSS?8例、其他結締組織病42例。兩組患者年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：倫科批字[2021]第126號）。

1.2??儀器與試劑

方法A采用美國伯樂BioPlex?2200全自動流式點陣發(fā)光免疫分析儀及匹配的ANA譜試劑（抗ds-DNA抗體、抗核糖體P蛋白抗體、抗染色質抗體、抗Sm抗體、抗SmRNP抗體、抗RNP抗體、抗RNPA抗體、抗RNP68抗體、抗SSA60抗體、抗SSA52抗體、抗SSB抗體、抗Scl-70抗體、抗CENP-B抗體、抗Jo-1抗體）、質控、校準品進行檢測。方法B采用上海透景TESMI?F4000全自動流式熒光發(fā)光分析儀及匹配的ANA譜試劑（抗ds-DNA抗體、抗核糖體P蛋白抗體、抗核小體抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗組蛋白抗體、抗線粒體M2抗體、抗SSA60抗體、抗SSA52抗體、抗SSB抗體、抗Scl-70抗體、抗CENP-B抗體、抗Jo-1抗體、抗補體1q抗體、抗多發(fā)性肌炎硬皮病抗原抗體）、抗增殖細胞核抗原抗體、質控、校準品進行檢測。方法C采用珠海麗珠MCLIA-800?Plus全自動多重液相芯片免疫分析儀及匹配的ANA譜試劑（抗ds-DNA抗體、抗核糖體P蛋白抗體、抗核小體抗體、抗Sm抗體，抗U1-snRNP抗體、抗組蛋白抗體、抗線粒體M2抗體、抗SSA60抗體、抗SSA52抗體、抗SSB抗體、抗Scl-70抗體、抗CENP-B抗體、抗Jo-1抗體、抗Ku抗體、抗Mi-2抗體、抗多發(fā)性肌炎硬皮病抗原抗體）、抗增殖細胞核抗原抗體、質控、校準品（方法C）進行檢測。

1.3??方法

兩組患者的血清樣本均凍存于–80℃冰箱中，3個月內解凍，一次性完成有關指標檢測。對兩組患者所有血清樣本進行ANA間接免疫熒光檢測，再分別用3種不同的方法對ANA譜進行檢測。其中3種ANA譜檢測中，有一個項目檢測結果陽性即判斷為陽性結果，再選取上述3種方法共有的檢測項目，即抗ds-DNA抗體、抗核糖體P蛋白抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA60抗體、抗SSA52抗體、抗SSB抗體、抗Scl-70抗體，抗CENP-B抗體、抗Jo-1抗體10個指標作為主要觀測指標，所有操作嚴格按照各方法的操作說明書進行。比較3種方法的檢測陽性率，分析其陽性符合率、陰性符合率、敏感度、特異性等。同時，為了幫助選擇出對臨床檢驗更可靠的方法學及檢驗設備，對3種方法兩兩比較，進行一致性評價。

1.4??統(tǒng)計學方法

采用SPSS?26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Kappa分析進行一致性評價，Kappa<0.4表示一致性差，0.4≤Kappa<0.75表示一致性一般，Kappa≥0.75表示一致性好，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2??結果

2.1??不同方法的ANA陽性檢出率比較

4種方法檢測的AID組陽性檢出率均顯著高于對照組（P<0.05），見表1。

2.2??三種不同方法檢測AID組主要觀測指標的陽性率比較

采用方法A、B、C檢測對照組10種抗體的結果均為陰性。采用3種方法檢測AID組10種抗體，其中方法B、C檢測抗Sm抗體和抗SSA60抗體的陽性率均顯著低于方法A（P<0.05）；3種方法檢測的其他抗體陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.3??三種方法檢測結果的一致性分析

對方法A與方法B檢測結果進行一致性分析，兩種方法檢測10項指標的平均符合率為92.22%，抗Sm抗體Kappa<0.4，一致性差；抗RNP抗體、抗SSA60抗體和抗Scl-70抗體，0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；其他抗體的Kappa≥0.75，一致性好。對方法A與方法C檢測結果進行一致性分析，兩種方法檢測10項指標的平均符合率為93.89%，抗ds-DNA抗體、抗核糖體P蛋白抗體、抗Sm抗體抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體，0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；其他抗體的Kappa≥0.75，一致性好。對方法B與方法C檢測結果進行一致性分析，兩種方法檢測10項指標的平均符合率為92.65%，抗Sm抗體Kappa<0.4，一致性差；抗ds-DNA抗體、抗RNP抗體、抗SSA60抗體、抗Jo-1抗體，0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；其他抗體的Kappa≥0.75，一致性好，見表3～5。

3??討論

在自身免疫性疾病診治中，ANA譜檢測具有重要的作用，不僅能夠協(xié)助診斷和鑒別診斷，而且是相關疾病的特異性抗體，如抗ds-DAN抗體，抗Sm抗體等，其在治療監(jiān)測、病情評估都有重要臨床價值[13-14]。隨著醫(yī)學檢驗技術的發(fā)展，ANA譜檢測技術逐漸從原先的只能定性、時間長、不能隨機上樣、不易自動化發(fā)展為定量、高通量，即時檢測、無需等待、全智能化和標準化檢測。

本研究采用了目前3種最新的全自動檢測平臺，方法A為全自動流式點陣發(fā)光免疫分析儀，方法B為全自動流式熒光發(fā)光分析儀，二者均采用液相懸浮芯片技術，其與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫測定（enzyme?linked?immunosorbent?assay，EIA）不同，傳統(tǒng)的EIA檢測包被單一抗原，反應時間長，操作煩瑣，干擾因素較多，特異性和敏感度有待提高。而方法A和方法B允許在單個試管中同時檢測并識別多個抗體，通過熒光編碼微球、流式細胞激光檢測，全自動檢測分析結果。方法C為全自動多重液相芯片免疫分析儀采用激光微雕技術對芯片進行激光光刻，形成“棒狀”和“點狀”圖案的不同組合對磁片進行編碼，通過對芯片進行氨基、羧基、生物素等化學基團修飾，進而通過化學交聯(lián)的方式將抗原連接到磁片上，經(jīng)過計算機軟件計算分析各編碼的的熒光強度，實現(xiàn)抗體定量的檢測，具有高智能數(shù)字化處理、高通量、特異性高、結果準確等優(yōu)點[8]。本研究結果顯示，采用3種方法檢測AID組10種抗體，其中方法B、C檢測抗Sm抗體和抗SSA60抗體的陽性率均低于方法A，差異均有統(tǒng)計學意義；3種方法檢測的其他抗體陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義，且方法B的對于抗Sm抗體檢測的陽性率只有1.39%，低于其他兩種方法，出現(xiàn)了不一致，究其原因，可能是不同的檢測方法在抗原的來源及純化方面采用了不同的工藝，導致陽性率產(chǎn)生了較大差異，對結果產(chǎn)生一定影響。

在兩兩一致性分析方面，方法A與方法B檢測10項指標平均符合率為92.22%，方法A與方法C平均符合率為93.89%，方法B和方法C平均符合率為92.65%，具有較好的符合率。方法A與方法B檢測10項指標中抗Sm抗體Kappa值為0.120，方法B與方法C檢測抗Sm抗體Kappa值為0.125，方法A和方法C抗Sm抗體檢測Kappa值為0.573，提示方法A和C一致性優(yōu)于方法B。在方法A與方法B的一致性分析中有1項一致性差，3項一致性一般，6項一致性好；方法A與方法C的一致性分析中有5項一致性一般，5項一致性好；方法B與方法C的一致性分析中，有1項一致性差，4項一致性一般，5項一致性好?？傮w來說3種檢測方法敏感度和特異性較高，一致性尚可，適用于臨床檢測。

綜上所述，對于自身免疫性疾病自身抗體的檢測，3種產(chǎn)品檢測結果的一致性差異不大，且自動化程度均較高，能做到高通量，定量化，不同廠家試劑有不同的敏感度和特異性，應根據(jù)患者臨床表現(xiàn)綜合判斷，必要時要采用多種方法進一步印證，可避免誤診和漏檢。研發(fā)更先進的國產(chǎn)免疫分析儀很有必要，相信未來一定會研發(fā)出更高性能的全自動自身抗體分析儀為臨床診療服務。

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（收稿日期：2022–10–11）

（修回日期：2023–05–09）