鄭偉濤 胡康洪*

(湖北工業(yè)大學(xué)1.中德生物醫(yī)學(xué)中心;2.工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心;3.國家外專局/教育部細(xì)胞調(diào)控與分子藥物“111”引智基地,武漢 430068)

引 言

近年來,疾病的多發(fā)使得臨床導(dǎo)尿管的使用量逐漸增多,留置導(dǎo)管是醫(yī)院為患者解決不能自主排尿的主要方案,然而,長期留置導(dǎo)管會導(dǎo)致細(xì)菌感染[1]。導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染(catheter-associated urinary tract infection,CAUTI)是由長期在患者體內(nèi)留置導(dǎo)管造成的,是醫(yī)院常見的細(xì)菌感染之一,可引起許多醫(yī)療并發(fā)癥,例如導(dǎo)管結(jié)痂、膀胱結(jié)石、敗血癥、內(nèi)毒素休克和腎盂腎炎[2-3]。因此,如何減少和預(yù)防CAUTI 的發(fā)生是臨床上亟待解決的問題。造成CAUTI 的主要原因為細(xì)菌易在導(dǎo)管表面黏附并形成難以清除的生物膜,該過程涉及的主要細(xì)菌包括大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等[4-5]。面對臨床的迫切需求,開發(fā)具有抗菌效果的導(dǎo)尿管成為科研工作者及醫(yī)療保健企業(yè)等共同關(guān)注的重點。目前,臨床上應(yīng)對CAUTI 的主要策略是對導(dǎo)管材料表面進(jìn)行物理及化學(xué)方面的修飾改性(如涂敷抗菌涂層),使其可以將殺菌劑釋放到環(huán)境中,從而起到持續(xù)的抗菌及殺菌效果,這是預(yù)防生物膜形成的有效手段之一[6-9]。

近年來,一氧化氮(NO)作為抗菌劑在生物抗菌領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。NO 是一種內(nèi)皮源性舒張因子,研究發(fā)現(xiàn),其反應(yīng)副產(chǎn)物如N2O3和ONOO-(過氧亞硝酸鹽)可通過氧化和亞硝基化應(yīng)激,對微生物蛋白質(zhì)、DNA、代謝酶和外膜結(jié)構(gòu)造成氧化和亞硝基化損傷,從而改變重要的蛋白質(zhì)功能并誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞死亡,從而根除細(xì)菌[10-11]。NO 作為殺菌劑已被證明可以對抗廣泛的革蘭氏陰性菌(如銅綠假單胞菌和大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌),以及耐藥細(xì)菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))[12-13]。已有研究證明NO 釋放可以有效防止細(xì)菌黏附[14],采用模擬內(nèi)源性NO 釋放的聚合物材料抗菌提供了一種潛在的解決醫(yī)療器械相關(guān)感染的方法。S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)是一種成本低、安全性高的S-亞硝基硫醇(RSNO)類NO 供體,可以分解并釋放NO,其中RSNO 是一類新興的內(nèi)源性和外源性NO 供體。當(dāng)SNAP 摻入吸水率非常低的聚合物時,可長期持續(xù)釋放NO。Wo 等[15]制備了一種SNAP 摻雜的CarboSil 聚合物導(dǎo)管,在生理通量水平上該導(dǎo)管可持續(xù)釋放NO超過3 周,實驗結(jié)果表明其可以顯著降低細(xì)菌的生存能力。然而,目前關(guān)于SNAP 導(dǎo)尿管抗菌性能的研究仍缺乏在大動物模型上的進(jìn)一步評價。因此,本文制備了可持續(xù)釋放NO 的SNAP 導(dǎo)尿管,評價了其在體外及綿羊體內(nèi)的抗菌性能,以期為SNAP 導(dǎo)尿管的臨床應(yīng)用提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 實驗材料

一次性使用無菌硅膠導(dǎo)尿管,廣州維力醫(yī)療器械股份有限公司;納米銀抗菌導(dǎo)尿管,美昕醫(yī)療器械(上海)有限公司;金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸 埃 希 菌 ( ATCC8739 )、銅 綠 假 單 胞 菌(ATCC9027)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC10031),武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心;胰酪胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;血管鞘(402-606X),北京迪瑪克醫(yī)藥科技有限公司;泌尿道引導(dǎo)絲(1001780-HC),張家港市華美醫(yī)療器械有限公司;一次性使用球囊壓力泵(SM-IDA2530H-TB),深圳市昕力醫(yī)療設(shè)備開發(fā)有限公司;Y 型閥(DMK-Y)、三通(409511CN)、指引導(dǎo)管(LA6JR40)、丙泊酚,四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司;舒泰,北京佑寵生物科技有限公司;異氟烷,友誠生物科技有限公司;0.9%生理鹽水,河南科倫藥業(yè)有限公司;肝素鈉注射液,齊魯制藥有限公司;注射用青霉素鈉,瑞陽制藥有限公司;非吸收性外科縫線,揚州環(huán)宇醫(yī)療器械有限公司;N-乙酰-D-青霉胺(Nacetyl-D-penicillamine,NAP)、亞硝酸鈉(NaNO2),Sigma-Aldrich 公司;PBS 緩沖液(pH7.2 ～7.4),Gibco 公司;鹽酸(HCl)、丙酮、乙醚、四氫呋喃(THF),均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA),純度≥99.5%,北京索萊寶科技有限公司。

雌性綿羊,30 ～40 kg,來源于濃濃(北京)生物科技有限公司。常溫飼養(yǎng),每籠一只,普通飼料喂養(yǎng),每只每天供給其體重5%的飼料,自由攝食,自由飲水,每天沖洗清潔羊籠,直至實驗結(jié)束。實驗動物福利與倫理審查預(yù)先經(jīng)湖北工業(yè)大學(xué)中德生物醫(yī)學(xué)中心生命科學(xué)研究倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計(UV-Vis)(UV-752),Shimadzu 公司;一氧化氮分析儀(Nitric Oxide Analyzer)(NOA 280i),美國通用電氣集團(tuán)分析儀器公司;恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-1102C),上海智誠分析儀器制造有限公司;離心機(jī)(Sorvall Legend Micro 17),Thermo Scientific 公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱(DNP -9082),上海精宏實驗設(shè)備有限公司;呼吸麻醉機(jī)(ACM608),北京航天長峰公司;呼吸機(jī)(SV350)、除顫儀(BeneHert D6),深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 SNAP 的合成

按照文獻(xiàn)[16]的方法合成SNAP。稱取0.478 g NAP 溶解于8.0 mL 水(含有2.5 mL 的1.0 mol/L HCl)中,加入0.173 g NaNO2,在5 ℃下攪拌40 min后,用5 mL 丙酮處理該溶液并繼續(xù)攪拌10 min。抽濾除去綠色沉淀物,用冰水洗滌5 次,用10 mL 丙酮和乙醚的混合溶劑洗滌3 次,得到產(chǎn)物SNAP,置于真空干燥箱中干燥。使用紫外可見分光光度計在200 ～700 nm 的范圍內(nèi)記錄UV-Vis 光譜。

1.3 SNAP 導(dǎo)尿管的制備

參照文獻(xiàn)[17]的方法制備SNAP 導(dǎo)管。將SNAP 溶解在THF 中15 min(SNAP 的質(zhì)量濃度為125 mg/mL),然后將一次性使用無菌硅膠導(dǎo)管在黑暗中完全浸入含有SNAP 的THF 溶液中2 h。在該溶脹/浸漬期之后,在通風(fēng)櫥中將導(dǎo)管在黑暗環(huán)境下干燥72 h 以去除殘留溶劑,得到SNAP 導(dǎo)尿管。

1.4 NO 釋放量測定

將SNAP 導(dǎo)管剪成長度為1 cm 的小段,將導(dǎo)管段放置在琥珀色玻璃瓶中,瓶內(nèi)裝有4 mL PBS 緩沖液(pH 7.4)和100 μmol/L EDTA(浸入37 ℃水浴中),使用一氧化氮分析儀測定SNAP 導(dǎo)管的NO 釋放量。NO 持續(xù)產(chǎn)生后,立即被N2掃氣和鼓泡器凈化并掃入化學(xué)發(fā)光檢測室。在測定NO 釋放量期間,將所有導(dǎo)管置于新鮮的PBS 緩沖液中,并且在每次測量后在沒有環(huán)境光的條件下于37 ℃孵育。

1.5 體外抗菌性能評價

1.5.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌加入TSB 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),在(37 ±2)℃的條件下培養(yǎng)至其菌液的OD600(600 nm波長下的吸光度值)為0.45 左右,此時菌液濃度通常為106～107cfu/mL,各試驗菌種的濃度如表1所示。

表1 受試菌種的濃度Table 1 Concentrations of the tested bacteria

1.5.2 導(dǎo)尿管預(yù)處理

將制備的SNAP 導(dǎo)尿管剪成長度為1 cm 的小段,陰性對照樣品(一次性無菌硅膠導(dǎo)尿管)與陽性對照樣品(納米銀抗菌導(dǎo)尿管)均制成與受試樣品等長的小段。

1.5.3 試驗菌接種

將200 mL TSA 培養(yǎng)基(融化后用水浴冷卻至45 ℃左右)與20 mL 新鮮培養(yǎng)的菌液充分混合,然后倒在平板上,在培養(yǎng)基未凝固時用無菌鑷子將長度為1 cm 的導(dǎo)尿管分別垂直插入和平行放置于TSA 平板培養(yǎng)基中。每個平板放置1 個SNAP 導(dǎo)尿管、1 個納米銀抗菌導(dǎo)尿管和1 個一次性無菌硅膠導(dǎo)尿管,每兩個樣品之間距離25 mm 以上,樣品與平板邊緣距離15 mm 以上,然后蓋上培養(yǎng)皿等待凝固。

1.5.4 培養(yǎng)與觀察

待培養(yǎng)基凝固后,將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 ～18 h,取出觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生,并選取均勻的抑菌圈測量其直徑。

1.6 體內(nèi)抗菌性能評價

1.6.1 實驗分組

將24 只綿羊平均分成4 組,每組6 只。其中1組為正常飼養(yǎng)對照組,另外3 組為實驗組:SNAP 導(dǎo)尿管組、納米銀抗菌導(dǎo)尿管組、一次性硅膠導(dǎo)尿管組。

1.6.2 綿羊?qū)蚬芰糁媚Ｐ偷臉?gòu)建

參照文獻(xiàn)[18]的方法構(gòu)建綿羊?qū)蚬芰糁媚Ｐ?。將綿羊麻醉后,用碘伏對綿羊的尿道周圍進(jìn)行消毒,確保導(dǎo)管插入時周圍環(huán)境處于無菌狀態(tài)。按住綿羊,使其仰臥位導(dǎo)尿,打開導(dǎo)尿包,用鑷子夾住碘伏棉球?qū)d羊尿道口處進(jìn)行常規(guī)消毒后鋪巾,用無菌水劑潤滑導(dǎo)尿管,并保持導(dǎo)尿管夾處于松開狀態(tài)。用鑷子持導(dǎo)尿管輕輕插入尿道,插入的深度為距離尿道口2 ～5 cm,見有尿液流出后再插入2 cm,導(dǎo)尿管外端開口置于接尿盒中。固定住止回閥外壁,用不帶針頭的注射器經(jīng)閥門注入額定的無菌水,使膨脹的球囊卡在膀胱出口。固定閥門外壁,緩慢拔下注射器,止回閥閥門自動密封,保持球囊膨脹。留取中段尿,置于無菌試管中送檢,用于細(xì)菌培養(yǎng)。連接引流袋和導(dǎo)尿管,如不需要持續(xù)導(dǎo)尿,則夾閉導(dǎo)尿管夾。用無菌縫合線將引流袋和導(dǎo)尿管固定到綿羊尾部,并對縫合線部位消毒。手術(shù)后,固定住導(dǎo)管止回閥,用不帶針頭的空注射器插入止回閥內(nèi),抽吸球囊中的水,當(dāng)抽出水與注入水的體積接近時緩慢拔出導(dǎo)尿管。如需留置導(dǎo)尿管,則用膠布將其固定。

1.6.3 尿液含菌量檢測

每日觀察實驗動物的精神狀態(tài)、行為活動和攝食等情況,分別在第1、3、7、17 天(一般硅膠對照組最長15 天)收集綿羊尿液中段2 管,送往醫(yī)院進(jìn)行尿常規(guī)檢測和尿液細(xì)菌學(xué)檢查。采用培養(yǎng)菌落計數(shù)的方法測定尿液含菌量:取200 mL TSA 培養(yǎng)基倒在平板上待其完全凝固,然后將收集的尿液標(biāo)本輕輕混勻,用定量接種環(huán)分別取尿液1 μL 涂抹接種于平板上,倒置,于35 ～37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h,觀察細(xì)菌的菌落生長情況并進(jìn)行計數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 SNAP 的UV-Vis 測試結(jié)果

對合成的SNAP 進(jìn)行紫外可見分光光度檢測,結(jié)果如圖1 所示。在339 nm 波長處SNAP 有最大吸光度,符合SNAP 的特征吸收峰,表明合成的SNAP 成功引入了亞硝基硫醇結(jié)構(gòu)。

圖1 SNAP 的UV-Vis 譜圖Fig.1 UV-Vis spectrum of SNAP

2.2 SNAP 導(dǎo)管的NO 釋放量

圖2 為SNAP 導(dǎo)管的典型NO 釋放曲線,可以看出,在約600 s 時即觀察到NO 的釋放,釋放量約為0.3 ×10-10mol/(min·cm2),此后NO 釋放量緩慢增加。圖3 為SNAP 導(dǎo)管在20 天中的NO 長期釋放曲線,在第1 天觀察到NO 的釋放量最大,約為1.8 ×10-10mol/(min·cm2),這 主 要 歸 因 于SNAP在導(dǎo)管表面的分布,即SNAP 從導(dǎo)管表面的最外層快速浸出到緩沖液中。當(dāng)最外層區(qū)域的SNAP 耗盡后,在第2 天NO 釋放量開始下降(約為0.5 ×10-10mol/(min·cm2)),然后在接下來的18 天內(nèi)NO釋放量逐漸下降到0.1×10-10mol/(min·cm2)。導(dǎo)管中涂層的大部分SNAP 分子是以結(jié)晶形式存在的,嵌入聚合物主體中的結(jié)晶SNAP 需要一定時間溶解和釋放NO,因此認(rèn)為這種緩慢的晶體溶解過程是SNAP 導(dǎo)管能夠長期釋放NO 的原因。

圖2 SNAP 導(dǎo)管的典型NO 釋放曲線Fig.2 Typical NO release curve of the SNAP catheter

圖3 SNAP 導(dǎo)管的NO 長期釋放曲線Fig.3 Long-term NO release curve of the SNAP catheter

2.3 SNAP 導(dǎo)尿管的體外抗菌性能

SNAP 導(dǎo)尿管對各試驗菌種的抑菌圈如圖4所示,抑菌圈直徑測量結(jié)果如表2 所示。在兩種導(dǎo)尿管放置方式的實驗中,SNAP 導(dǎo)尿管對金黃色葡萄球菌均具有清晰可見的抑菌圈,垂直插入法和平行放置法的抑菌圈直徑分別為2.59 mm 和2.75 mm,表明SNAP 導(dǎo)尿管對金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌效果。在其他菌種的測定結(jié)果中均未觀察到清晰的抑菌圈,表明SNAP 導(dǎo)尿管對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌沒有抑菌效果。

圖4 SNAP 導(dǎo)尿管、納米銀導(dǎo)尿管和一次性硅膠導(dǎo)尿管對不同菌種的抑菌圈實驗結(jié)果Fig.4 Experimental results showing the inhibition zones for the SNAP catheter, nano-silver catheter and disposable silica gel catheter against different strains

表2 SNAP 導(dǎo)尿管對不同菌種的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of the SNAP catheter against different strains

2.4 SNAP 導(dǎo)尿管的體內(nèi)抗菌性能

在臨床的尿常規(guī)檢測中,當(dāng)尿液含菌量大于105cfu/mL 時,提示有泌尿系統(tǒng)感染。對各組留置導(dǎo)尿管后1、3、7、17 天的尿液進(jìn)行尿常規(guī)檢測和尿液細(xì)菌學(xué)檢查,得到各組綿羊的尿液含菌量,如表3所示。結(jié)果顯示,總體上看留置SNAP 導(dǎo)尿管的綿羊組比留置納米銀導(dǎo)尿管組和硅膠導(dǎo)尿管組的尿液含菌量更低。在第17 天,留置SNAP 導(dǎo)尿管的綿羊尿液中未檢測到菌殘留;在留置納米銀導(dǎo)尿管組中,在第17 天有2 只綿羊的尿液含菌量大于105cfu/mL,有2 只綿羊的尿液含菌量為104～105cfu/mL,提示納米銀導(dǎo)尿管在體內(nèi)留置較長時間后會誘發(fā)尿路感染;在留置硅膠導(dǎo)尿管組中,在第15 天有1 只綿羊的尿液含菌量大于105cfu/mL。以上結(jié)果表明,相較于納米銀導(dǎo)尿管和硅膠導(dǎo)尿管,SNAP 導(dǎo)尿管具有較為明顯的抗菌效果。

表3 各實驗組在不同時間的綿羊尿液含菌量Table 3 Bacterial content in the urine of sheep in each experimental group at different times

3 結(jié)論

(1)SNAP 導(dǎo)管的典型NO 釋放曲線表明,在約600 s 時即可觀察到NO 的釋放(釋放量約0.3 ×10-10mol/(min·cm2)),此后NO 釋放量緩慢增加;NO 長期釋放曲線表明,在第1 天觀察到NO 的釋放量可達(dá)1.8 ×10-10mol/(min·cm2),此后NO 釋放量逐漸下降并可持續(xù)釋放20 天。

(2)體外抑菌實驗表明,SNAP 導(dǎo)尿管對金黃色葡萄球菌有較明顯的抑菌作用,垂直插入法和平行放置法測得的抑菌圈直徑分別為2.59 mm 和2.75 mm,但SNAP 導(dǎo)尿管對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌沒有抑菌作用。

(3)在體內(nèi)抗菌活性測定實驗中,在監(jiān)測17 天后,在SNAP 導(dǎo)尿管組的綿羊尿液中未檢測到細(xì)菌,而在納米銀導(dǎo)尿管組和硅膠導(dǎo)尿管組的綿羊尿液中均檢測出含菌量大于105cfu/mL。結(jié)果表明SNAP導(dǎo)尿管具有較好的體內(nèi)抗菌性能。