賈洪柏　許超　劉軍　何凡　丁宏云

摘要［目的］分析菌種種齡和接種量的協(xié)同作用對(duì)纖維素酶活性的影響，為生產(chǎn)纖維素酶奠定理論基礎(chǔ)。［方法］分別對(duì)單菌種（DQ1）和混合菌種（DQ1+DQ2）不同種齡和接種量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，測(cè)定各處理的纖維素酶活力，分析不同處理纖維素的變化趨勢(shì)及差異。［結(jié)果］在培養(yǎng)過程中，不同種齡的纖維素酶活力都在第8天達(dá)到最大；單菌種接種量為1%和2%時(shí)種齡4的纖維素酶活力最高，分別達(dá)到19.57和20.50 IU/mL；混合菌種接種量為1%和2%時(shí)種齡1的纖維素酶活力最高，分別為21.21和20.82 IU/mL。在第8天時(shí)，相同菌種和接種量的不同種齡的纖維素酶活力有一定差異。［結(jié)論］采用該研究的單菌或混合菌生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，最優(yōu)接種條件是種齡4、接種量2%，可以獲得較高的纖維素酶活力，并且生產(chǎn)成本較低。

關(guān)鍵詞 種齡；接種量；協(xié)同作用；纖維素酶；活性

中圖分類號(hào) X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2023）06-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.001

Synergistic Effects of Seeding Age and Inoculum Size on Cellulase Activity

JIA Hong－bai1，2，XU Chao1，LIU Jun1 et al

（1.Anji Guoqian Environmental Technology Co.， Ltd.， Huzhou， Zhejiang 313300;2.College of Life， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract ［Objective］To analyze the effect of the synergistic effect of strain seeding age and inoculation size on cellulase activity and lay a theoretical foundation for cellulase production.［Method］The fermentation experiments of single strain （DQ1） and mixed strain （DQ1 + DQ2） with different seeding ages and inoculum sizes were carried out， and the change trend and difference of cellulase activities were analyzed.［Result］ During the culture process， the cellulase activity of different ages reached its maximum on the 8th day.The cellulase activity of seeding age 4th reached the highest at 1% and 2% inoculation of single strain， they were 19.57 and 20.50 IU/mL， respectively. And the cellulase activity of seeding age 1st reached the highest at 1% and 2% inoculation of single strain， they were 21.21 and 20.82 IU/mL. At the 8th day， the cellulase activity of different seeding ages of the same strain and inoculation size had certain differences.［Conclusion］ When using the single or mixed strain in this study to produce cellulase， the optimal inoculation conditions are seeding age 4th， inoculation size 2%， which can obtain higher cellulase activity and lower production cost.

Key words Seeding age;Inoculum size;Synergistic effect;Cellulase;Activity

我國作為農(nóng)業(yè)大國，每年都會(huì)產(chǎn)生幾億噸的秸稈，如果不能良好地利用秸稈資源，則會(huì)造成環(huán)境污染，影響人類健康［1-2］。利用秸稈等纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇是目前研究的熱點(diǎn)［3］，其中利用纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)物，是目前利用纖維素類物質(zhì)的有效措施［4-7］。燃料乙醇生產(chǎn)中存在的最大問題是如何降低生產(chǎn)成本，其中如何提高纖維素酶的產(chǎn)量是降低生產(chǎn)成本的一個(gè)重要因素。近年來，學(xué)者們從多方面對(duì)產(chǎn)纖維素酶的微生物進(jìn)行了研究，包括產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選［8-11］、微生物菌種的誘變，如常溫常壓等離子誘變［12］、紫外線誘變［13］、亞硝基胍誘變［14］等，以及利用分子手段提高微生物產(chǎn)纖維素酶［15-16］等，并且取得了較好的結(jié)果。

發(fā)酵工藝的發(fā)展最終都是為了提高發(fā)酵過程產(chǎn)物的產(chǎn)量。種子發(fā)酵階段的優(yōu)化被認(rèn)為是最后發(fā)酵階段優(yōu)化提高培養(yǎng)物產(chǎn)量的補(bǔ)充。有大量的文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了發(fā)酵最后階段優(yōu)化提高最終發(fā)酵產(chǎn)物的例子［17-19］。筆者針對(duì)液體種子種齡和接種量對(duì)纖維素酶（CMC）活性的影響進(jìn)行了研究，旨在為此方面的研究和生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種。

利用富集培養(yǎng)的方法從大慶野外分離得到的2株產(chǎn)纖維素酶鐮刀菌屬DQ1和DQ2。

1.1.2 柳枝草。

采自東北林業(yè)大學(xué)大慶生物技術(shù)研究院的柳枝草種植基地。

1.1.3 藥品。

購自天津市大茂化學(xué)試劑廠的分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 纖維素分解菌初篩分離平板培養(yǎng)基。

KH2PO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 0.2 mg，蒸餾水1 000 mL，pH為5.5～6.0，以濾紙為唯一碳源。

1.1.5 羧甲基纖維素鈉復(fù)篩選培養(yǎng)基。

CMC-Na 20 g，NaHPO4 2.5 g，KH2PO4 1.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20 g，pH為7.0～7.2。

1.1.6 牛肉膏蛋白胨分離培養(yǎng)基。

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.0～7.2。

1.1.7 柳枝草液體培養(yǎng)基。

KH2PO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 0.2 mg，蛋白胨 0.5 g，尿素0.3 g，堿處理后的柳枝草粉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH為5.5～6.0。

柳枝草粉的制備：將柳枝草剪成2～3 cm的小段，用2%的NaOH溶液浸泡24 h；用流水沖洗后，將pH調(diào)至中性，烘干；將烘干的小段粉碎至60目備用。

1.1.8 種子液體培養(yǎng)基。

同柳枝草液體培養(yǎng)基，將柳枝草粉改為羧甲基纖維素鈉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法。

向裝有150 mL種子液體培養(yǎng)基的2個(gè)三角瓶中一個(gè)接種菌株DQ1兩環(huán)，另一個(gè)接種菌株DQ1與DQ2各1環(huán)，在150 r/min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)。分別于接種后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天取種子液按照體積比1%和2%的接種量分別接種到裝有200 mL柳枝草液體培養(yǎng)基中同條件下振蕩培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)定種子液菌種濃度。加入菌種后第2天測(cè)定CMC活力，連續(xù)測(cè)定10 d，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 酶活力測(cè)定方法。

取一定的培養(yǎng)液于4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液作為粗酶液測(cè)定酶活力。

CMC活力測(cè)定［20］：取經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液1 mL，加入1 mL含1％ CMC的pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，混勻，50 ℃ 恒溫水浴30 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水中煮沸5 min，后用流水冷卻至室溫，定容至25 mL，在520 nm下比色，測(cè)出OD值，查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線后，求出溶液中的葡萄糖含量。以國際單位為依據(jù)，定義每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol 葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位IU。

DNS試劑配制：稱取200 g酒石酸鉀鈉，溶于一定量水中，加熱溶解，添加10.0 g 3，5-硝基水楊酸、10.0 g氫氧化鈉，溶解后加入2.0 g苯酚、0.5 g無水亞硫酸鈉，全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1 000 mL。用前7 d配制。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子濃度的變化

從各種齡種子濃度（圖1）可以看出，無論是單菌種（DQ1）還是混合菌種（DQ1+DQ2）在培養(yǎng)過程中菌種濃度都是先升高后降低，在種齡3時(shí)達(dá)到最高，單菌種的濃度達(dá)到2.1×105 CFU/mL，混合菌種的濃度達(dá)到了4.9×106 CFU/mL。

2.2 CMC活力的變化趨勢(shì)

從不同菌種不同接種量的各種齡CMC活力變化趨勢(shì)（圖2）可以看出，在整個(gè)的試驗(yàn)過程中，種齡1和種齡2在第4天時(shí)的CMC活力有一個(gè)小幅升高，而后降低再升高，在第8天時(shí)達(dá)到最高，然后再降低；種齡4和種齡5的CMC活力的變化趨勢(shì)都是先升高，在第8天時(shí)達(dá)到最高，而后再降低。接種單菌種種齡3的CMC活力變化趨勢(shì)與種齡1和種齡2相同，但是小幅增高的時(shí)間向后推遲到了第5天；接種混合菌種種齡3的CMC活力與種齡2的CMC活力在同一時(shí)間的變化趨勢(shì)相同，即逐漸降低，再逐漸升高，在第8天時(shí)達(dá)到最高，而后逐漸降低。

韓美玲等［21］研究發(fā)現(xiàn)糙皮側(cè)耳在不同碳源條件下都表現(xiàn)出羧甲基纖維素酶活性升高—降低—升高的過程，這與該研究中種齡1和種齡2的CMC活力變化趨勢(shì)相同。CMC活力出現(xiàn)小高峰可能是菌體數(shù)量較少，并且適應(yīng)性弱，在接種后種子液中易利用的營養(yǎng)成分促進(jìn)了菌種的快速生長，從而使CMC活力升高；當(dāng)這部分碳源消耗盡后，隨著CMC對(duì)培養(yǎng)液中纖維素的作用，CMC活力降低。但隨著微生物數(shù)量的增加，CMC活力又開始升高。

2.3 不同種齡及接種量對(duì)CMC活力的影響

從試驗(yàn)中第8天各處理的CMC活力（表1）可以看出，以單菌種接種培養(yǎng)的CMC活力2種接種量（1%、2%）種齡4的CMC活力都最高，分別達(dá)19.57和20.50 IU/mL。以混合菌種接種培養(yǎng)的CMC活力，接種量為1%時(shí)種齡1的CMC活力最高，達(dá)21.21 IU/mL；接種量為2%時(shí)種齡1的CMC活力最高，達(dá)20.82 IU/mL。經(jīng)方差分析和多重比較表明，試驗(yàn)第8天時(shí)，接種相同菌種和接種量的不同種齡處理的CMC活力有一定差異。從圖1～2可以看出，種齡3的種子濃度最高，但在接種培養(yǎng)過程中的CMC活力普遍較低，這與孫寶婷等［22］的研究結(jié)果相反。這可能是種子培養(yǎng)階段與擴(kuò)大培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基碳源不同導(dǎo)致的。接種帶來的種子液中易利用的營養(yǎng)成分較少，接入新的培養(yǎng)液后，菌種生長緩慢，大量接種的微生物死亡或停滯［23］，導(dǎo)致酶活力較低。師璐等［24］研究發(fā)現(xiàn)，羧甲基纖維素鈉是作為產(chǎn)纖維素酶最好的碳源。而種齡1和種齡2雖然菌種生長力較弱，但接種帶來的種子液中易利用的營養(yǎng)成分相對(duì)較多，有利于微生物快速生長繁殖；雖然種齡4的種子液中易利用的營養(yǎng)成分也很少，但種子生長力強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，能很快地在新的培養(yǎng)液中生長繁殖，因此培養(yǎng)液中的CMC活力都比種齡3的CMC活力高。因?yàn)榉N齡5的種子種齡較大，生長力較弱，加上易利用的營養(yǎng)成分少，所以CMC活力也較低。

從表1還可以看出，無論是單菌種還是混合菌種，種齡1和種齡2接種量2%的CMC活力均低于接種量1%的CMC活力；種齡3、種齡4和種齡5接種量2%的CMC活力均高于接種量1%的CMC活力。這說明接種量對(duì)CMC活力的影響還受到種齡的影響，在確定最佳接種條件時(shí)，只利用單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果是不準(zhǔn)確的。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是當(dāng)種齡小、接種量大時(shí)，初期菌種密度大，初級(jí)代謝產(chǎn)物多，菌體易衰老；而接種量較少則不利于菌體快速增殖和產(chǎn)酶［24］。接種量較小會(huì)延長菌種在發(fā)酵罐中生長速度，降低生產(chǎn)效率；而接種量較大會(huì)降低培養(yǎng)基中溶解氧的含量，影響好氧菌的生長和產(chǎn)物的合成［25］。進(jìn)一步對(duì)相同菌種第8天的CMC活力方差分析和多重比較表明，在接種單菌種時(shí)，種齡3和種齡5不同接種量的CMC活力差異顯著，其他種齡的CMC活力差異不顯著；在接種混合菌種時(shí)，種齡3、種齡4和種齡5不同接種量的CMC活力差異顯著，其他2個(gè)種齡的CMC活力差異不顯著。余夢(mèng)頔等［26］研究發(fā)現(xiàn)，接種量對(duì)納豆枯草桿菌產(chǎn)納豆激酶無顯著影響。因此，接種量與種齡共同對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

在第8天時(shí)，相同菌種和接種量的不同種齡的纖維素酶活力有一定差異。種齡和接種量對(duì)微生物產(chǎn)纖維素酶具有協(xié)同作用；種齡不同，不同的接種量對(duì)纖維素酶活性影響不同。采用該研究的菌種制備纖維素酶時(shí)，無論單菌種還是混合菌種，最優(yōu)接種條件都是種齡4、接種量2%，可以縮短發(fā)酵期的培養(yǎng)時(shí)間，達(dá)到節(jié)能降耗的效果。

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基金項(xiàng)目 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2572014BA16）。

作者簡介 賈洪柏（1978—），男，遼寧遼陽人，實(shí)驗(yàn)師，博士，從事環(huán)境微生物學(xué)和微生物遺傳學(xué)研究。

收稿日期 2022-05-03