黃鍵，王金娟，周元元，張敏，王紅衛(wèi)，王曉穎，孫雪婷

（南通海關綜合技術中心，江蘇 南通 226004）

香精與香料是化妝品生產(chǎn)中重要的原料之一，不僅可以提供令人愉悅的芳香氣味，掩蓋化妝品原料中的異味，而且可以其特殊的芳香氣味提升化妝品的品質(zhì)，提高產(chǎn)品對消費者的吸引力。相比天然提取物，人工合成的香精與香料組分單一，純度更高，從某些方面來說，人工合成的香料在安全性上要比天然提取物更有保障，因此，人工合成的香精與香料廣泛應用于化妝品生產(chǎn)等領域。香蘭素是人類合成的第一種香料，又名香草醛，與其結(jié)構(gòu)相似的是乙基香蘭素，又名乙基香草醛。香蘭素和乙基香蘭素具有奶香味，是食品、化妝品領域中經(jīng)常使用的人工合成香料。然而，攝入過多的香蘭素會使人體產(chǎn)生不適，甚至損傷內(nèi)臟器官，而皮膚接觸化妝品中的香蘭素會導致過敏反應[1]，因此測定化妝品中香蘭素類香料含量具有重要意義。

針對化妝品中香料的檢測方法主要有色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，如氣相色譜法[2?3]、液相色譜法[4?7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8?12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13?16]等。色譜法使用的儀器較為普及，但是受限于檢測器的靈敏度，檢出限較高且抗干擾能力較弱；色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度較高，但是化妝品對于某些目標物質(zhì)具有較強的基質(zhì)效應，樣品處理過程較為復雜。

目前報道的香蘭素類香料的檢測大部分集中于食品領域[17?20]，化妝品中該類香料的檢測報道較少[21?22]，均使用高效液相色譜法，檢出限較高。筆者在前人研究的基礎上，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時對化妝品中的香蘭素和乙基香蘭素進行分離和檢測，進一步縮短了檢測時間，降低了目標物質(zhì)的檢出限，并利用內(nèi)標法定量消除了基質(zhì)效應的影響，從而簡化了樣品預處理過程。該方法方便快捷、結(jié)果準確，為同時檢測化妝品中的香蘭素類香料提供技術參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：1290 Infinity Ⅱ-6470 LC/TQ型，美國安捷倫科技有限公司。

分析天平：BS 224S 型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

渦旋混合儀：LAB DANCE S25 型，德國IKA公司。

超聲波儀：KQ-50E 型，昆山市超聲儀器有限公司。

離心機：TG16 型，屹譜儀器制造(上海)有限公司。

超純水機：Direct-Q型，德國默克密理博公司。

香蘭素標準品：編號為STBC7969V，純度(質(zhì)量分數(shù))為99.0%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

乙基香蘭素標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))為99.0%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

香蘭素-D3 標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))為99.0%，天津阿爾塔科技有限公司。

乙基香蘭素-D5 標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))為99.5%，天津阿爾塔科技有限公司。

甲醇：色譜純，美國天地有限公司。

甲酸：質(zhì)譜級，美國ACS公司。

高純氮氣：純度(體積分數(shù))大于99.999%，南通天源氣體有限公司。

實驗用水為去離子水，電阻率不小于18 MΩ?cm，自制。

化妝品樣品：市售。

1.2 溶液配制

香蘭素、乙基香蘭素標準貯備液：質(zhì)量濃度均約為1 000 mg/L，分別精確稱取香蘭素和乙基香蘭素各0.01 g，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至2 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標線，混勻。標準貯備液在4 ℃下可大約保存6個月。

香蘭素、乙基香蘭素混合標準中間液：質(zhì)量濃度均約為1 mg/L，分別移取香蘭素和乙基香蘭素標準儲備液各100 μL 至同一只100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋并定容至標線，混勻。標準混合中間液4 ℃下可大約保存3個月。

香蘭素-D3、乙基香蘭素-D5 同位素內(nèi)標儲備液：質(zhì)量濃度均約為1 000 mg/L。分別精確稱取香蘭素-D3和乙基香蘭素-D5各0.01 g，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至2 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標線，混勻。該儲備液在4 ℃下可大約保存6個月。

混合同位素內(nèi)標溶液：香蘭素-D3、乙基香蘭素-D5質(zhì)量濃度均約為1 mg/L，分別吸取香蘭素-D3、乙基香蘭素-D5 同位素內(nèi)標儲備液各100 μL 至同一只100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，混勻。該溶液在4 ℃下可大約保存3個月。

香蘭素、乙基香蘭素系列混合標準工作溶液：精確移取香蘭素、乙基香蘭素混合標準中間液0.05、0.1、0.2、0.5、1 mL至10 mL容量瓶中，各加入0.5 mL混合同位素內(nèi)標溶液，用體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液-甲醇(體積比為80∶20)定容至標線，混勻，得到香蘭素、乙基香蘭素質(zhì)量濃度均分別為5、10、20、50、100 μg/L的系列混合標準工作溶液，其中同位素內(nèi)標的質(zhì)量濃度均為50 μg/L。系列混合標準工作溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜儀

色譜柱：RRHD Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：25 ℃；進樣體積：20 μL；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇，流量為300 μL/min；洗脫方式：梯度淋洗；梯度淋洗程序：0～1 min時B相由20%逐漸增加到50%，1～2 min 時B 相為50%，2～2.5 min 時B 相由50%逐漸增加到80%，2.5～3 min 時B 相為80%，3～3.5 min時B相由80%逐漸減小到20%，3.5～5 min時B相為20%。

1.3.2 質(zhì)譜儀

電離模式：電噴霧電離(ESI)；掃描模式：正離子模式；毛細管電壓：3 500 V；干燥氣：氮氣，溫度為325 ℃，流量為10 L/min；霧化氣：氮氣，壓力為0.31 MPa；鞘氣：氮氣，溫度為295 ℃，流量為11 L/min；碰撞氣：氮氣；數(shù)據(jù)采集模式：多反應監(jiān)測(MRM)模式。表1為兩種目標物及同位素內(nèi)標經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜分析參數(shù)。

表1 香蘭素、乙基香蘭素、香蘭素-D3、乙基香蘭素-D5質(zhì)譜參數(shù)

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品預處理

稱取樣品1.0 g (精確至0.000 1 g)，置于15 mL塑料離心管中，加入50 μL 混合同位素內(nèi)標溶液及8 mL 甲醇，渦旋混勻，待樣品全部溶解后用甲醇定容至10 mL，渦旋混勻1 min 后于超聲波儀中提取15 min，然后將離心管在離心機中以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心分離5 min，精確量取1 mL上清液，經(jīng)氮氣吹干后加入1 mL 0.1%甲酸水溶液-甲醇(體積比為80∶20)，溶液過0.22 μm水相濾膜后備用。

1.4.2 測定方法

在1.3 儀器工作條件下，分別測定香蘭素、乙基香蘭素系列混合標準工作溶液，以目標物的質(zhì)量濃度與相應同位素內(nèi)標質(zhì)量濃度的比值為橫坐標，以目標物色譜峰面積與對應同位素內(nèi)標色譜峰面積的比值為縱坐標，線性擬合后得到二者的標準工作曲線，以保留時間與離子對定性，內(nèi)標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法選擇

從化學結(jié)構(gòu)上看，香蘭素和乙基香蘭素含有酚羥基、醛基和烷氧基，具有一定的極性，易溶于甲醇、乙醇和乙腈等有機溶劑，根據(jù)文獻報道[21?22]，采用反相C18色譜柱，通過調(diào)節(jié)色譜條件即可對二者進行分離，同時也可實現(xiàn)二者與基質(zhì)中干擾物的有效分離，且色譜峰形理想。已報道的化妝品中香蘭素類香料的檢測方法為液相色譜法，使用的檢測器為DAD檢測器，受限于檢測器的靈敏度，使用液相色譜法，香蘭素定量限為0.07 mg/kg，乙基香蘭素定量限為0.10 mg/kg[6]。質(zhì)譜檢測器可排除基質(zhì)的干擾，且具有較高的靈敏度，因此選擇液相色譜對二者進行分離，使用串聯(lián)質(zhì)譜對其進行檢測，以降低其檢測限。在實際樣品的檢測中發(fā)現(xiàn)，化妝品基質(zhì)中的有機物會與目標物相互作用，導致目標物信號減弱，因此ESI源測定香蘭素和乙基香蘭素時具有較強信號抑制的基質(zhì)效應，為消除基質(zhì)效應的影響，提高實驗的準確度，同時兼顧實驗的效率，加入同位素內(nèi)標，以內(nèi)標法定量，整個過程無須衍生化，無須凈化，操作簡便，且定量準確。

2.2 色譜條件選擇和優(yōu)化

超高效液相色譜可使待測物的分離時間大為縮短，利用超高效液相色譜配套的RRHD Eclipse Plus C18型柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)對香蘭素和乙基香蘭素進行分離，使用常用的溶劑如甲醇和乙腈為流動相時，香蘭素和乙基香蘭素均可實現(xiàn)較好的分離，且色譜峰形較為理想。在1.3的儀器條件下，香蘭素和乙基香蘭素的保留時間分別為1.75、2.10 min。使用該色譜柱可滿足常規(guī)測試需求。

液相色譜法中常用甲醇、乙腈等溶劑作為有機相，鹽或酸的水溶液作為水相，按一定比例混合后對待測物進行洗脫。實驗發(fā)現(xiàn)，以甲醇、乙腈作為有機相時，對目標物的分離效果和色譜峰形無顯著影響，而甲醇比乙腈價格便宜，具有成本優(yōu)勢，且毒性比乙腈小，故最終選擇甲醇作為有機相。

由于香蘭素和乙基香蘭素顯示為弱酸性，其化學結(jié)構(gòu)中的酚羥基在水溶液中會部分電離，在選擇流動相時可考慮使用酸性流動相以抑制二者在溶液中的電離，從而獲得更為理想的色譜峰形，同時酸性流動相可提供離子化所需的質(zhì)子，提高信號強度。因此，水相選擇體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液，通過調(diào)節(jié)水相和有機相的比例進行梯度洗脫。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

香蘭素和乙基香蘭素均為弱極性化合物，二者在正離子模式和負離子模式下均可電離。一般說來，在相同條件下，ESI+模式下得到的信號強度高于ESI-模式，由于使用了酸性流動相，其中的氫離子可提供正離子掃描模式下離子化所需的質(zhì)子，進一步提高信號強度，而在負離子掃描模式下，氫離子對待測物的離子化具有抑制作用，因此選用ESI+模式對二者進行離子化。通過對選擇離子進行優(yōu)化，香蘭素的母離子為m/z153，選擇優(yōu)化后豐度較高的m/z65和m/z93作為監(jiān)測離子；乙基香蘭素的母離子為m/z167，選擇m/z65和m/z93作為監(jiān)測離子；香蘭素-D3的母離子為m/z156，監(jiān)測離子為m/z65；乙基香蘭素-D5 的母離子為m/z172，監(jiān)測離子為m/z65。圖1～圖4為混合標準溶液的MRM色譜圖。

圖1 香蘭素的MRM色譜圖

圖2 香蘭素-D3的MRM色譜圖

圖3 乙基香蘭素的MRM色譜圖

圖4 乙基香蘭素-D5的MRM色譜圖

2.4 提取溶劑選擇

化妝品檢測時一般使用有機溶劑對樣品進行溶解和對目標物質(zhì)進行提取。常用于提取目標物的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈等。香蘭素和乙基香蘭素的化學結(jié)構(gòu)中均含有酚羥基，為弱極性化合物，在甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑中溶解度較大。為了與流動相匹配，使用甲醇對化妝品樣品進行溶解并對目標物質(zhì)進行提取。實驗發(fā)現(xiàn)，樣品中加入甲醇渦旋混勻后，溶液為分散均勻的懸濁液或澄清溶液，高速離心后可得到較為清澈的上層溶液。如直接將上層清液過濾后上機測定，由于溶劑效應，得到的色譜峰存在肩峰的情況，因此取上層清液用氮吹儀干燥，再加入初始流動相定容，可得到較為理想的色譜峰形。圖5與圖6分別為空白樣品溶液與加標樣品溶液的選擇離子色譜圖。

圖5 空白化妝品樣品的色譜圖

圖6 空白加標樣品色譜圖

由圖5和圖6可以看出，雖然空白樣品在相應的掃描條件下有幾個雜質(zhì)峰，但是從加標樣品色譜圖可以看出，基質(zhì)雜質(zhì)峰與目標物可實現(xiàn)基線分離，不影響對目標物質(zhì)的測定，且雜峰數(shù)量較少，說明使用上述樣品處理方法與質(zhì)譜參數(shù)進行測試，可實現(xiàn)雜質(zhì)和目標物質(zhì)的分離，且有效降低基質(zhì)對待測物質(zhì)的干擾。

2.5 線性方程與檢出限

按1.3儀器工作條件依次對香蘭素、乙基香蘭素系列混合標準工作溶液進行測定，以香蘭素和乙基香蘭素色譜峰面積與對應同位素內(nèi)標色譜峰面積的比值(y)為縱坐標，二者的質(zhì)量濃度與相應同位素內(nèi)標質(zhì)量濃度的比值(x)為橫坐標，線性擬合后得到二者的標準工作曲線，分別計算二者的線性方程和線性相關系數(shù)。按實驗方法對空白樣品進行低質(zhì)量濃度加標試驗，逐漸降低加標的質(zhì)量濃度，以3倍信噪比(S/N)時的質(zhì)量濃度為檢出限。香蘭素和乙基香蘭素的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)及檢出限見表2。

表2 香蘭素和乙基香蘭素的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)及檢出限

由表2可知，香蘭素和乙基香蘭素的質(zhì)量濃度在5～100 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)均為0.999 8，香蘭素和乙基香蘭素的方法檢出限均為5 μg/kg。

2.6 加標回收與精密度試驗

選用空白化妝品為基質(zhì)，按1.4實驗方法測定并進行加標回收試驗，加標量分別為100、500、1 000 μg/kg，每個加標濃度水平平行測定6 次，測定結(jié)果見表3。由表3可知，香蘭素平均回收率為87.8%～96.1%，測定結(jié)果的相對標準偏差為2.5%～3.8%，乙基香蘭素平均回收率為80.1%～83.8%，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.7%～4.6%，方法精密度、準確度均滿足要求。

表3 加標回收與精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對化妝品中的香蘭素和乙基香蘭素進行分離和測定，在5 min內(nèi)成功實現(xiàn)了2種化合物的分離檢測。該方法操作簡便，準確度高，為化妝品中香蘭素類香料的篩查和測定提供了一定的借鑒。