袁瑛姿 鐘泓卉 楊雨潼 姚 歡 張曉玲 王 崢 魏勇軍*

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院, 鄭州 450001;2.鄭州大學(xué) 合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450001;3.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029)

引 言

中藥黃芪(Astragali radix)是重要的臨床大宗藥材之一,為蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根。研究表明,黃芪具有調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗氧化、抗菌等多種藥理活性[1]。黃芪含有復(fù)雜多樣的天然產(chǎn)物,其中黃酮類、多糖類和皂苷類為主要的藥用活性成分。黃芪中黃酮類活性成分主要包括黃酮、異黃酮、異黃烷、紫檀烷等,具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、改善心血管功能[4]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[5]等藥理作用。黃芪多糖主要有雜多糖、葡聚糖兩大類,具有抗腫瘤[6]、抗炎癥[7]、保護(hù)心臟[8]等藥理活性。黃芪皂苷類成分包括Cycloartane 型四環(huán)三萜、Oleanane 型五環(huán)三萜及其他萜類[9]。黃芪甲苷的活性形式——環(huán)黃芪醇具有抑制腦缺血時(shí)腦細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥、維持血腦屏障[10]等藥理作用。此外,環(huán)黃芪醇還是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有端粒酶活性的小分子萜類化合物,除了能夠治療神經(jīng)退行性疾病[11],還具有抑制心肌纖維化[12]、增強(qiáng)抗腫瘤免疫[13]等作用,是抗衰老藥物研發(fā)中的熱門分子[14]。因此,黃芪已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、日化、保健食品、禽畜飼料等多個(gè)領(lǐng)域。

環(huán)黃芪醇主要通過轉(zhuǎn)化黃芪中的黃芪甲苷獲取,但是現(xiàn)有的制備方法存在諸多不足,導(dǎo)致其難以低成本大規(guī)模生產(chǎn)。合成生物學(xué)方法可以幫助構(gòu)建具有高產(chǎn)率、高純度產(chǎn)物的可控生產(chǎn)平臺(tái),合成復(fù)雜多樣的植物天然產(chǎn)物,并進(jìn)一步揭示植物次生代謝合成途徑及其關(guān)鍵酶[15]。目前,運(yùn)用合成生物學(xué)方法已成功在酵母中異源合成了甘草次酸[16]、人參皂苷[17-19]、柴胡皂苷元[20]、羅漢果苷[21]等植物萜類天然產(chǎn)物,其中部分萜類天然產(chǎn)物的酵母合成已進(jìn)行了產(chǎn)業(yè)化嘗試,這為環(huán)黃芪醇在酵母等微生物中的合成提供了參考。本文綜述了環(huán)黃芪醇的生物合成關(guān)鍵酶挖掘、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)底盤細(xì)胞改造,并對(duì)環(huán)黃芪醇的酵母高效合成進(jìn)行了討論。

1 環(huán)黃芪醇的現(xiàn)有制備方法

環(huán)黃芪醇在黃芪中含量極低,難以直接獲取。可以通過黃芪種植和組織培養(yǎng)技術(shù)獲取黃芪甲苷,然后采用酸解法、Smith 降解法、酶和微生物水解法等手段將黃芪甲苷轉(zhuǎn)化為環(huán)黃芪醇。

酸解法可以水解黃芪甲苷生成環(huán)黃芪醇,常用硫酸、鹽酸、乙酸在水或稀醇溶液中進(jìn)行。楚治良等[22]將黃芪甲苷粉末加入到含有鹽酸、甲醇和三氯甲烷的反應(yīng)體系中,反應(yīng)6 天后,環(huán)黃芪醇的收率可達(dá)45%以上。Smith 降解法是制備環(huán)黃芪醇的常用方法,使用高碘酸選擇性氧化黃芪甲苷中的羥基,并進(jìn)一步經(jīng)硼氫化合物還原得到多糖醇,然后在酸性條件下多糖醇發(fā)生特異性水解,生成環(huán)黃芪醇。Feng 等[23]采用Smith 法降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇,對(duì)試劑用量?jī)?yōu)化后,環(huán)黃芪醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率可達(dá)80%以上。

酶和微生物水解法的原理是利用β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶等多種糖基水解酶水解黃芪甲苷的多種糖苷鍵,從而得到環(huán)黃芪醇。Cheng 等[24]篩選并克隆了Phycicoccussp.Soil748(Bgps)中的β-葡萄糖苷酶,對(duì)該酶的最適溫度和pH 等酶學(xué)特性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在45 ℃、pH7.0、底物質(zhì)量濃度為80 mg/mL 的條件下,該酶水解黃芪甲苷的轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.2%。Li 等[25]從Dictyoglomus thermophilum中克隆純化得到β-葡萄糖苷酶Dth3 和β-木糖苷酶Xln-DT,并通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了酶活特性,在最優(yōu)條件(75 ℃,pH5.5)下,Dth3 和Xln-DT 共催化可以在3 h 內(nèi)將1 g/L 黃芪甲苷轉(zhuǎn)化為0.63 g/L 環(huán)黃芪醇,摩爾轉(zhuǎn)化效率可達(dá)94.5%。Cheng 等[26]在Pichia pastoris和Escherichia coli中進(jìn)行密碼子優(yōu)化后表達(dá)了重組β-木糖苷酶Xyl-T,在特定的溫度和pH 下經(jīng)過兩步酶催化反應(yīng),該酶可以將20 g 黃芪甲苷轉(zhuǎn)化為12.02 g 環(huán)黃芪醇,環(huán)黃芪醇收率達(dá)到96.5%。此外,雙歧桿菌和乳酸菌等人體腸道菌和部分其他環(huán)境微生物也具有將黃芪甲苷轉(zhuǎn)化為環(huán)黃芪醇的能力[27-28]。未來,應(yīng)用宏基因組學(xué)、培養(yǎng)組學(xué)等微生物組學(xué)方法,有望獲取更多高效的微生物和糖基水解酶用于環(huán)黃芪醇的制備[29-33]。

黃芪種植占用土地,黃芪的生長(zhǎng)易受氣候、溫度和濕度等多種因素影響,并且收獲的黃芪中有效物質(zhì)的含量不統(tǒng)一,難以進(jìn)行規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。黃芪幼苗的根中皂苷含量較高,是進(jìn)行組織培養(yǎng)的理想部位。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件,可以使黃芪在組織培養(yǎng)過程中積累豐富的黃芪皂苷。Jiao 等[34]對(duì)黃芪毛狀根培養(yǎng)36 d 后,黃芪毛狀根中總生物量可達(dá)15.79 g/L(干重),總黃芪皂苷累積含量達(dá)到2.657 mg/g(干重),與田間種植3 年的黃芪生根中總黃芪皂苷的含量(2.435 mg/g(干重))相近。

植物組織培養(yǎng)不占用土地,但需嚴(yán)格控制環(huán)境條件,并且培養(yǎng)過程中容易被污染,因此通過組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模獲取黃芪生物質(zhì)的成本較高。酸解法、Smith 降解法制備環(huán)黃芪醇的成本也較高,并且需要使用多種化學(xué)試劑,生產(chǎn)過程易造成環(huán)境污染;酶和微生物水解法制備的環(huán)黃芪醇產(chǎn)物的分離純化困難,不利于應(yīng)用推廣。因此,亟待開發(fā)其他綠色可持續(xù)發(fā)展的環(huán)黃芪醇制備方法。

2 環(huán)黃芪醇生物合成的關(guān)鍵酶

黃芪植物中生物合成三萜皂苷的途徑可分為以下3 部分。

(1)三萜皂苷的通用前體異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)的合成。植物具有兩條合成萜類前體IPP 的途徑:一條是甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑,主要存在于植物細(xì)胞質(zhì)中;另一條是2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途徑,主要存在于植物細(xì)胞質(zhì)體區(qū)室內(nèi)。經(jīng)異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI)催化,IPP 與DMAPP 可實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化。

(2)IPP 在多種酶的催化下聚合得到2,3-氧化角鯊烯,然后經(jīng)氧化角鯊烯環(huán)化酶(2,3-oxidosqualene cyclase,OSC)催化得到不同的三萜骨架。

(3) 三萜骨架在細(xì)胞色素P450(cytochrome P450s,CYP450s)、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyl transferase,UGT)等修飾下合成多種三萜類化合物。

在以上合成三萜皂苷的途徑中,OSC、CYP450s等酶在合成多樣化的三萜化合物方面發(fā)揮了重要作用,是植物三萜化合物生物合成中的關(guān)鍵酶。

2.1 氧化角鯊烯環(huán)化酶

OSC 是三萜皂苷下游合成階段的第一個(gè)限速酶,可催化2,3-氧化角鯊烯環(huán)化生成三萜骨架。Liu等[35]將雷公藤OSC 基因進(jìn)行了異源表達(dá),發(fā)現(xiàn)TwOSC4 和TwOSC6 是環(huán)阿屯醇合酶。Chen 等[36]從Astragalus membranaceus中克隆了兩個(gè)OSC 基因,并對(duì)其在膜莢黃芪中的功能進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)AmOSC3 與環(huán)阿屯醇的合成有關(guān)。Huang 等[37]從Camellia sasanqua中發(fā)掘了7 種OSC 基因并在酵母中進(jìn)行了功能表征,最終確定CsOSC5 和CsOSC7 為環(huán)阿屯醇合酶。Guo 等[38]利用酵母表達(dá)系統(tǒng)確定了主要在重樓(Paris polyphylla)葉片中表達(dá)的環(huán)阿屯醇合酶基因PpCAS,這是首個(gè)報(bào)道的來自于重樓的環(huán)阿屯醇合酶基因。Kawano 等[39]發(fā)現(xiàn)來源于Costus speciosus的CsOSC1(AB058507)基因能夠編碼環(huán)阿屯醇合酶,這是首個(gè)報(bào)道的單子葉植物環(huán)阿屯醇合酶。

2.2 細(xì)胞色素P450 單加氧酶

細(xì)胞色素P450 單加氧酶是一個(gè)龐大的家族,是植物次生代謝產(chǎn)物多樣性的通用驅(qū)動(dòng)因子。在三萜皂苷的合成途徑中,CYP450s 在底物的特定部位引入氧原子,催化三萜骨架進(jìn)行羥基化、羰基化、環(huán)氧化、去甲基化等結(jié)構(gòu)修飾[40-42]。通過對(duì)環(huán)阿屯醇與環(huán)黃芪醇的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)環(huán)黃芪醇在C6、C16、C25 位有羥基,C21 與C24 位環(huán)氧化為五元環(huán),推測(cè)環(huán)阿屯醇可能經(jīng)CYP450 羥基化與環(huán)氧化后轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)黃芪醇。本文分析了催化與環(huán)阿屯醇骨架相似的化合物的CYP450s,篩選了具有催化四環(huán)三萜皂苷與甾醇等的環(huán)氧化和羥基化活性的7 種CYP450s,并通過比對(duì)等方法進(jìn)一步從Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了38 條相關(guān)序列,以鄰接法建立了系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖1。在此基礎(chǔ)上,本文從Plant Cytochrome P450 Database、Uniprot 和PubChem 下載了部分CYP450s 的PDB 數(shù)據(jù)和環(huán)阿屯醇SDF 數(shù)據(jù),采用PCPLD 和AlphaFold-P450 工具(http://p450.biodesign.ac.cn/)預(yù)測(cè)了部分CYP450s 與環(huán)阿屯醇的分子對(duì)接,并運(yùn)用UCSF Chimerax 進(jìn)行了可視化處理,結(jié)果見圖2。

圖1 部分具有羥基化和環(huán)氧化活性的CYP450s 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of some CYP450s with hydroxylation and epoxidation activities

圖2 部分CYP450s 與環(huán)阿屯醇的分子對(duì)接Fig.2 Molecular docking between some CYP450s and cycloartenol

人們已經(jīng)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹中的幾種CYP450s 進(jìn)行了多項(xiàng)酶學(xué)研究。Hodgson 等[43]的研究表明,來自苦楝(Melia azedarach)的MaCYP71CD2 和Ma-CYP71BQ5 可氧化印楝素前體(Tirucalla-7,24-dien-3β-ol)的尾端形成半縮醛環(huán)式結(jié)構(gòu)。Villard 等[44]發(fā)現(xiàn)CYP76F112 在呋喃香豆素的合成途徑中發(fā)揮著重要的環(huán)化作用。Takase 等[45]對(duì)多種CYP450s在葫蘆素生物合成中的作用進(jìn)行了研究,他們將CYP81AQ19 與葫蘆二烯醇合酶在酵母中共表達(dá),發(fā)現(xiàn)CYP81AQ19 具有烯丙基羥基化活性;經(jīng)過溫和的酸處理后,可引發(fā)產(chǎn)物C23-OH 基團(tuán)異構(gòu)化為C25-OH 以及雙鍵遷移。有研究表明CYP716A12和其他CYP716A 亞家族酶大多為C28 氧化酶[46],但部分CYP716A 具有C6 羥基化活性, 例如CYP716A53v2 可羥基化原萘二醇的C6 位,得到原萘三醇[47]。將CYP6H 在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá),也可實(shí)現(xiàn)外源性原萘二醇C6 位的羥基化[48]。Miettinen 等[49]通過酵母表征了不同藥用植物的CYP716 酶,他們從耬斗菜(Aquilegia coerulea)中鑒定出CYP716A113v1,該酶可能參與甾體皂苷的生物合成,能夠羥化甾體皂苷前體環(huán)阿屯醇或酵母甾醇前體等其他四環(huán)三萜類化合物,但其具體氧化部位未知。Dong 等[50]研究確定了葫蘆素生物合成途徑中的2 個(gè)CYP450s,證明了CYP708A16 可催化葫蘆二烯醇轉(zhuǎn)化為16-β-羥基葫蘆二烯醇。

CYP450s 在植物進(jìn)化的過程中可能獲得新的活性,例如苔蘚植物(Calohypnum plumiforme)獨(dú)立進(jìn)化出2 個(gè)莫內(nèi)酯生物合成基因簇,它們與水稻相關(guān)酶的特性相同,但屬于不同的P450 家族[51]。此外,利用整合系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計(jì)算和數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)(data driven design)等方法,重新設(shè)計(jì)改造CYP87D20 等多功能酶的活性位點(diǎn),有望將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝У暮J二烯醇C11 羥化酶[52-53]。未來,除了從黃芪中挖掘環(huán)黃芪醇合成所需的CYP450s 外,還可以通過多組學(xué)技術(shù)在多種植物中獲取環(huán)黃芪醇合酶。

3 釀酒酵母底盤細(xì)胞的構(gòu)建與優(yōu)化

釀酒酵母、大腸桿菌等微生物是異源合成多種植物天然產(chǎn)物的主要底盤細(xì)胞。大腸桿菌具有發(fā)酵周期短(2 ～3 d)、萜類合成途徑簡(jiǎn)單和不分流等優(yōu)勢(shì)。目前,已在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了環(huán)阿屯醇的合成[54],但是大腸桿菌缺少細(xì)胞器, CYP450s 在大腸桿菌等細(xì)菌中通常難以表達(dá)[55]。此外,大腸桿菌內(nèi)的MEP 途徑多用于合成酮類、醇類和酸類等化合物,較少用于萜類合成[56]。酵母具有MVA 代謝途徑,能夠提供三萜合成所需的前體物質(zhì)[57-58];釀酒酵母具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、過氧化物酶體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),有利于植物源關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[59],并且能夠?yàn)橹参锶祁惢衔锬负说暮铣商峁┻m宜的反應(yīng)場(chǎng)所;酵母還能對(duì)萜類母核進(jìn)行糖基化、羥基化等修飾。目前,已在酵母中實(shí)現(xiàn)了多種三萜苷元及皂苷的異源生物合成[60-63],這為酵母合成環(huán)黃芪醇提供了參考。此外,釀酒酵母也被認(rèn)定為安全的微生物(generally recognized as safe, GRAS)[64],已廣泛應(yīng)用于多種食品、藥品的合成[65-67],因此是環(huán)黃芪醇生物合成的理想宿主[68]。

圖3 顯示了工程釀酒酵母中環(huán)黃芪醇的代謝途徑。在酵母內(nèi)源MVA 途徑中,葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑,經(jīng)乙醛脫氫酶(ALDH)、乙酰輔酶A 合酶(ACS)催化后,生成重要的合成底物——乙酰輔酶A(acetyl-CoA)。乙酰輔酶A 在乙酰乙酰輔酶A 巰解酶(ERG10)、3-羥 基-3-甲 基 戊 二 酰 輔 酶 A 合 酶(ERG13)、HMG-CoA 還原酶(HMGR)、甲戊二酸激酶(ERG12)、磷酸戊二酸激酶(ERG8)、法尼二磷酸合酶(ERG20)等酶的催化下反應(yīng)生成IPP,經(jīng)異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI1)催化,生成DMAPP。之后,DMAPP 在香葉基焦磷酸合酶(geranyl pyrophosphate synthetase,GPS)、法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthetase,FPS)、角鯊烯合酶(squalene synthase,SS)、角鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase,SE)等的作用下,生成2,3-氧化角鯊烯。在OSCs 的作用下,2,3-氧化角鯊烯通過“椅-船-椅”式構(gòu)象變化形成環(huán)阿屯醇[69-70]。最后,環(huán)阿屯醇經(jīng)CYP450s 羥基化、環(huán)氧化等結(jié)構(gòu)修飾,生成環(huán)黃芪醇。通過酵母生成環(huán)黃芪醇,仍需對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行代謝工程和合成生物學(xué)改造,以增加前體供應(yīng),并高效表達(dá)環(huán)黃芪醇合成的關(guān)鍵酶基因。

圖3 工程釀酒酵母中環(huán)黃芪醇的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of cycloastragenol in engineered Sacchromyces cerevisiae

3.1 強(qiáng)化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)源乙酰輔酶A 的合成

細(xì)胞質(zhì)中,乙酰輔酶A 主要通過乙酰輔酶A 合酶(ACS1、ACS2)途徑合成[71]。在釀酒酵母中過表達(dá)ACS1 和ACS2 可以使乙酰輔酶A 的合成產(chǎn)量提高2 到5 倍,從而增加其在細(xì)胞質(zhì)中的濃度[72]。同時(shí),乙酰輔酶A 與乙醛酸生成蘋果酸是細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中乙醛酸循環(huán)的重要環(huán)節(jié),抑制檸檬酸合酶(CIT2)和蘋果酸合酶(MLS1)的表達(dá)可以減少乙酰輔酶A 的損失[73]。酵母細(xì)胞中,同時(shí)提高乙酰和輔酶A 的合成,能夠大幅增加乙酰輔酶A 及下游產(chǎn)物的產(chǎn)量[74]。

3.2 在細(xì)胞質(zhì)中構(gòu)建外源乙酰輔酶A 的合成途徑

在釀酒酵母中引入外源乙酰輔酶A 合成途徑可以提高乙酰輔酶A 的合成效率。Meadows 等[75]使用4 種非天然代謝反應(yīng)重組釀酒酵母的中心碳代謝,降低了胞質(zhì)乙酰輔酶A 生物合成對(duì)ATP 的需求和CO2的生成量,有利于經(jīng)濟(jì)高效地合成乙酰輔酶A。Kozak 等[76]在釀酒酵母中表達(dá)乙酰乙醛脫氫酶(A-ALD),結(jié)果顯示乙酰乙醛脫氫酶能夠合成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A 可以在檸檬酸裂解酶(ACL)的催化下直接由檸檬酸獲得,而釀酒酵母中缺少ACL基因[77]。Lian 等[78]在釀酒酵母的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)外源ACL 基因,促進(jìn)了乙酰輔酶A 的生成。

釀酒酵母中存在運(yùn)輸乙酰輔酶A 的(乙酰)肉毒堿穿梭系統(tǒng),但是由于其無法合成肉毒堿,線粒體中的乙酰輔酶A 無法被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中[73]。線粒體中的乙酰輔酶A 合成途徑消耗更少的能量[79],且乙酰輔酶A 主要在線粒體中產(chǎn)生,因此,在細(xì)胞質(zhì)中構(gòu)建線粒體中的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體具有重要意義。Lian 等[80]將丙酮酸脫氫酶復(fù)合體在酵母細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量大為提升。此外,在線粒體中構(gòu)建MVA 途徑,具有提高乙酰輔酶A 相關(guān)產(chǎn)物產(chǎn)量的潛能,例如Lv 等[81]通過此方法使異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到2 527 mg/L。但是線粒體為酵母細(xì)胞能量的來源,應(yīng)盡量避免在線粒體中進(jìn)行萜類相關(guān)產(chǎn)物的合成。

3.3 解除產(chǎn)物對(duì)釀酒酵母的毒副作用以及改善前體合成途徑

以釀酒酵母為底盤細(xì)胞合成環(huán)黃芪醇,需要對(duì)釀酒酵母底盤細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)改造,消除其在合成過程中的多種限制,從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。釀酒酵母在發(fā)酵生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的部分代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)釀酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用,從而降低釀酒酵母的生物量。王雅楠等[82]通過在釀酒酵母中過量表達(dá)Spnox 基因,使重組菌株胞內(nèi)總NADH 氧化酶活性提高了49%,NADH/NAD+比例降低了9%,減少了釀酒酵母中乙醇的合成,這為減少環(huán)黃芪醇合成過程中乙醇等代謝產(chǎn)物對(duì)釀酒酵母的影響提供了思路。

為了滿足釀酒酵母細(xì)胞本身的生物代謝途徑和環(huán)黃芪醇合成途徑對(duì)前體物質(zhì)的需要,提高關(guān)鍵酶基因在工程菌中的表達(dá)量是強(qiáng)化前體物質(zhì)合成的最直接方法。HMGR 是MVA 途徑的第一個(gè)限速酶,過表達(dá)N 端截短的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶HMGR(tHMG1)可以促進(jìn)代謝流向MVA途徑轉(zhuǎn)移,降低法尼基焦磷酸的反饋抑制,從而提高M(jìn)VA 途徑中間產(chǎn)物的生成量[83]。在構(gòu)建具有原人參二醇合成途徑的釀酒酵母中,過表達(dá)編碼該酶功能區(qū)的基因tHMG1 后,原人參二醇產(chǎn)量提升為原產(chǎn)量的9.7 倍[84];此外,過表達(dá)IDI1、ERG10、ERG20基因和角鯊烯合酶基因(ERG9)等也可以提高前體物質(zhì)的供應(yīng)[85]。ERG1 基因的表達(dá)產(chǎn)物可以將角鯊烯氧化成2,3-氧化角鯊烯,因此過表達(dá)ERG1 基因可以促進(jìn)2,3-氧化角鯊烯的生成。

3.4 篩選高活性異源關(guān)鍵酶基因

酵母細(xì)胞不具有環(huán)阿屯醇合酶、CYP450s 等環(huán)黃芪醇合成所需的關(guān)鍵酶[86]。部分外源基因在釀酒酵母內(nèi)難以表達(dá)或表達(dá)量較低[87],導(dǎo)致關(guān)鍵酶的活性不高,因此,需要篩選并優(yōu)化異源基因的表達(dá)[88]。針對(duì)異源基因表達(dá)時(shí)存在的密碼子偏好性問題,可以根據(jù)釀酒酵母的密碼子特點(diǎn),對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化;針對(duì)異源酶活性低等問題,則可以通過定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)等蛋白質(zhì)工程方法提高其活性和特異性[89]。釀酒酵母中缺少植物來源的酶翻譯、酶修飾能力和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致植物天然產(chǎn)物合成所需的CYP450s 等關(guān)鍵酶存在折疊錯(cuò)誤、表達(dá)水平低和催化效率差等問題。未來,改善酵母底盤細(xì)胞特性,提高酵母表達(dá)CYP450s 等植物天然產(chǎn)物合成關(guān)鍵酶的能力,對(duì)實(shí)現(xiàn)植物活性天然產(chǎn)物的酵母合成至關(guān)重要。

3.5 抑制羊毛甾醇競(jìng)爭(zhēng)途徑

環(huán)阿屯醇合酶(CAS)可以催化2,3-氧化角鯊烯為環(huán)黃芪醇的前體環(huán)阿屯醇,不同的氧化角鯊烯環(huán)化酶會(huì)催化2,3-氧化角鯊烯環(huán)化成不同的化合物,并與環(huán)阿屯醇競(jìng)爭(zhēng)前體,其中環(huán)阿屯醇合成最主要的競(jìng)爭(zhēng)途徑是羊毛甾醇的合成。釀酒酵母的ERG7基因編碼的羊毛甾醇合酶可以催化2,3-氧化角鯊烯生成羊毛甾醇,再經(jīng)過一系列反應(yīng)合成細(xì)胞膜中的成分麥角甾醇,從而降低環(huán)阿屯醇的產(chǎn)量[90-91]。由于麥角甾醇是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分,因此無法完全敲除ERG7 基因進(jìn)行調(diào)控。

啟動(dòng)子工程可以有效調(diào)控酵母基因的表達(dá)[92]。將ERG7 基因的啟動(dòng)子替換為弱啟動(dòng)子,降低該基因的轉(zhuǎn)錄水平,可以減少羊毛甾醇的合成。PCTR3啟動(dòng)子受銅離子濃度影響,以該啟動(dòng)子替換釀酒酵母的ERG7 基因啟動(dòng)子后,在培養(yǎng)基中添加高濃度銅離子,可顯著抑制ERG7 基因的轉(zhuǎn)錄[93]。同理,也可以利用蛋氨酸和甲硫氨酸抑制性啟動(dòng)子PMET3替換ERG7 基因啟動(dòng)子,在培養(yǎng)基中添加蛋氨酸或甲硫氨酸,可以抑制ERG7 基因的表達(dá)[94]。在釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建CRISPR/dCas9 系統(tǒng),將dCas9 基因整合到釀酒酵母基因組中,表達(dá)出作用于ERG7 的dCas9 蛋白,也可以抑制羊毛甾醇的合成[95]。此外,還可以利用反義RNA 技術(shù)抑制ERG7 基因的表達(dá)[96],但是由于此技術(shù)的操作過程繁瑣、成本較高,目前已很少使用。

乙酰輔酶A、法尼基焦磷酸、異戊二烯、異戊烯基焦磷酸、角鯊烯是酵母中環(huán)黃芪醇合成的重要前體或中間產(chǎn)物,可通過多種優(yōu)化策略提高其合成產(chǎn)量,從而提高環(huán)阿屯醇的合成效率。目前,三萜類化合物絞股藍(lán)皂苷、人參皂苷Rg3、人參皂苷CK、雙環(huán)單萜化合物桉葉素、萜醇化合物芳樟醇、黃酮類化合物柚皮素等均在酵母中實(shí)現(xiàn)了高效合成(表1),這為環(huán)黃芪醇在酵母中的高效合成提供了參考。

表1 釀酒酵母細(xì)胞工廠高效合成策略Table 1 Efficient synthesis strategies for cell factories in S.cerevisiae

4 總結(jié)與展望

目前,環(huán)黃芪醇下游合成途徑中CYP450s 等關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)修飾的專一性較低,部分關(guān)鍵酶的催化機(jī)制未知,在釀酒酵母中異源表達(dá)高效關(guān)鍵酶基因有待進(jìn)一步研究。未來,為實(shí)現(xiàn)環(huán)黃芪醇的酵母合成,可加強(qiáng)以下幾方面的研究工作:

(1)利用多組學(xué)技術(shù)和合成生物學(xué)技術(shù),從黃芪中的環(huán)黃芪醇高效合成部位挖掘環(huán)黃芪醇合成途徑的關(guān)鍵酶;

(2)探究環(huán)黃芪醇在釀酒酵母中的異源合成途徑,進(jìn)一步篩選與酵母系統(tǒng)匹配的環(huán)黃芪醇合成關(guān)鍵酶基因;

(3)通過啟動(dòng)子替換、基因敲除、基因過表達(dá)等手段,結(jié)合基因編輯技術(shù),可以強(qiáng)化環(huán)黃芪醇的合成代謝途徑、抑制競(jìng)爭(zhēng)途徑的代謝通量、減少中間代謝產(chǎn)物的積累,從而提高環(huán)黃芪醇在酵母中的合成產(chǎn)率、速率和得率(titer, rate and yield,TRY)。

通過合成生物學(xué)研究,有望大量獲取具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的環(huán)黃芪醇產(chǎn)品,這樣不僅能夠?qū)崿F(xiàn)綠色生物制造,還能夠?yàn)閷?shí)現(xiàn)碳中和、碳達(dá)峰提供幫助。