魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系研究現(xiàn)狀

景宏麗，孔玉方，袁向芬，張旻，王娜，陳冬杰，吳紹強(qiáng)

（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

在已知的脊椎動(dòng)物種群中，魚(yú)類(lèi)約占48%，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞作為脊椎動(dòng)物組織和細(xì)胞模型應(yīng)用于多個(gè)生物學(xué)科，是一個(gè)巨大資源[1]。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)材料，比活魚(yú)實(shí)驗(yàn)具有便捷、經(jīng)濟(jì)、易操作和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)比人和哺乳動(dòng)物離體培養(yǎng)的細(xì)胞株，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞株平均傳代100 代仍可繼續(xù)分裂，且來(lái)源于成魚(yú)的細(xì)胞系仍具有分裂能力。本文歸納整理了近年新建魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的數(shù)據(jù)，綜述了魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系組織來(lái)源、培養(yǎng)方法及應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系研究提供最新的參考數(shù)據(jù)。

1 國(guó)內(nèi)外魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系構(gòu)建情況

自1962 年Wolf 和Quimby 建立了第一個(gè)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系—虹鱒（Oncorhynchus mykiss）性腺細(xì)胞系（RTG-2）[2]以來(lái)，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系應(yīng)用已有60 年的歷史。截至目前，至少建立和應(yīng)用了826 株細(xì)胞系[3]。這些細(xì)胞系分別來(lái)源于約74 科186 種魚(yú)類(lèi)的不同組織，其中鯉科的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)最多，約27 種，但是來(lái)源于虹鱒的細(xì)胞系數(shù)量最多，約為73 株。淡水魚(yú)類(lèi)和溯河洄游性魚(yú)類(lèi)約525 株，分別來(lái)源于42 科的105 種魚(yú)類(lèi)的不同組織；而海水魚(yú)類(lèi)及咸水魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞系約為301 株，分別來(lái)源于約32 科的81 種海水魚(yú)類(lèi)的不同組織。該數(shù)據(jù)與張博等[4]報(bào)道魚(yú)類(lèi)隸屬科的數(shù)量有所減少，但是，魚(yú)類(lèi)種類(lèi)和數(shù)目都增加。特別是來(lái)源于海水魚(yú)類(lèi)種類(lèi)和數(shù)目明顯增加。目前魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)已實(shí)現(xiàn)從淡水魚(yú)類(lèi)擴(kuò)展到海水魚(yú)類(lèi)，相信未來(lái)會(huì)擴(kuò)展到其他水生動(dòng)物，會(huì)建立更多種類(lèi)細(xì)胞系，形成豐富細(xì)胞系資源庫(kù)。

我國(guó)學(xué)者新建的部分細(xì)胞系并未統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2010 年上半年，我國(guó)已經(jīng)建立的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系約70 株[4]。筆者進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)，在2011—2021 年間中國(guó)學(xué)者公開(kāi)發(fā)表的新建且能穩(wěn)定傳代的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系約94 株，分別來(lái)源于53 種魚(yú)類(lèi)不同組織（表1）。在2011—2021 年新建立細(xì)胞系報(bào)道中，至少80%由亞洲學(xué)者報(bào)道，這與Lakra 等[1]結(jié)果類(lèi)似。這些亞洲學(xué)者中中國(guó)學(xué)者居多，其次是印度。中國(guó)學(xué)者已然成為全世界新建細(xì)胞系研究領(lǐng)域主要貢獻(xiàn)者。

2 細(xì)胞系的組織來(lái)源

細(xì)胞系建立是一個(gè)漫長(zhǎng)復(fù)雜的過(guò)程，會(huì)因?yàn)槿〗M織時(shí)出現(xiàn)污染而造成試驗(yàn)失敗，因此建立細(xì)胞系通常選擇比較容易獲得的正常魚(yú)類(lèi)組織。目前已經(jīng)報(bào)道的組織或器官有肝臟、腎臟、腦、鰭條、皮膚和性腺等。在2011—2021 年間，本文統(tǒng)計(jì)的94 株的國(guó)內(nèi)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系中，來(lái)自鰭條組織細(xì)胞系有26 株，占新建細(xì)胞系27.66%；來(lái)自腦組織細(xì)胞系14 株，占新建細(xì)胞系14.89%；來(lái)自腎組織細(xì)胞系14 株，占新建細(xì)胞系14.89%；來(lái)自性腺組織細(xì)胞系10 株，占新建細(xì)胞系9.4%。由此可見(jiàn)，鰭條是建立細(xì)胞系最常選擇的組織之一，這是由于取鰭條組織不用殺死成魚(yú)，且鰭條組織的再生能力很強(qiáng)，離體培養(yǎng)細(xì)胞增殖活性強(qiáng)[5]。

為了能夠更好發(fā)揮魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系作用，魚(yú)類(lèi)組織來(lái)源除了選取常見(jiàn)組織，還會(huì)根據(jù)需求選取特殊組織構(gòu)建細(xì)胞系。如關(guān)檸楠等[67]建立團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞系；魏鈺娟等[68]建立異育銀鯽脊髓組織細(xì)胞系。

國(guó)內(nèi)外魚(yú)類(lèi)細(xì)胞建系建立雖然已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，但并不是所有的魚(yú)類(lèi)組織都能夠構(gòu)建穩(wěn)定可傳代的細(xì)胞系，如付思思等[6]在錦鯉組織細(xì)胞體外培養(yǎng)的初步研究中，鰭條細(xì)胞系已傳至第39 代，但心臟和肌肉細(xì)胞系分別停留在第2 代和第4代。建議應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要和組織特性合理選擇用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織來(lái)源，否則不能獲得預(yù)期的細(xì)胞系。

3 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系原代培養(yǎng)方法

魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩個(gè)階段。原代培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的起始而最關(guān)鍵的階段。細(xì)胞原代培養(yǎng)方法有多種，如組織塊法、機(jī)械分離法、絡(luò)合劑分散法、酶消化法、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法和微載體細(xì)胞培養(yǎng)法等[5]。近年數(shù)據(jù)顯示，酶消化法和組織塊法使用頻率最多。目前采用酶消化法建立的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系已有較多報(bào)道，如Liu 等[25]建立了石斑魚(yú)的腦細(xì)胞系；Xu 等[26]建立了鯽的腦細(xì)胞系；Jing等[37,59]建立了金魚(yú)吻端、腎臟和心臟細(xì)胞系；張瑩瑩等[38]建立了金錢(qián)魚(yú)的腎細(xì)胞系；周佳楠等[66]建立了金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞系。采用組織塊法成功建立的細(xì)胞系有錦鯉的鰭條細(xì)胞系[6]、斑石鯛的肌肉、腦和肝細(xì)胞系[27,28]、大菱鲆的腦和心臟細(xì)胞系[29,60]等。

雖然以上兩種細(xì)胞原代培養(yǎng)方法均得到了廣泛應(yīng)用，但研究數(shù)據(jù)顯示，相同組織細(xì)胞系使用原代培養(yǎng)方法并不是單一固定在酶消化法或組織塊法上，即不具有專(zhuān)一性。如建立皮膚細(xì)胞系研究中，來(lái)源于中華鱘、牙鲆、石斑魚(yú)的皮膚細(xì)胞系使用了組織塊法[5,56,57]，而中華鳑鲏的皮膚細(xì)胞系使用了酶消化法[58]；在腦細(xì)胞系研究中，來(lái)源斑石鯛、鱖和大菱鲆的腦細(xì)胞系使用組織塊法[28-30]，來(lái)源金魚(yú)、鯽、卵形鯧鲹和錦鯉的腦細(xì)胞系使用酶消化法[26,31,32]；在性腺細(xì)胞系研究中也有類(lèi)似報(bào)道[48-50]。除了以上兩種原代培養(yǎng)方法，在建立魚(yú)類(lèi)的胚胎細(xì)胞系研究中使用了機(jī)械分離法[65]。盡管現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)較為成熟，且獲得了重要成果，但還有相當(dāng)多的魚(yú)類(lèi)組織器官的細(xì)胞培養(yǎng)至今尚未成功。這就需要不斷開(kāi)發(fā)新的原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)解決這一難題。

4 培養(yǎng)基和添加劑的選擇

要建立魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系，從組織到細(xì)胞延伸是決定細(xì)胞系能否建成的關(guān)鍵步驟之一，整個(gè)過(guò)程中主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源就是培養(yǎng)基。因此選擇合適培養(yǎng)基至關(guān)重要。培養(yǎng)基組成包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、抗生素和促細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。細(xì)胞系不同時(shí)期需要成分有所不同，但是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清是必備成分。

目前常見(jiàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM）、Medium 199（M199）、Leibovitz-15（L-15）、Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F-12（DMEM:F12）和Minimum Essential Medium（MEM）。每種培養(yǎng)基適用細(xì)胞系不同，如DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分高于MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其根據(jù)糖的含量又分為高糖DMEM 和低糖DMEM，適合培養(yǎng)增殖活躍的細(xì)胞[5]；M199 所含營(yíng)養(yǎng)成分達(dá)60 多種，在淡水魚(yú)細(xì)胞培養(yǎng)中比較常見(jiàn)[37,59]；L-15 培養(yǎng)基采用半乳糖作為糖源，且豐富了氨基酸組成成分，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不用添加CO2，海水魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的培養(yǎng)使用較多[25]。DMEM/F12是Ham’s F12 與DMEM 以1∶1 的比例混合培養(yǎng)基，適用于培養(yǎng)增殖活力較弱的細(xì)胞[28]；MEM 培養(yǎng)基含有多種必需氨基酸和維生素，適用于培養(yǎng)要求不太高魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞[45,51]。這些商品化培養(yǎng)基產(chǎn)品多數(shù)是由國(guó)外廠家授權(quán)后國(guó)內(nèi)生產(chǎn)商生產(chǎn)的，但是未見(jiàn)有國(guó)內(nèi)學(xué)者自主研發(fā)商品化培養(yǎng)基報(bào)道，希望未來(lái)能對(duì)此做些研究，生產(chǎn)我國(guó)自有品牌的培養(yǎng)基，提高我國(guó)在細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。

在建立細(xì)胞系之初，選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般是根據(jù)來(lái)源組織確定培養(yǎng)基。但近年來(lái)研究顯示，來(lái)源于同一種族同一組織的細(xì)胞系使用的培養(yǎng)基有所不同。王藝舟等[5]建立青魚(yú)鰭條組織細(xì)胞系使用的是DMEM 培養(yǎng)基，張雪萍等[7]則使用的是L-15。來(lái)自不同種族同一組織的細(xì)胞系則可以使用相同的培養(yǎng)基。如來(lái)源于金魚(yú)和鯽魚(yú)的腦組織建立細(xì)胞系都可以使用M199 培養(yǎng)基[26]。當(dāng)然，也有報(bào)道顯示，來(lái)源不同種類(lèi)同一組織細(xì)胞系使用不同的培養(yǎng)基[8,17,39]。同一個(gè)細(xì)胞系也可以在多種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。李苗苗等[40]建立鰻鱺腎臟細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)DMEM/F12 和L15 培養(yǎng)液均適合其正常生長(zhǎng)和增殖,而在MEM 培養(yǎng)液中無(wú)法正常生長(zhǎng)。以上說(shuō)明，在建立原代細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的選擇不具有一定的規(guī)律性。因此，在建立細(xì)胞系初期，可以多選擇幾種培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)。在細(xì)胞系建立后，培養(yǎng)基必須優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基選擇出適合培養(yǎng)該細(xì)胞系的培養(yǎng)基。

血清是細(xì)胞培養(yǎng)最重要的一種營(yíng)養(yǎng)添加物。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系最常用血清是胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）。縱觀近年來(lái)細(xì)胞培養(yǎng)中胎牛血清添加量來(lái)看，僅傅永明等[18]在建立二倍體紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉尾鰭細(xì)胞系時(shí)，使用的血清濃度為30%，通常使用的濃度范圍在10%～20%。這主要是因?yàn)檠鍧舛冗^(guò)高，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，不利于細(xì)胞系生長(zhǎng)。隨著細(xì)胞代數(shù)增加，細(xì)胞系狀態(tài)變?yōu)榉€(wěn)定時(shí)，血清的濃度會(huì)降至10%左右[45]。為了細(xì)胞更好的貼壁生長(zhǎng)，在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系培養(yǎng)時(shí)除了加FBS 外，還添加一定濃度的魚(yú)血清和胚胎提取液[5]。

除了血清，另一種重要的添加物是生長(zhǎng)因子。目前常用生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板和胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor-I，IGF-I）等。Sun 等[48]通過(guò)添加bFGF、EGF 和IGF-I 促進(jìn)來(lái)源半滑舌鰨的性腺細(xì)胞生長(zhǎng)。鄭媛等[45]在來(lái)源半滑舌鰨的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加了bFGF。單莉娟[41]在松江鱸細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加bFGF 和EGF。

在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中還會(huì)經(jīng)常加入其它輔助成分，如Sun 等[48]加入了β-琉基乙醇，可以直接刺激細(xì)胞分裂增殖并保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷；齊文闖等[49]加入的白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）有利于維持細(xì)胞未分化狀態(tài)。

以上培養(yǎng)基和添加劑在魚(yú)類(lèi)組織啟動(dòng)原代培養(yǎng)時(shí)承啟著重要的作用，但是在傳代培養(yǎng)中也易出現(xiàn)細(xì)胞增長(zhǎng)過(guò)快產(chǎn)生細(xì)胞死亡。建議在細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)中要及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)基和添加劑劑量。當(dāng)然，考慮培養(yǎng)基和添加劑成分越簡(jiǎn)單，越有利于后期細(xì)胞系的推廣應(yīng)用，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系在后期傳代過(guò)程動(dòng)物源、無(wú)蛋白和化學(xué)成分限定培養(yǎng)基）培養(yǎng)細(xì)胞系。這是漫長(zhǎng)而復(fù)雜過(guò)程，一旦成功，將開(kāi)啟魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系發(fā)展史上新紀(jì)元。

5 細(xì)胞系的應(yīng)用

隨著魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系發(fā)展，其被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、免疫學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞工程等研究領(lǐng)域。近年報(bào)道顯示，新建的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系主要應(yīng)用在魚(yú)類(lèi)病毒學(xué)研究。這也是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系建立的初衷。

自Wolf 首次利用魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系成功地從鱒性腺細(xì)胞系中分離出第一株魚(yú)類(lèi)病毒傳染性胰臟壞死病毒后[2]，緊接著越來(lái)越多的魚(yú)類(lèi)病毒從魚(yú)類(lèi)細(xì)胞中成功地分離和鑒定，這為魚(yú)類(lèi)疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。鰭條組織細(xì)胞系可用于新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）的研究[19]。腦組織細(xì)胞系可用于鯉皰疹病毒二型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）的研究[26]；脾臟組織細(xì)胞系可用于石斑魚(yú)虹彩病毒（grouper iridovirus,GIV）和鱖傳染性脾腎壞死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）的增殖研究[62]。目前使用細(xì)胞系鑒定的病毒有至少有30 種，包括呼腸孤病毒科、雙RNA 病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、杯狀病毒科、皰疫病毒科、小RNA 病毒科和虹彩病毒科等[20]。

似乎魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系僅能用于魚(yú)類(lèi)病毒的研究，其實(shí)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系還可以用于來(lái)自?xún)蓷珓?dòng)物蛙病毒屬病毒的研究[69]。當(dāng)然，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系是否能用于感染其他水生動(dòng)物病毒的研究還有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞系除了可以分離病毒外，還可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)研究魚(yú)類(lèi)病毒致病機(jī)制，可以從源頭上了解病毒的感染過(guò)程，解決水生動(dòng)物疫病預(yù)防中“卡脖子”問(wèn)題，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

6 存在問(wèn)題和建議

目前，雖然魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)取得了許多成果，但是仍然存在許多尚未解決的問(wèn)題，值得深入研究。

（1）傳代穩(wěn)定性問(wèn)題。正常細(xì)胞的分裂次數(shù)有限，這是遺傳因素所決定，不易改變。因此，從正常組織獲得的細(xì)胞系經(jīng)過(guò)一定次數(shù)的分裂后，就會(huì)細(xì)胞衰老，要防止過(guò)度傳代。此外也要注意細(xì)胞系傳代過(guò)程中細(xì)胞突變現(xiàn)象，即細(xì)胞在培養(yǎng)初期鑒定過(guò)的形態(tài)、功能等，隨著代數(shù)增加表現(xiàn)出現(xiàn)不再一致的現(xiàn)象。

（2）缺乏針對(duì)新發(fā)病毒病病原敏感細(xì)胞系的問(wèn)題。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系在研究病毒中有許多優(yōu)點(diǎn)，但是，單個(gè)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系并不適用于所有病毒增殖。如金魚(yú)腎臟細(xì)胞系對(duì)CyHV-2 不敏感，不能用于CyHV-2 增殖[37]。鱸的鰭條細(xì)胞系不能用來(lái)增殖病毒性神經(jīng)壞死病毒（viral nervous necrosis virus，VNNV）[70]。魚(yú)類(lèi)病毒的易感性具有物種特異性，而來(lái)自同種魚(yú)的不同組織的細(xì)胞系對(duì)病毒敏感性也具有特異性。因此，為了適應(yīng)日益增長(zhǎng)的病毒種類(lèi)，需要建立豐富的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系資源庫(kù)。

（3）國(guó)內(nèi)缺少魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系數(shù)據(jù)庫(kù)：國(guó)內(nèi)細(xì)胞系報(bào)道很多，但多數(shù)研究沒(méi)有跟進(jìn)，即這些研究的可靠性尚未有足夠的證實(shí)。建立一種細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)細(xì)胞系數(shù)據(jù)庫(kù)及時(shí)更新細(xì)胞系相關(guān)信息，有助于及時(shí)了解魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的溯源情況和研究進(jìn)展。

（4）缺少魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的國(guó)內(nèi)流通機(jī)構(gòu)。如在鯉皰疹病毒II 型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）敏感細(xì)胞系研究中，魏鈺娟等[68]在異育銀鯽脊髓組織細(xì)胞系的建立中，雖然已有學(xué)者建立了異育銀鯽腦組織細(xì)胞系[33]和鰭條細(xì)胞系[9]，且研究CyHV-2 敏感性,但由于不對(duì)外供應(yīng),其限制了對(duì)CyHV-2 的研究。錦鯉組織細(xì)胞系[10,21]的研究也存在同樣的問(wèn)題。此外，ATCC 相關(guān)機(jī)構(gòu)雖然可以購(gòu)買(mǎi)一定的細(xì)胞系，但是某些客觀原因，細(xì)胞系不能及時(shí)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室；且國(guó)內(nèi)學(xué)者構(gòu)建部分細(xì)胞系不在ATCC 等機(jī)構(gòu)保藏。因此，應(yīng)建立細(xì)胞系的國(guó)內(nèi)流通機(jī)構(gòu)，保障對(duì)魚(yú)類(lèi)相關(guān)疾病的研究，從也避免相關(guān)研究機(jī)構(gòu)花費(fèi)大量人力、物力和資金建系。