質(zhì)譜技術(shù)在呼吸氣體檢測中的進展與應(yīng)用前景

吳瑛華，李 靜，潘振華，孫美秀，李迎新，2

對呼出氣體進行分析自古有之。中醫(yī)中有通過識別患者氣味變化來進行診斷的方法，古希臘醫(yī)生也認為呼氣中的一些特征氣味與某些疾病存在聯(lián)系[1]。 不過這些方法都只停留在經(jīng)驗上，古代醫(yī)學做不到對患者呼出氣體氣味的變化做出合理解釋。

近年來， 呼氣檢測作為一種非侵入性的檢測方法，能夠在幾乎對人體無傷害無負擔的情況下了解人體新陳代謝和疾病狀況[2]。 人體相當一部分的新陳代謝產(chǎn)物都會在血液的運輸作用下到達肺部，最后由呼出氣體排出體外。目前能夠在人呼出氣體中檢測到的揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）高達1 000 余種，已鑒別的能夠指示疾病和代謝異常的常見VOCs 也有30 多種， 多為戊烷為代表的一類烷烴、異戊二烯和丙酮等。目前，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）已經(jīng)批準了一些用于臨床診斷的呼氣標志物，包括幽門螺桿菌感染的13C， 用于哮喘診斷的一氧化氮 （nitrogen monoxide，NO）等。分析呼出氣體的成分對許多疾病的診斷都有著非常重大的意義。

當前呼吸分析的目標主要是以下幾個方面：①識別和量化呼出氣體中的揮發(fā)性微量化合物；②識別呼出氣體中常見代謝物的異常濃度；③區(qū)分內(nèi)源性和外源性化合物；④確定與特定疾病狀況相關(guān)的新生物標記化合物；⑤跟蹤呼吸代謝物濃度在短時間和長時間內(nèi)的變化，以支持藥代動力學、縱向研究和治療效果的監(jiān)控[3]。

呼吸分析常見的幾種方法中，目前最常用的檢測呼吸中VOCs 的方法多為色譜法， 其局限性在于：需要對采集的樣品進行較為復雜的前處理和分離檢測等步驟、難以做到實時分析、樣品制備技術(shù)和分析條件存在巨大差異而導致的標志物列表及分析結(jié)果的差異、重現(xiàn)性受到色譜系統(tǒng)靈敏度限制等。 隨著新興技術(shù)的發(fā)展，高靈敏度和高反應(yīng)速率的質(zhì)譜儀器進入了人們的視野，它無需復雜的前處理，且能做到實時分析，因此質(zhì)譜檢測成為呼氣檢測的更好選擇。

文章重點介紹直接質(zhì)譜技術(shù)在呼吸分析中的應(yīng)用進展及前景。

1 已建立的呼吸標志物與人體疾病和代謝異常的關(guān)系

呼出氣體的主要成分是水蒸氣和二氧化碳，除此之外，還有著非常復雜的氣體組分，其中作為目前研究重點的揮發(fā)性有機物部分僅占呼出氣體總體積的不到1%。 人的呼出氣體大致分為三個部分，即氣體部分、揮發(fā)性部分和呼吸冷凝物，目前大多數(shù)的呼吸測試針對后兩個部分。

何為生物標志物？ 美國國家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH） 使用的一個廣泛接受的定義是：“一種被客觀測量和評估的特征，作為正常生物過程、致病過程或?qū)Ω深A的藥理學反應(yīng)的指標?！苯刂沟侥壳暗难芯勘砻?， 人體呼出氣體中存在著1 000 種以上的化合物，其濃度大小不等，每個人的呼出氣體成分都存在差異，目前呼出氣體中已經(jīng)確定的能夠指示疾病和代謝異常的化合物大約有35 種[4]。表1 列出了一些常見的呼吸標志物與其指示的疾病或代謝異常[5~8]。

表1 常見生物標志物及與其相關(guān)的疾病或代謝異常Tab. 1 Common biomarkers and related diseases or metabolic abnormalities

實際上在很多情況下，一種化合物不只能夠指示一種疾病或者代謝異常，比如丙酮濃度異常能同時指示肺癌、糖尿病、腦癲癇等疾??；一氧化碳濃度異常能指示氧化應(yīng)激、呼吸道感染和貧血等等，表2 列出了一些感染性疾病及其相關(guān)的呼吸標志物。同一種疾病出現(xiàn)時也不只會造成僅僅一種呼吸成分的濃度變化，比如肺癌一種疾病，就可以用丙酮、乙醛、丁烷等多種化合物來進行診斷[9，10]。

表2 感染性疾病及其相關(guān)的呼吸標志物Tab.2 Infectious diseases and related respiratory markers

事實上，臨床中已經(jīng)建立起了相當一部分揮發(fā)性有機物與相關(guān)疾病及代謝異常對應(yīng)的呼吸氣體檢測流程和方案。目前已經(jīng)大量運用于臨床的呼氣檢測項目有呼吸功能檢測（檢測二氧化碳）、13C-尿素呼氣實驗（檢測同位素標記后的二氧化碳）、 新生兒黃疸（檢測一氧化碳）、雙糖不耐受及小腸菌過度生長（檢測氫氣和甲烷）、哮喘檢測（檢測一氧化碳）、心臟抑制排斥（檢測烷烴）、胃排空監(jiān)測（檢測同位素標記后的二氧化碳）、吸煙監(jiān)測（檢測一氧化碳）、醉酒監(jiān)測（檢測乙醇）等。 就目前的應(yīng)用現(xiàn)狀來看，早期腫瘤監(jiān)測和感染性疾病的篩查是呼氣檢測的未來主要發(fā)展方向[11]。

許多呼吸標志物與疾病的關(guān)系到目前為止依然不明確，其詳細的形成機制也有待進一步的研究和證明[12]。 因此，為了滿足客觀測量的要求，呼吸研究中最重要、也是最具挑戰(zhàn)性的方面是開發(fā)分析方法，能夠檢測、積極識別和準確定量適當?shù)退降膬?nèi)源性痕量化合物， 使其更多地作為生物標志物應(yīng)用于臨床，迫切需要通過呼氣分析這種可靠和精確測量化合物濃度的形式發(fā)現(xiàn)生物標志物，而飛速發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)正好為實現(xiàn)這一目標提供了可靠的途徑。

2 直接質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是一種鑒定技術(shù)，在有機分子的鑒定方面發(fā)揮非常重要的作用。它能快速且極為準確地測定生物大分子的相對分子質(zhì)量，使蛋白質(zhì)組研究從蛋白質(zhì)鑒定深入到高級結(jié)構(gòu)研究及各種蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。質(zhì)譜法的優(yōu)點是特異性好、靈敏度高、速度快等，因此在呼吸氣體的分析方面應(yīng)用比較廣泛[13]。

根據(jù)是否能夠?qū)崟r分析氣體，直接質(zhì)譜技術(shù)又分為非實時在線分析和實時在線分析兩種[14]。

非實時在線分析的質(zhì)譜技術(shù)主要有離子遷移質(zhì)譜（ion mobility spectroscopy，IMS）、電噴霧萃取電離質(zhì)譜 （extractive electrospray ionization-mobility spectroscopy，EESI-MS）等。 離線采樣的優(yōu)點在于不受采樣位置的限制，但是目前的方法對樣品的運輸、儲存和分析的前處理都提出了很嚴格的要求，因此又產(chǎn)生了一些實時在線分析的方法。實時在線分析質(zhì)譜技術(shù)主要有質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜（proton transfer reaction-mass spectrometry，PTR-MS） 和選擇離子流動管質(zhì)譜（selective ion flow tube-mass spectrometry，SIFT-MS）[15]。

實時取樣和分析有利于減少樣品在收集、儲存和處理過程中發(fā)生降解和其他變化，有些生理變化可能發(fā)生在幾分鐘甚至幾秒鐘內(nèi)（比如鍛煉）， 傳統(tǒng)的采集—運輸—分析的方法會給分析過程引入更多的誤差[16]。 另外快速表征呼出氣體的動態(tài)變化對于藥物動力學和毒理動力學評估也非常重要，因為在此類研究中，外源化合物的吸收、分布、代謝和排泄在非常短的時間尺度上進行，其濃度變化很難被離線采樣的經(jīng)典分析方法捕捉到[17，18]。因此，實時分析是分析快速生化過程的最優(yōu)方案。

3 直接質(zhì)譜技術(shù)在呼吸分析中的研究進展

隨著直接質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展和人們對無創(chuàng)早診技術(shù)的追求，直接質(zhì)譜技術(shù)越來越多地被運用于呼吸分析。

一些早期研究為質(zhì)譜技術(shù)在呼吸分析中的廣泛運用奠定了基礎(chǔ)：比如Gaida A 等[19]使用了將GC 技術(shù)與IMS 技術(shù)串聯(lián)的方法， 實現(xiàn)了分析前的樣品預分離， 將該技術(shù)運用于慢性肺阻塞患者的呼氣檢測，從而篩查出了3 種VOCs 作為該種疾病的標志性有機物。 2007年，Chen H 等[20]首次采用了EESI-MS 的方法對人體呼出氣體進行了質(zhì)譜研究，最終建立了一項快速指紋譜圖分析法，并應(yīng)用此方法分別對亞洲和歐洲志愿者的呼出氣體進行分析，旨在研究呼出氣體指紋圖譜是否與生活的地域有關(guān)，Chen H 等的研究為EESI 在活體分析中更深層次的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。SIFT-MS 最初是為了在環(huán)境研究中直接量化微量蒸汽和氣體而開發(fā)的；而如今，它的用途已擴展到許多其他應(yīng)用，如醫(yī)學研究、食品科學和考古學，近年來在呼吸分析方面發(fā)展尤為迅速。 系統(tǒng)的文獻檢索表明，使用SIFT-MS 進行呼吸分析的已發(fā)表同行評審文章中，已經(jīng)超過了十分之一（11.2%）。PTR-MS 于20 世紀90年代中期由Majchrzak T 等[21]首次推出，并在過去幾十年中取得了巨大的發(fā)展。PTR-MS 的一些最早用途是Beauchamp J 等[22]將其用于呼氣分析以診斷疾病等。

近年來，直接質(zhì)譜技術(shù)有了更加先進的結(jié)合方式和分析方式，國內(nèi)外的學者均做了大量研究。

LI X 等[23]通過使用次級納米電離噴霧耦合高分辨率質(zhì)譜（secondary nanoionization spray coupled high resolution-mass spectrometry，Sec-nanoESI-HRMS）實時表征呼出氣體中的VOCs，一次測量分析僅需要30 s；Zou X 等[24]采用直接呼吸采樣系統(tǒng)和PTR-MS 相結(jié)合的方式在線檢測呼吸丙酮以探究運動和飲食在減肥中的影響；Chin ST 等[25]研究了多個MS 平臺，發(fā)現(xiàn)多平臺策略能夠更好地發(fā)現(xiàn)食管癌患者呼氣中VOCs的分布；Segers K 等[4]用SIFT-MS 分別分析了哮喘及囊性纖維化兒童的呼出氣體， 得到了較好的分辨能力；Hong Y 等[26]運用單光子電離質(zhì)譜（single photon ionization-mass spectrometry，SPI-MS） 針對胃癌患者的呼出氣體建立了預測精度較高的模型；Weber R等[27]用二次電噴霧電離高分辨率質(zhì)譜（secondary electrospray ionization high resolution-mass spectrometry，SESI-HRMS） 檢測了囊性纖維化兒童呼氣中的VOCs 特征， 并建立了有一定能力的預測模型；Zhou W 等[28]運用PTR-MS 研究了宮頸癌患者的呼出氣體，最終篩查出了4 種關(guān)鍵特征用于鑒別宮頸癌；Slingers G 等[29]將熱脫附法（thermal desorption，TD）與SIFT-MS 相結(jié)合，通過對健康人呼氣樣本的分析證明SIFT-MS 與TD 結(jié)合后分析能力得到了提升；Gaugg MT 等[30]運用SESI-HRMS 分析了慢性非阻塞性肺疾病患者的呼氣，證明SESI-HRMS 能夠為患者提供持續(xù)生化過程的監(jiān)測；Thevis M 等[31]運用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析運動員的呼氣樣本，證明該種策略能夠?qū)ΜF(xiàn)在的興奮劑檢測提供補充方案；Welearegay TG 等[32]用專門開發(fā)的電子鼻系統(tǒng)對囊性包蟲病患者的呼氣進行分析， 提供了一種對包蟲病的新的無創(chuàng)診斷方法；葛殿龍[33]用固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜（solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）對食管癌患者的呼氣進行了研究，確定了Z-1-甲硫基1-丙烯為一種可能的標志物。

隨著現(xiàn)代計算機技術(shù)的發(fā)展，在對呼氣檢測的研究中，質(zhì)譜技術(shù)也開始與人工智能的方法相結(jié)合。

Adam ME 等[34]用以Xgboost 為基礎(chǔ)構(gòu)建的算法對采集到的的肺癌患者及健康人呼氣樣本進行分析，區(qū)分準確度達到87.63%。 Bade BC 等[35]聯(lián)合影像和呼氣樣本進行標志提取和建模，肺癌患者和良性腫瘤患者的區(qū)分準確度達到了97.87%。Chin ST 等[25]多平臺策略能夠較精準地發(fā)現(xiàn)食管癌患者呼氣中VOCs的分布；Segers K 等[4]哮喘及囊性纖維化兒童的呼出氣體模型判斷準確度達到了89.74%；Hong Y 等[26]胃癌患者的呼出氣體模型預測精度達90.17 %；Weber R 等[27]囊性纖維化兒童呼氣預測模型精度達到85%以上；吳思[36]用包括人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）在內(nèi)的4 種模型對胃癌患者的呼氣進行了建模分析， 最終確認了10 種具有差異性的特征成分。

由此可見，不斷改進的直接質(zhì)譜儀器憑借更高的反應(yīng)速率、更低的測量極限、更多的同時測量組分為呼氣檢測提供了強有力的硬件支持。 同時，以人工智能為代表的各種其他技術(shù)，如影像技術(shù)、血液檢測技術(shù)等先進技術(shù)更多地與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，質(zhì)譜技術(shù)將更廣泛地應(yīng)用于呼氣檢測領(lǐng)域。

4 質(zhì)譜呼氣檢測臨床應(yīng)用挑戰(zhàn)及前景

隨著臨床檢測越發(fā)趨于個體化和精準化發(fā)展，更快速更準確地得到檢測結(jié)果成為了臨床診斷一個重要的需求，近年來呼吸氣體檢測質(zhì)譜技術(shù)的臨床應(yīng)用成果初顯，成為了臨床診斷中前景斐然的一項檢測方法。 然而質(zhì)譜呼吸檢測也存在著許多有待解決的問題，主要存在于以下幾個方面：

（1） 目前專業(yè)用于氣體分析的質(zhì)譜儀器昂貴、笨重，需要專業(yè)人員進行操作、數(shù)據(jù)分析和解釋，因此只能在醫(yī)院和較大的診所提供，這就阻礙了這些儀器用于日常生活中的呼吸氣體分析，而呼氣分析的一項重要目標就是通過健康監(jiān)測實現(xiàn)疾病的早期診斷，因此其一大發(fā)展目標就是使呼氣檢測的儀器成本更低、操作更簡單，方便進入千家萬戶[37]。

（2）呼出氣體的采集和選取存在困難。首先，并不是所有的質(zhì)譜分析技術(shù)都能直接分析呼出的氣體，而收集到的呼出氣體會隨著放置時間的增加逐漸降解，因此呼氣的收集和儲存也是一個重大問題。 其次，到底是使用鼻子呼出的氣體還是口呼出的氣體進行分析，在研究界依然存在爭議。再次，不同患者的吹氣流速和濃度等的不同，給呼氣分析的標準化帶來了更多更復雜的挑戰(zhàn)。最后，很多呼氣成分是外源性的，有些甚至不是系統(tǒng)產(chǎn)生的，成為另一個混淆因素。

（3）目前用于呼氣檢測的質(zhì)譜儀中傳感器僅限于少數(shù)幾種疾病，如糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等，這些疾病的共同特點是可以用單一的生物標志物來進行檢測，然而在大多數(shù)疾病中，尤其是不同的癌癥中，隨著病情的發(fā)生發(fā)展，多種呼出氣體的濃度會同時發(fā)生變化，很難用一種特定的傳感器來處理，使得分辨健康人群和疾病人群變得更加困難[38]。

此外還有實驗室標準化不足、缺乏合適的待測物標記、樣品制備過程自動化程度不足、許多步驟仍需要人工核對、專業(yè)人員短缺、前期設(shè)備開發(fā)費用高昂等。

因此，質(zhì)譜呼氣檢測的未來應(yīng)該著重于解決以下問題：建立更多新的生物標志物系統(tǒng)；建立疾病和呼出的呼吸生物標志物濃度之間的標準相關(guān)性，建立標準的呼吸收集和存儲程序；區(qū)分呼出氣體中的外源性和內(nèi)源性氣體；開發(fā)用于選擇性檢測呼吸氣體的新型特異性納米材料；開發(fā)操作簡單、可重復、可靠、實時、質(zhì)量輕、價格低廉的手持設(shè)備；進行大量適當?shù)呐R床試驗，包括盡可能多的受試者和實驗驗證等。

綜上所述，質(zhì)譜呼氣檢測是一個跨學科的研究領(lǐng)域，涵蓋了醫(yī)學、數(shù)據(jù)分析、材料化學、數(shù)據(jù)處理、醫(yī)學電子等多個方面，這是一個快速發(fā)展的領(lǐng)域，即將通過逐步實現(xiàn)疾病的早期診斷而對社會做出巨大貢獻。目前商用的呼氣檢測質(zhì)譜儀依然是GC-MS 居多，隨著直接質(zhì)譜技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展，呼氣檢測儀器將更多采用更新型的質(zhì)譜技術(shù)，實現(xiàn)更加方便、快捷、實時的呼吸氣體檢測。 隨著各方面的研究進展，在疾病的篩查上會逐步形成共識，低成本、操作便捷的非侵入式呼氣檢測質(zhì)譜儀正處于產(chǎn)業(yè)爆發(fā)的前夕[39]。