曾英港，王柳萍, 2, 3*，奉建芳, 2, 3*，唐丹丹，蒙泔竹

入山虎不同提取部位抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性研究

曾英港1，王柳萍1, 2, 3*，奉建芳1, 2, 3*，唐丹丹1，蒙泔竹1

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004 3. 廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530020

考察入山虎var.不同提取部位對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的治療作用及提取部位的化學(xué)成分分析?？疾烊肷交⒉煌崛〔课粚?duì)人RA成纖維樣滑膜MH7A細(xì)胞增殖活性和炎癥因子含量的影響，通過對(duì)大鼠足趾部皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑建立RA大鼠模型，測(cè)定大鼠體質(zhì)量、全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足跖腫脹度、臟器系數(shù)、血清中炎癥因子含量，采用蘇木素-伊紅染色觀察踝關(guān)節(jié)組織病理，以評(píng)價(jià)入山虎不同提取部位的抗RA活性作用。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析入山虎提取部位的化學(xué)成分。入山虎中的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水提取部位在體內(nèi)外對(duì)RA均具有良好的抗炎作用。在體外，能夠抑制MH7A細(xì)胞的增殖（＜0.05、0.01），減少炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-17A、IL-1β的分泌（＜0.01）；在體內(nèi)，入山虎的提取部位可不同程度降低RA大鼠的足跖腫脹度、全身評(píng)分及關(guān)節(jié)炎評(píng)分（＜0.05、0.01），改善踝關(guān)節(jié)的病理改變，緩解RA大鼠的炎癥反應(yīng)，還能減少促炎因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌（＜0.01），增加抗炎因子IL-4、IL-10的分泌（＜0.01）。對(duì)入山虎的提取部位進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)入山虎的提取物含有的化合物比較相似，含有生物堿、黃酮、香豆素等其他化合物，以生物堿類居多，主要包括呋喃喹啉類、芐基異喹啉類、原小檗堿類、阿樸啡類、苯并菲啶類、酰胺類等。入山虎中的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位在體內(nèi)外對(duì)RA均具有良好的抗炎作用，入山虎提取物主要含有生物堿、黃酮、香豆素等其他化合物。

入山虎；不同提取部位；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎癥因子；生物堿；黃酮；香豆素；木蘭花堿；橙皮苷；兩面針堿

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的、病因未明的慢性自生免疫性疾病，病理學(xué)表現(xiàn)為滑膜增生，血管翳形成、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨侵蝕等，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)功能降低、關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，最終造成關(guān)節(jié)畸形或者嚴(yán)重的殘疾[1-3]。目前，RA治療藥物主要為非甾體抗炎藥、改善風(fēng)濕病情的藥物、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等，但這些藥物價(jià)格昂貴且伴有心血管和胃腸道出血、肝腎毒性和生長(zhǎng)抑制等不良反應(yīng)[4-6]。我國(guó)民族醫(yī)藥、中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)小等特色優(yōu)勢(shì)，在臨床及實(shí)驗(yàn)研究中許多活性成分和作用機(jī)制得到了證實(shí)，具有良好的應(yīng)用前景[7-9]。

入山虎為蕓香科植物毛葉兩面針(Roxb.) DC. var.Huang的干燥根和莖[10]，是傳統(tǒng)瑤藥“五虎”“九?！薄笆算@”“七十二風(fēng)”104種老班藥之首藥，臨床使用量較大。具有清熱解毒、消腫止痛、活血散瘀、殺蟲止癢的功效，用于治療風(fēng)濕、RA、坐骨神經(jīng)痛、胃痛、腹痛、牙痛、咽喉腫痛等?，F(xiàn)代研究表明，入山虎含有生物堿、黃酮類等成分，具有抗菌、抗癌、抗炎、抗血栓等藥理活性[11-14]。但入山虎作為常用的抗RA瑤族民間草藥，其抗RA藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究還很薄弱。因此，本實(shí)驗(yàn)以入山虎為研究對(duì)象，探討其不同提取部位的抗RA活性，尋找活性較強(qiáng)的提取部位，并對(duì)入山虎的提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，為入山虎的抗RA作用研究提供初步的科學(xué)依據(jù)，為抗RA藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，6周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（桂）2019-0001，飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)濕度50%，溫度（22±1）℃，光線控制12 h明暗交替，用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)并自由飲用滅菌水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DW20220526-114）。

1.2 細(xì)胞

人RA成纖維MH7A細(xì)胞（批號(hào)220303）購(gòu)自北納生物科技有限公司。

1.3 藥材

入山虎藥材樣品購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)來賓市金秀瑤族自治縣桐木鎮(zhèn)草藥街，樣品均經(jīng)過廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授、朱意麟講師鑒定為蕓香科植物毛葉兩面針(Roxb.) DC. var.Huang的干燥根或莖。

1.4 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA消化液、PBS（批號(hào)分別為8122082、2376021、8122063）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（批號(hào)T210420H501）購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司；青鏈霉素混合液（批號(hào)20211120）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)814O035）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MTT（批號(hào)917Q0514）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；重組人腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號(hào)031825）購(gòu)自美國(guó)PEPROTECH公司；人白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒（批號(hào)分別為UX0728043972、UX08R02H5223、UX09PN026474）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；大鼠IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)MAN0016898）、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號(hào)MAN0016903）、大鼠IL-4 ELISA試劑盒（批號(hào)MAN0016900）、大鼠IL-10 ELISA試劑盒（批號(hào)MAN0016902）、質(zhì)譜純的純凈水（批號(hào)W6-4）、甲醇（批號(hào)A456-4）、乙腈（批號(hào)A955-4）、甲酸（批號(hào)A117-50）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；大鼠IL-17A ELISA試劑盒（批號(hào)CSB-E07451r）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX，批號(hào)036200804）購(gòu)自上海上藥信誼藥廠有限公司；完全弗氏佐劑（批號(hào)F5881）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號(hào)20211004）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；對(duì)照品兩面針堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.81%）、二氫白屈菜紅堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.21%）、鹽酸白屈菜紅堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.41%）、鹽酸血根堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.50%）、花椒堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.94%）、毛兩面針?biāo)兀ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.91%）、白鮮堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.98%）、鹽酸巴馬汀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.75%）、鹽酸藥根堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.50%）、木蘭花堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.82%）、橙皮苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.88%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)依次為MUST-22111707、MUST-22032004、MUST-21101002、MUST-23022212、MUST-21101701、MUST-22121906、MUST-22100807、MUST-21022604、MUST-23022212、MUST-22020816、MUST-21042811；對(duì)照品茵芋堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.62%）、鹽酸四氫巴馬?。ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.97%）、飛龍掌血素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.50%）均購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)分別為PRF10081202、PRF21102042、PRF20082821；去甲烏藥堿對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.00%，批號(hào)Y-115-150716）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.5 儀器

RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Alpha 2-4 LSCbasic型冰凍干燥機(jī)（德國(guó)Main Christ公司）；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)株式會(huì)社）；CK40型倒置顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社）；SW-CJ-1FD型垂直凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ST16R型低溫離心機(jī)、Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；MH-2型微型震蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）；SL01-1型游標(biāo)卡尺（德清盛秦芯電子科技有限公司）。UPLC-H CLASS超快速液相色譜、XEVO-G2 S qtof四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜、Savant? SPD131DDA SpeedVac?真空離心濃縮儀、Masslynx質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集軟件（美國(guó)Waters公司）。

2 方法

2.1 入山虎不同提取部位的制備

取入山虎根、莖粗粉8.5 kg于滲漉筒鋪平，加入10倍量0.8%稀鹽酸，浸漬3 d，滲漉，收集提取液，合并，加入氨水調(diào)節(jié)pH至10，抽濾得到生物堿沉淀，同時(shí)將濾液減壓濃縮，再用三氯甲烷根據(jù)生物堿的脂溶性將其萃取到氯仿層中，得到氯仿部位（總生物堿提取物）。

取8.5 kg入山虎根、莖粗粉用10倍量70%乙醇同上法滲漉，濃縮，得乙醇總提取物浸膏。按1∶2向乙醇總提取物浸膏中加入蒸餾水混懸，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇對(duì)混懸液萃取，濃縮，即得石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位的提取物。

2.2 入山虎不同提取部位的體外抗RA活性研究

2.2.1 MTT檢測(cè)MH7A細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MH7A細(xì)胞，以5×103個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，給藥組分別加入不同質(zhì)量濃度的氯仿提取液（終質(zhì)量濃度為25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6 mg/mL），石油醚、水部位提取液（終質(zhì)量濃度為6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3、0.097 7 mg/mL），醋酸乙酯部位提取液（終質(zhì)量濃度為12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3 mg/mL），正丁醇部位提取液（終質(zhì)量濃度為3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3、0.097 7、0.048 8 mg/mL），同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（有細(xì)胞、培養(yǎng)基、無藥物）以及空白組（僅有培養(yǎng)基），每組6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩搖勻10 min，于570 nm處檢測(cè)各組的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖抑制率＝1－(給藥－空白)/(陰性對(duì)照－空白)

2.2.2 ELISA檢測(cè)MH7A細(xì)胞上清液中炎癥因子含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MH7A細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種在24孔板上，每孔500 μL，待24 h細(xì)胞貼壁，分別加入含有入山虎氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位、MTX的培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度分別為IC50的1/2、1/4、1/8），空白組、模型組加入等體積的完全培養(yǎng)基，再加入TNF-α（終質(zhì)量濃度為20 ng/mL），干預(yù)24 h，收集細(xì)胞上清液，于?20 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書測(cè)定上清液中IL-6、IL-17A和IL-1β的含量。

2.3 入山虎不同提取部位的體內(nèi)抗RA活性研究

2.3.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建、分組與給藥 按照參考文獻(xiàn)方法[15-17]，取96只SD雄性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成空白組、模型組、MTX（0.5 mg/kg，2次/周）組、氯仿部位（6 g/kg，1次/d）組、石油醚部位（6 g/kg，1次/d）組、醋酸乙酯部位（6 g/kg，1次/d）組、正丁醇部位（6 g/kg，1次/d）組、水部位（6 g/kg，1次/d）組。除空白組，其余組大鼠右后足趾部皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑0.2 mL致炎。造模成功后，空白組和模型組ig 0.5% CMC-Na水溶液，其余組連續(xù)22 d ig相應(yīng)藥物。

2.3.2 觀測(cè)指標(biāo)

（1）體質(zhì)量變化：每4天測(cè)定每只大鼠的體質(zhì)量，并記錄。

（2）全身評(píng)分：造模成功后觀察并記錄各組大鼠后足關(guān)節(jié)病變程度，每4天進(jìn)行1次全身評(píng)分，每只大鼠評(píng)分為0～8分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

（3）關(guān)節(jié)炎指數(shù)測(cè)定：造模成功后觀察并記錄各組大鼠后足關(guān)節(jié)病變程度，每4天進(jìn)行1次關(guān)節(jié)炎評(píng)分。每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分為單只大鼠后足關(guān)節(jié)炎評(píng)分乘以4，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

（4）RA大鼠足趾腫脹度測(cè)定：用游標(biāo)卡尺測(cè)量全部大鼠右后足厚度，分別在注射佐劑前及造模成功后每4天進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算腫脹度。

腫脹度＝造模后足跖厚度－造模前足跖厚度

（5）臟器系數(shù)的測(cè)定：末次ig給藥后24 h，ip 20%烏拉坦溶液，隨后頸椎脫臼處死大鼠，快速取出大鼠的臟器，稱定質(zhì)量，并計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量

表1 全身評(píng)分項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)

表2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

（6）組織病理學(xué)觀察：頸椎脫臼處死大鼠后，分離右足踝關(guān)節(jié)部位，脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

（7）ELISA法檢測(cè)RA大鼠血清中炎癥因子含量：大鼠ip 20%烏拉坦（1 g/kg），隨后頸椎脫臼處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清中IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-4、IL-10含量。

2.4 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析入山虎提取物的化學(xué)成分

考慮到石油醚提取物大多數(shù)是低極性成分，主要為長(zhǎng)鏈脂肪烴等成分，活性成分可能較少；水提取物大多是極性大的維生素、氨基酸等成分，活性成分可能也較少，同時(shí)因正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物在體內(nèi)外具有良好的抗RA活性，且極性中等，因此選擇正丁醇、醋酸乙酯、氯仿的提取物進(jìn)行定性分析。

2.4.1 待測(cè)樣品的處理 取入山虎正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物的浸膏1.0 g，加入20 mL甲醇溶解，取1 mL加甲醇定容到10 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。兩面針堿、二氫白屈菜紅堿、鹽酸白屈菜紅堿、鹽酸血根堿、花椒堿、毛兩面針?biāo)亍柞r堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、木蘭花堿、茵芋堿、鹽酸四氫巴馬汀、飛龍掌血素、去甲烏藥堿對(duì)照品均用甲醇配成100 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，取對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋制成10 μg/mL混合對(duì)照品溶液，即可。

2.4.2 色譜和質(zhì)譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～25 min，98%～55% A；25～32 min，55%～10% A；32～32.1 min，10%～98% A；32.1～35 min，98% A；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜分析采用Waters電噴霧離子源的四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀。正離子源碰撞電壓分別為3 kV；離子源溫度100 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；樣品錐孔電壓40 kV；萃取錐孔電壓4 kV；錐孔氣體積流量50 L/h；溶媒揮散體積流量600 L/h；掃描范圍/100～1200；低碰撞能量10 eV；高碰撞能量30 eV。采用MSE Continuum掃描模式（非數(shù)據(jù)依賴掃描模式）對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。液質(zhì)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集、定量處理由Masslynx 4.1軟件控制。

2.4.3 化合物定性 通過UPLC-Q-TOF-MS/MS平臺(tái)采集得到原始數(shù)據(jù)，采用Progenesis QI軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行導(dǎo)入、峰對(duì)齊、峰提取、歸一化處理，最終形成保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的化合物庫(kù)，通過加氫和加鈉等均去卷積到每個(gè)離子特征。對(duì)一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析得到可能的分子式和候選化合物，通過二級(jí)質(zhì)譜碎片，結(jié)合對(duì)照品的裂解規(guī)律及相關(guān)裂解途徑，文獻(xiàn)資料、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)推導(dǎo)可能的骨架結(jié)構(gòu)，及已報(bào)道的同科同屬兩面針化學(xué)成分相關(guān)研究推導(dǎo)最終的分子結(jié)構(gòu)。

2.4.4 入山虎不同提取物化學(xué)成分差異分析 將入山虎不同提取物（每個(gè)提取物重復(fù)6個(gè)樣品）中的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，以質(zhì)譜離子流圖中峰的響應(yīng)強(qiáng)度值作為相對(duì)定量的原數(shù)據(jù)。帕萊托換算（Paerto Scaling）是代謝組學(xué)中常用的換算方法，本研究采用帕萊托換算對(duì)原數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)度換算，將定量數(shù)據(jù)提交在線軟件Metaboanalyst 5.0進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖，以直觀分析入山虎不同提取物間化學(xué)成分的含量差異。

2.5 高效液相法測(cè)定化合物含量

2.5.1 色譜條件 Welch Ultimate XB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）溶液（含0.2%甲酸、0.25%三乙胺）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～5 min，15% A；5～10 min，15%～20% A；10～25 min，20%～35% A；25～35 min，35%～60% A；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm。

2.5.2 混合對(duì)照品的制備 精密稱取木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為0.816 0、0.898 0、0.202 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。并稀釋得到木蘭花堿的質(zhì)量濃度分別為0.816 0、0.326 4、0.130 6、0.052 2、0.020 9 mg/mL，橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為0.898 0、0.143 7、0.057 5、0.023 0、0.009 2 mg/mL，兩面針堿的質(zhì)量濃度分別為0.202 0、0.080 8、0.032 3、0.012 9、0.005 2 mg/mL的一系列混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。

2.5.3 供試品溶液的制備 取入山虎水部位提取物約l g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL超聲溶解，用0.22 μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果

3.1 入山虎不同提取部位的體外抗RA活性

3.1.1 入山虎不同提取部位對(duì)MH7A細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，入山虎的不同提取部位對(duì)MH7A細(xì)胞均有抑制增殖的作用，氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位的IC50分別為（6.421 8±0.479 3）、（2.252 0±0.357 8）、（6.886 2±0.177 3）、（1.307 0±0.098 1）、（5.479 7±0.393 7）mg/mL，IC50從大到小依次為醋酸乙酯、氯仿、水、石油醚、正丁醇部位。因入山虎不同提取部位IC50的1/2、1/4、1/8在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨給藥濃度的增加，細(xì)胞增殖率下降越明顯，后續(xù)選擇IC50的1/2、1/4、1/8進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

與空白組（0 mg·mL?1）比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.1.2 入山虎不同提取部位對(duì)MH7A細(xì)胞上清液中炎癥因子含量的影響 如圖2所示，在炎癥因子TNF-α的刺激下，與空白組比較，模型組IL-6、IL-17A、IL-1β含量顯著升高（＜0.01）；用入山虎不同提取部位干預(yù)后，與模型組比較，不同質(zhì)量濃度的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位組IL-6、IL-17A、IL-1β含量均顯著減少（＜0.01）。

3.2 入山虎不同提取部位的體內(nèi)抗RA作用

3.2.1 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠體質(zhì)量的影響 如圖3所示，模型組以及入山虎不同提取部位組的大鼠體質(zhì)量均低于空白組（＜0.05、0.01），但入山虎各組大鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，大鼠體質(zhì)量也比較接近，提示入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

與空白組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；L、M、H分別代表低、中、高劑量組，分別為IC50的1/8、1/4、1/2

與空白組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2.2 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠全身評(píng)分的影響 MTX組、石油醚組在6 d后全身評(píng)分均明顯低于模型組（＜0.05、0.01），氯仿組大鼠在10 d后全身評(píng)分均顯著低于模型組（＜0.01），在18～22 d，入山虎不同提取部位組的大鼠全身評(píng)分均低于模型組（＜0.05、0.01），全身評(píng)分的分?jǐn)?shù)由低到高依次為氯仿組、石油醚、醋酸乙酯、水部位、正丁醇組，見圖3。

3.2.3 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 與模型組比較，MTX組在6 d后大鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低（＜0.01），氯仿組在10 d后大鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低（＜0.01），石油醚組、醋酸乙酯組、正丁醇組在18 d后，能夠緩解RA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，明顯降低了大鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分（＜0.05、0.01）。水部位組的RA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀在22 d也有改善（＜0.05）。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分由低到高依次為氯仿組、石油醚組、正丁醇組、醋酸乙酯組、水部位組，見圖3。

3.2.4 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠足趾腫脹度的影響 采用完全弗氏佐劑在右后足趾皮內(nèi)注射造模后，右后足趾開始逐漸變紅、腫脹明顯，在造模3、4 d左右達(dá)到峰值，腳趾關(guān)節(jié)間及前足趾出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大，觸及關(guān)節(jié)大鼠呈現(xiàn)疼痛反射，后肢伸屈不利，睡眠時(shí)右足趾不著地。在6 d后MTX組、氯仿組、石油醚組的RA大鼠腫脹度均明顯小于模型組（＜0.01）。在14 d后，醋酸乙酯組、正丁醇組的RA大鼠的腫脹度顯著低于模型組（＜0.05、0.01），而水部位組的RA大鼠在22 d后其右足腫脹度也有所改善，且低于模型組（＜0.05）。足跖腫脹度由低到高依次為石油醚組、氯仿組、正丁醇組、水部位組、醋酸乙酯組，見圖3。

3.2.5 入山虎不同部位對(duì)RA大鼠臟器指數(shù)的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組的脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)顯著增高（＜0.01），表現(xiàn)出一定的免疫亢進(jìn)。與模型組比較，氯仿、石油醚、正丁醇、水提取部位組和MTX組均能夠降低RA大鼠的脾臟、肝臟指數(shù)（＜0.05、0.01）。醋酸乙酯組也具有降低RA大鼠的脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)的趨勢(shì)，但無顯著性差異。

3.2.6 入山虎不同部位對(duì)RA大鼠踝關(guān)節(jié)病理的影響 如圖5所示，空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨平整，關(guān)節(jié)腔內(nèi)干凈，滑膜細(xì)胞及結(jié)締組織未見增生，未見明顯異常。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)締組織增生、可見被結(jié)締組織包裹的巨噬細(xì)胞團(tuán)，局部關(guān)節(jié)軟骨損傷、可見一定量的結(jié)締組織增生，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜增生。ig入山虎不同提取物后，上述病理改變均得到不同程度的改善，尤其以氯仿組效果最為明顯。表明入山虎不同提取物具有良好的改善RA模型大鼠踝關(guān)節(jié)組織病變的作用，即具有較好的抗RA作用。

圖4 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠脾臟和肝臟指數(shù)的影響(, n = 12)

圖5 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠踝關(guān)節(jié)(A) 及滑膜組織(B) 病理變化的影響(HE, ×100)

3.2.7 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠血清中致炎因子IL-1β、IL-6和IL-17A水平的影響 如圖6所示，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17A的含量明顯提高（＜0.01）；與模型組比較，MTX組以及入山虎的不同提取部位組能夠減少RA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17A的含量（＜0.01）。

3.2.8 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠血清中抗炎因子IL-4和IL-10水平的影響 如圖7所示，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-4、IL-10的含量明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，入山虎提取部位中氯仿組以及MTX組的IL-4的含量均顯著升高（＜0.01），石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位組的IL-4的含量也有升高，但是差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。入山虎的不同提取部位組均能夠升高RA大鼠血清中的IL-10的含量（＜0.01）。其中，氯仿組IL-4、IL-10的含量與MTX組相當(dāng)。

圖6 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-17A水平的影響(, n = 12)

圖7 入山虎不同提取部位對(duì)RA大鼠血清中IL-4和IL-10水平的影響(, n = 12)

3.3 入山虎提取部位的化學(xué)成分分析

參考兩面針?biāo)幉幕瘜W(xué)成分分析相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[36]，本實(shí)驗(yàn)選擇正離子模式進(jìn)行分析，得到混合對(duì)照品及提取物的一級(jí)質(zhì)譜基峰圖，見圖8。結(jié)合對(duì)照品圖譜中的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子、二級(jí)碎片離子信息、裂解規(guī)律，以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[37-56]，最終初步篩選得到入山虎化合物69個(gè)，初步鑒定結(jié)構(gòu)55個(gè)，未知14個(gè)。鑒定結(jié)果見表3，入山虎提取的化學(xué)成分比較相近，主要以生物堿類的成分居多，包括呋喃喹啉類、芐基異喹啉類、原小檗堿類、阿樸啡類、苯并菲啶類、酰胺類等生物堿以及黃酮、香豆素等其他化合物。

3.4 入山虎不同提取物化學(xué)成分差異分析結(jié)果

聚類熱圖（圖9）顯示，入山虎不同提取物的化學(xué)成分含量具有顯著差異，而不同提取物的重復(fù)樣品內(nèi)的化學(xué)成分含量相似。結(jié)果顯示，68個(gè)化合物可以明顯地聚類成2個(gè)大類群。同時(shí)每個(gè)大類群又聚類成2個(gè)亞群。來自于大類群I中的2個(gè)亞群的化合物在醋酸乙酯提取物組的含量顯著高于氯仿和正丁醇組，氯仿組最低，同時(shí)2個(gè)亞群的代謝物又存在一定差異，即醋酸乙酯提取物中coptisine（52）、rutaecarpine（54）、去-甲基白屈萊紅堿（62）、二氫白屈菜紅堿（64）等的含量相對(duì)較高。而來自大類群II中亞群3的化合物在正丁醇提取物組中的含量顯著高于氯仿和醋酸乙酯組，正丁醇提取物中的橙皮苷（23）、四氫巴馬汀（24）、藥根堿（26）等的含量相對(duì)較高。而亞群4的化合物在氯仿提取物組的含量顯著高于正丁醇和醋酸乙酯組，亞群5的化合物在醋酸乙酯提取物組的含量顯著低于氯仿和正丁醇組，氯仿提取物中的去甲烏藥堿（1）、小檗紅堿（25）、兩面針堿（39）、茵芋堿（43）、白蘚堿（46）、木蘭花堿（8）等的含量相對(duì)較高。

A、B、C依次為正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取部位，D為混合對(duì)照品

表3 入山虎提取物的化學(xué)成分UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒別結(jié)果

續(xù)表3

續(xù)表3

▲代表經(jīng)過對(duì)照品比對(duì)，△參考文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，無標(biāo)記表示無文獻(xiàn)參考

▲represents that after comparison of reference substances,△references literature and database data, unmarked means no literature reference

A、B、C依次為氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取部位

3.5 入山虎化合物定量結(jié)果

由“3.4”項(xiàng)下入山虎不同提取物的化學(xué)成分差異分析結(jié)果可知，木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿在入山虎提取物中的含量相對(duì)較高，在高效液相色譜儀中也能夠鑒定這個(gè)3個(gè)成分，因此，選擇木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿進(jìn)行定量測(cè)定。

3.5.1 方法學(xué)考察結(jié)果

（1）線性考察：將混合對(duì)照品按“2.5.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）、以峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得到木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的回歸方程分別為＝8 006.3＋178 659，2＝0.999 1；＝9 377.9－151 624，2＝0.999 1；＝50 224－55 478，2＝0.999 9。結(jié)果表明，3種成分在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

（2）精密度考察：將入山虎供試品溶液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿峰面積的RSD分別為0.43%、0.62%、1.57%，表明儀器精密度良好。

（3）穩(wěn)定性考察：分別在0、2、4、8、12、24 h將入山虎供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿峰面積的RSD分別為1.86%、0.91%、1.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）重復(fù)性考察：平行制備6份供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣，計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為2.39%、2.07%、2.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率考察：取入山虎供試品溶液6份，每份約0.5 g，精密稱定，并精密加入等量的木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿對(duì)照品，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的峰面積，木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿加樣回收率為95.00%～105.00%，RSD分別為2.23%、1.86%、2.16%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

3.5.2 定量結(jié)果 將混合對(duì)照品和供試品溶液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的峰面積，HPLC圖譜見圖10。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）、峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得到木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的回歸方程分別為＝8 006.3＋178 659，2＝0.999 1；＝9 377.9－151 624，2＝0.999 1；＝50 224－55 478，2＝0.999 9。根據(jù)回歸方程計(jì)算得到木蘭花堿、橙皮苷、兩面針堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（2.992 0±0.024 0）、（4.253 2±0.045 9）、（0.965 8±0.001 1）mg/g。橙皮苷含量較高，木蘭花堿、兩面針堿次之。

1-木蘭花堿 2-橙皮苷 3-兩面針堿

4 討論

研究表明，抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的增生和炎性反應(yīng)能夠緩解RA的疼痛，同時(shí)，有效抑制炎癥因子的分泌對(duì)RA治療也具有重要意義[18-19]。而MH7A滑膜纖維細(xì)胞是從RA患者的關(guān)節(jié)滑膜處提取得到，具有類似人RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的特點(diǎn)[20]，增殖速度較快，可多次傳代，可代替人RA成纖維樣滑膜細(xì)胞用于RA的研究。因此，本研究采用入山虎的不同提取部位對(duì)MH7A細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，考察其增殖活性和炎癥因子的含量。結(jié)果顯示，入山虎的氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水提取部位組均能夠有效抑制MH7A細(xì)胞的增殖，從增殖抑制率上看，正丁醇部位的抑制率較好，氯仿、石油醚、水部位的效果比較接近，水部位次之。

采用TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞后，模型組炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β含量增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，在炎癥因子刺激下，滑膜成纖維細(xì)胞可以分泌其他相關(guān)的炎癥因子，如IL-1β、IL-17等[21-25]。還有研究表明，作為致炎因子的IL-1β能夠在RA滑膜組織中大量表達(dá)，同時(shí)還會(huì)誘導(dǎo)其他相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，加重RA的炎癥反應(yīng)[26-27]。IL-6、IL-17A等炎癥因子能夠促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，甚至誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨侵蝕[28-30]。在本研究中，入山虎不同提取部位可有效降低TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β的含量。

足腫脹程度和關(guān)節(jié)病理變化是評(píng)價(jià)抗RA藥物療效的重要指標(biāo)[31-33]。本研究參照文獻(xiàn)[15-17]中的造模方法，在大鼠的足跖部注射完全弗氏佐劑建立大鼠RA動(dòng)物模型，造模后大鼠的全身評(píng)分≥4、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分≥16，出現(xiàn)前足或后足關(guān)節(jié)紅腫、踝關(guān)節(jié)明顯腫脹，嚴(yán)重者還會(huì)出現(xiàn)拖行現(xiàn)象，與文獻(xiàn)[34-35]報(bào)道一致，視為造模成功。因此，本次研究中已成功造模，模型組大鼠的足跖腫脹度及全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高，且HE染色結(jié)果可以看出模型組結(jié)締組織增生，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，而ig給予入山虎的不同提取部位后，均可在不同程度上降低完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的RA大鼠的足跖腫脹度、全身評(píng)分及關(guān)節(jié)炎評(píng)分，能改善大鼠踝關(guān)節(jié)組織的病理改變、降低臟器指數(shù)。對(duì)RA大鼠血清中的炎癥因子進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果也提示入山虎的不同提取部位具有良好的抗RA作用，均能夠減少炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β的含量，升高抗炎因子IL-10的含量。其中，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)價(jià)中，以氯仿部位的效果相對(duì)較好，在RA大鼠血清的抗炎因子IL-10結(jié)果中，以氯仿部位的效果相對(duì)較好，同時(shí)氯仿部位還能升高抗炎因子IL-4的含量。而在體外實(shí)驗(yàn)中，入山虎不同提取物的炎癥因子水平各組間結(jié)果相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以上結(jié)果提示氯仿部位可能是入山虎的抗RA的主要活性部位。

入山虎的化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)志物相關(guān)研究報(bào)道比較少，在一定程度上制約了入山虎的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)研究。本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)入山虎的正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，篩選得到化合物69個(gè)，初步鑒定結(jié)構(gòu)55個(gè)，未知14個(gè)。結(jié)果可見，入山虎的提取物主要含有生物堿類成分，主要包括呋喃喹啉類、芐基異喹啉類、原小檗堿類、阿樸啡類、苯并菲啶類、酰胺類等生物堿，同時(shí)還含有黃酮類、香豆素等其他化合物。本研究未對(duì)入山虎總提取物進(jìn)行抗RA活性研究，而化學(xué)成分鑒定可知，入山虎不同提取物均具有結(jié)構(gòu)多樣化的生物堿類成分，這些生物堿類成分可能是入山虎抗RA的活性成分。因此，其總提取物應(yīng)具有更廣泛的生物堿類成分，更具有一定的抗RA活性作用。而體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，入山虎的氯仿部位可能是入山虎抗RA的活性部位，而在化學(xué)成分差異分析中，氯仿提取物中的去甲烏藥堿、小檗紅堿、兩面針堿、茵芋堿、白蘚堿、木蘭花堿等一類亞群化合物的含量相對(duì)于醋酸乙酯組、正丁醇組較高，與其他2組具有一定的差異，推測(cè)這一類亞群的成分可能是導(dǎo)致不同提取物抗RA作用的差異成分。因此，后續(xù)應(yīng)需要繼續(xù)對(duì)氯仿部位分離、純化、鑒定，進(jìn)一步研究入山虎抗RA的活性成分。同時(shí)本研究還對(duì)入山虎的兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷進(jìn)行定量，可為后續(xù)入山虎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。

綜上，入山虎中的氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位在體內(nèi)外對(duì)RA均具有良好的抗炎作用，在體外能夠抑制MH7A細(xì)胞的增殖，減少炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌；在體內(nèi)對(duì)RA大鼠有良好的抗炎作用，還能減少促炎因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌，增加抗炎因子IL-4、IL-10的分泌，綜合來看以氯仿部位的效果較優(yōu)，且入山虎的提取部位主要含有生物堿類成分。本研究可為入山虎治療RA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定的依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 黃清惠. 雷公藤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)狀思考 [J]. 中國(guó)民間療法, 2020, 28(20): 115-117.

[2] Aletaha D, Smolen J S. Diagnosis and management of rheumatoid arthritis [J]., 2018, 320(13): 1360.

[3] 盧敏輝, 郭娟, 張清, 等. 唑來膦酸治療風(fēng)濕病合并骨質(zhì)疏松患者70例臨床觀察 [J]. 風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎, 2021, 10(8): 19-23.

[4] Watanabe T, Fujiwara Y, Chan F K L. Current knowledge on non-steroidal anti-inflammatory drug-induced small-bowel damage: A comprehensive review [J]., 2020, 55(5): 481-495.

[5] 周曉, 孫偉, 隋曉杰, 等. 糖皮質(zhì)激素引發(fā)骨質(zhì)疏松或骨壞死等不良反應(yīng)研究進(jìn)展 [J]. 疑難病雜志, 2015, 14(5): 534-540.

[6] 陳小奇. 生物制劑在風(fēng)濕病的應(yīng)用 [J]. 醫(yī)學(xué)新知, 2019, 29(5): 537-540.

[7] 曹知勇, 張青槐, 龐宇舟. 壯藥青風(fēng)藤總生物堿對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達(dá)的影響 [J]. 西部中醫(yī)藥, 2022, 35(8): 23-25.

[8] 梁小鑫, 劉靜昀, 張家立. 瑤醫(yī)“老班藥”在骨傷科疾病中的用藥規(guī)律和特色分析 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2021, 17(10): 17-20.

[9] 雷長(zhǎng)國(guó), 覃建峰, 余躍生, 等. 瑤藥痹痛消抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 四川中醫(yī), 2016, 34(6): 41-43.

[10] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局. 廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)-第一卷 (2014年版) [M]. 南寧: 廣西科學(xué)技術(shù)出版社, 2014: 6-13.

[11] Qin F, Wang C Y, Kim D,. Nitidumpeptins A and B, cyclohexapeptides isolated fromvar.: Structural elucidation, total synthesis, and antiproliferative activity in cancer cells [J]., 2021, 86(2): 1462-1470.

[12] Qin F, Wang C Y, Hu R C,. Anti-inflammatory activity of isobutylamides fromvar.[J]., 2020, 142: 104486.

[13] Qin F, Wang F F, Wang C G,. The neurotrophic and antineuroinflammatory effects of phenylpropanoids fromvar.(Rutaceae) [J]., 2021, 153: 104990.

[14] Yu B, Zhang G P, Jin L L,. Inhibition of PAI-1 activity by toddalolactone as a mechanism for promoting blood circulation and removing stasis by Chinese herbvar.[J]., 2017, 8: 489.

[15] 楊麗. 樹參抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究 [D]. 南昌: 江西中醫(yī)藥大學(xué), 2019.

[16] Jia P, Chen G, Qin W Y,. Xitong Wan attenuates inflammation development through inhibiting the activation of nuclear factor-κB in rats with adjuvant-induced arthritis [J]., 2016, 193: 266-271.

[17] Pan T, Cheng T F, Jia Y R,. Anti-rheumatoid arthritis effects of traditional Chinese herb couple in adjuvant-induced arthritis in rats [J]., 2017, 205: 1-7.

[18] Shen Y, Teng L, Qu Y H,. Anti-proliferation and anti-inflammation effects of corilagin in rheumatoid arthritis by downregulating NF-κB and MAPK signaling pathways [J]., 2022, 284: 114791.

[19] Zhou M Y, Cai L, Feng X W,.-mediated overexpression or silencing of aquaporin 1 affects the proliferation, migration and invasion of TNF-α-stimulated rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes by Wnt/β-catenin signaling pathway [J]., 2021, 14: 1945-1957.

[20] 李宇馨, 李瑞海. 蒼術(shù)揮發(fā)油抗炎活性研究 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 15(2): 71-72.

[21] You X, Boyle D L, Hammaker D,.-mediated apoptosis in fibroblast-like synoviocytes does not require p53 [J]., 2006, 8(6): R157.

[22] Bottini N, Firestein G S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors [J]., 2013, 9(1): 24-33.

[23] Koch A E. Review: Angiogenesis: Implications for rheumatoid arthritis [J]., 1998, 41(6): 951-962.

[24] Paleolog E M. Angiogenesis in rheumatoid arthritis [J]., 2002, 4(Suppl 3): S81-S90.

[25] Xu J, Itoh Y, Hayashi H,. Dihydrotestosterone inhibits interleukin-1α or tumor necrosis factor α-induced proinflammatory cytokine production via androgen receptor-dependent inhibition of nuclear factor-κB activation in rheumatoid fibroblast-like synovial cell line [J]., 2011, 34(11): 1724-1730.

[26] Brennan F M, McInnes I B. Evidence that cytokines play a role in rheumatoid arthritis [J]., 2008, 118(11): 3537-3545.

[27] Niu X Y, Chen G J. Clinical biomarkers and pathogenic-related cytokines in rheumatoid arthritis [J]., 2014, 2014: 1-7.

[28] Bottini N, Firestein G S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors [J]., 2013, 9(1): 24-33.

[29] Lerner A, Matthias T. Rheumatoid arthritis-celiac disease relationship: Joints get that gut feeling [J]., 2015, 14(11): 1038-1047.

[30] Ahmad S F, Ansari M A, Nadeem A,. The tyrosine kinase inhibitor tyrphostin AG126 reduces activation of inflammatory cells and increases Foxp3+regulatory T cells during pathogenesis of rheumatoid arthritis [J]., 2016, 78: 65-78.

[31] Gou K J, Zeng R, Ren X D,. Anti-rheumatoid arthritis effects in adjuvant-induced arthritis in rats and molecular docking studies ofL. extracts [J]., 2018, 201: 59-69.

[32] 姚曉陽, 蔣秀娣, 馬晨蕓, 等. 抗氨甲?；鞍卓贵w檢測(cè)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診治的臨床價(jià)值 [J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2018, 41(1): 77-80.

[33] 趙桂芝, 徐攀, 浦錦寶, 等. 白術(shù)醇提物對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹度和炎性細(xì)胞因子的影響 [J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 41(1): 32-37.

[34] Pottier G, Bernards N, Dollé F,. [18F]DPA-714 as a biomarker for positron emission tomography imaging of rheumatoid arthritis in an animal model [J]., 2014, 16(2): 1-10.

[35] 蔡文虹, 孫保東, 張寶鳳, 等. 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥, 2012, 19(4): 10-12.

[36] Lin Q Y, Pu H L, Guan H D,. Rapid identification and pharmacokinetic studies of multiple active alkaloids in rat plasma through UPLC-Q-TOF-MS and UPLC-MS/MS after the oral administration ofextract [J]., 2020, 186: 113232.

[37] 袁海梅, 邱露, 謝貞建, 等. 花椒屬植物生物堿類成分及其藥理活性研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 40(23): 4573-4584.

[38] Huang A H, Chi Y G, Liu J W,. Profiling and pharmacokinetic studies of alkaloids in rats after oral administration ofdecoction by UPLC-Q-TOF-MS/MS and HPLC-MS/MS [J]., 2019, 24(3): 585.

[39] Wei W J, Chen X H, Guo T,. A review on classification and biological activities of alkaloids from the genusspecies [J]., 2021, 21(3): 336-361.

[40] 賈昌平, 黃雪麗, 李允, 等. HPLC-DAD/ESI-Q-TOF-MS分析兩面針中的生物堿 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(8): 1198-1202.

[41] Zhou J, Sun J B, Zheng P,. Orthogonal array design for optimization of hollow-fiber-based liquid-phase microextraction combined with high-performance liquid chromatography for study of the pharmacokinetics of magnoflorine in rat plasma [J]., 2012, 403(7): 1951-1960.

[42] Jeong E K, Lee S Y, Yu S M,. Identification of structurally diverse alkaloids inspecies by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry [J]., 2012, 26(15): 1661-1674.

[43] Kotake Y, Okuda K, Kamizono M,. Detection and determination of reticuline and-methylcoculaurine in the Annonaceae family using liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]., 2004, 806(1): 75-78.

[44] 卿志星, 程辟, 曾建國(guó). 博落回中生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2013, 44(20): 2929-2939.

[45] Wang D W, Liu Z Q, Guo M Q,. Structural elucidation and identification of alkaloids inby electrospray ionization tandem mass spectrometry [J]., 2004, 39(11): 1356-1365.

[46] Wu W, Song F R, Yan C Y,. Structural analyses of protoberberine alkaloids in medicine herbs by using ESI-FT-ICR-MS and HPLC-ESI-MS(n) [J]., 2005, 37(3): 437-446.

[47] Liu Q X, Zhou B B, Wang X L,. Establishment of a search library about benzylisoquinoline alkaloids based on selective separation on the binaphthyl column and standard analysis on C18column [J]., 2012, 35(23): 3317-3325.

[48] Schmidt J, Boettcher C, Kuhnt C,. Poppy alkaloid profiling by electrospray tandem mass spectrometry and electrospray FT-ICR mass spectrometry after[ring-13C6]-tyramine feeding [J]., 2007, 68(2): 189-202.

[49] Hu Y H, Jiang P, Wang S P,. Plasma pharmacochemistry based approach to screening potential bioactive components in Huang-Lian-Jie-Du-Tang using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometric detection [J]., 2012, 141(2): 728-735.

[50] 黃飛飛, 王榮, 陳玥, 等. 基于HPLC-Q-TOF-MS/MS的分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)快速分析夏天無生物堿 [J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2021, 42(3): 228-240.

[51] 張榆, 胡少偉, 楊佳穎, 等. 基于UPLC-LTQ Orbitrap MS的益氣降脂顆?；瘜W(xué)組成分析 [J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2020, 41(5): 411-426.

[52] 楊鵬, 卿志星, 左姿, 等. HPLC-Q-TOF/MS鑒定白屈菜中異喹啉類生物堿 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2017, 19(2): 174-182.

[53] 宛玉祥, 李家宇, 秦優(yōu), 等. 液質(zhì)聯(lián)用鑒定單面針中的化學(xué)成分 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2017, 19(4): 496-499.

[54] Wang P, Sun J B, Gao E Z,. Simultaneous determination of limonin, dictamnine, obacunone and fraxinellone in rat plasma by a validated UHPLC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study after oral administration of Cortex Dictamni extract [J]., 2013, 928: 44-51.

[55] Yang G H, Chen D F. Alkaloids from the roots ofand their antiviral and antifungal effects [J]., 2008, 5(9): 1718-1722.

[56] Terezan A P, Rossi R A, Almeida R N A,. Activities of extracts and compounds fromSt. Hil. (Rutaceae) in leaf-cutting ants and their symbiotic fungus [J]., 2010, 21(5): 882-886.

Anti-rheumatoid arthritis activity of different extracts fromvar.

ZENG Ying-gang1, WANG Liu-ping1, 2, 3, FENG Jian-fang1, 2, 3, TANG Dan-dan1, MENG Gan-zhu1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. Guangxi Superior Chinese Patent Medicine and National Medicine Development Engineering Technology Research Center, Nanning 530020, China

To investigate the effect of different extraction parts fromvar.(ZN) on rheumatoid arthritis (RA) and chemical composition analysis of extraction parts.The human RA fibroblast-like synoviocyte cell line MH7A cells were used to investigate the effects of different extraction parts of ZN on the proliferation activity and contents of inflammatory factors. RA rat model was established by intradermal injection of Freund’s complete adjuvant into the toes of rats. The body weight, whole body score, arthritis score, degree of swelling, organ coefficient and contents of inflammatory factor of rats were measured, pathology of ankle joint tissue was used by HE staining to evaluate the anti-RA activity of different extraction parts of ZN. And the chemical constituents of the extract were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS/MS.Chloroform, petroleum ether, ethyl acetate,-butanol and water extraction parts of ZN had good anti-inflammatory effects on RAand. ZN could inhibit the proliferation of MH7A cells(< 0.05, 0.01), reduce the secretion of inflammatory factors interleukin-6 (IL-6), IL-17A and IL-1β (< 0.01)., the extraction parts of ZN could reduce the paw swelling, whole body score and arthritis score of RA rats to varying degrees (< 0.05, 0.01), improve the pathological changes of ankle joint, alleviate the inflammatory symptoms of RA rats, reduce the secretion of pro-inflammatory factors IL-6, IL-17A and IL-1β (< 0.01), increase the secretion of anti-inflammatory factors IL-4 and IL-10 (< 0.01). The chemical constituent analysis showed that the extracts of ZN contained similar compounds, including alkaloids, flavonoids, coumarins and other compounds. Most of them were alkaloids, including furan quinolines, benzylisoquinolines, protoberberines, aporphines, benzophenanthridines, amides and so on.Chloroform, petroleum ether, ethyl acetate,-butanol and water extraction parts of ZN have good anti-inflammatory effects on RAand. The extract mainly contains alkaloids, flavonoids, coumarins and other compounds.

(Roxb.) DC. var.Huang;different extraction parts; rheumatoid arthritis; inflammatory factors; alkaloids; flavonoids; coumarins; magnoflorine; hesperidin; nitidine

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4186 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.012

2023-02-08

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFC1712304）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD20238058）；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（GXZYKF2022-16）；廣西中醫(yī)藥管理局科研課題（GXZYZ20210068）

曾英港（1997—），女，壯族，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹?。Tel: 14777264959 E-mail: zengyinggang2016@163.com

通信作者：王柳萍（1978—），女，壯族，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴?、民族藥的品質(zhì)與藥效研究。Tel: 18607713396 E-mail: rousel@126.com

奉建芳（1966—），男，瑤族，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴?、民族藥制劑研究。Tel: 13817588549 E-mail: fengjianfang@vip.163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]