呼吸道合胞病毒下呼吸道感染患兒外周血miR-93-5p表達(dá)與Th1/Th2平衡的關(guān)系

周蓮花,劉 麟,余慶樂(lè),吳 蕾

(南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院兒科,湖南 長(zhǎng)沙 410000)

5歲嬰幼兒是呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)下呼吸道感染的主要發(fā)病群體,我國(guó)有21.5萬(wàn)～50.0萬(wàn)嬰兒因RSV感染住院[1]。長(zhǎng)時(shí)間RSV感染易損傷患兒免疫功能,改變免疫細(xì)胞因子水平,使RSV下呼吸道感染遷延不愈,甚至誘發(fā)肺炎、哮喘等,危及患兒生命[2]。目前關(guān)于RSV發(fā)病機(jī)制仍未有統(tǒng)一報(bào)道,又缺乏特異性疫苗及藥物,因此了解RSV下呼吸道感染分子水平,對(duì)臨床早診、早治具有指導(dǎo)作用。臨床研究[3]顯示,臟器功能發(fā)育不全、免疫功能低下與RSV感染密切相關(guān)。RSV患兒機(jī)體中T細(xì)胞功能異常,B細(xì)胞合成障礙生成減少,誘導(dǎo)B細(xì)胞抗體水平減弱,而輔助型T細(xì)胞1/2(Th1/Th2)細(xì)胞因子失衡是其中典型反應(yīng),介導(dǎo)免疫細(xì)胞[4]。微小RNA(miRNA)參與機(jī)體免疫系統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化及成熟,調(diào)控其自然殺傷能力,而miR-93-5-p在呼吸系統(tǒng)疾病中見(jiàn)表達(dá),其水平異常變化在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,參與大量疾病發(fā)生及進(jìn)展[5]。但miR-93-5p與RSV下呼吸道感染發(fā)病及Th1/Th2平衡的關(guān)系尚未明確?；诖?本研究通過(guò)探討RSV下呼吸道感染患兒外周血微小RNA-93-5p表達(dá)與Th1/Th2平衡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月—2021年12月我院收治的RSV下呼吸道感染患兒58例(RSV組)為研究對(duì)象;選擇同期到院行體檢且結(jié)果為健康兒童60例為對(duì)照組。RSV組男性37例,女性21例,年齡9個(gè)月～5歲,平均(1.45±0.32)歲;病程2～7 d,平均(3.87±0.93)d;對(duì)照組男性40例,女性20例;年齡12個(gè)月～5歲,平均(1.53±0.37)歲。2組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《兒童呼吸道合胞病毒感染診斷、治療及預(yù)防專家共識(shí)》[6]中RSV下呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn);②發(fā)病急,≤7 d,年齡≤5歲;③鼻咽部落細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為RSV抗原陽(yáng)性;④無(wú)過(guò)敏史。排除標(biāo)準(zhǔn):①就診前14 d內(nèi)采用過(guò)激素或藥物對(duì)癥治療者;②合并呼吸道畸形(如支氣管發(fā)育不良)與先天免疫缺陷者;③先天性心臟病、家族哮喘史;④實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為多種病毒感染;⑤合并影響炎癥因子水平的疾病(如腦膜炎)。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 RSV組患兒于治療前、對(duì)照組兒童于體檢日清晨采集肘部空腹靜脈血5 mL,3 000 r/min、30 min后離心存放-80 ℃下待測(cè)。

1.2.2miR-93-5p水平檢測(cè) 血清總RNA提取根據(jù)血液RNA試劑盒說(shuō)明書操作完成,提取總RNA后采用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行處理,逆轉(zhuǎn)為cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)血清miR-93-5p及內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)期間采用并用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物并合成,引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,當(dāng)中循環(huán)共35個(gè),應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算miR-93-5p相對(duì)表達(dá)量,該實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次,取平均值,見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列表

1.2.3Th1/Th2水平檢測(cè) 將待測(cè)標(biāo)本中添加藻紅蛋白、異硫氫酸熒光素雙色熒光雙標(biāo)記單克隆抗體及陰性對(duì)照組孵育20 min,PBS緩沖液洗滌后,給予甲醛PBS固定,采用流式細(xì)胞儀(Mindray)檢測(cè)5 000個(gè)細(xì)胞中Th1型細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)、γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)]陽(yáng)性細(xì)胞率及Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)陽(yáng)性細(xì)胞率,藻紅蛋白標(biāo)記大鼠抗人IL-4單抗、異硫氫酸熒光素標(biāo)記大鼠抗人IFN-γ,計(jì)算Th1/Th2。

1.2.4IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ等細(xì)胞因子水平檢測(cè) 將待測(cè)標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ水平,為確保實(shí)驗(yàn)室結(jié)果質(zhì)量,檢測(cè)均由同一批檢驗(yàn)科人員在同一臺(tái)儀器中完成,樣本檢測(cè)三次取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);Spearman分析miR-93-5p與Th1/Th2的關(guān)系,Logistics回歸分析影響RSV下呼吸道感染發(fā)生的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組外周血miR-93-5p水平比較 RSV組miR-93-5p水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 2組外周血miR-93-5p水平比較

2.22組外周血Th1/Th2細(xì)胞百分率比較 RSV組Th1、Th1/Th2低于對(duì)照組,RSV組Th2高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 2組外周血Th1/Th2細(xì)胞百分率比較

2.32組外周血細(xì)胞因子水平比較 RSV組IL-2、IFN-γ水平低于對(duì)照組,RSV組IL-4、IL-10水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 2組外周血細(xì)胞因子水平比較

2.4miR-93-5p表達(dá)與Th1/Th2平衡的相關(guān)性 RSV組miR-93-5p與IL-2、IFN-γ、Th1/Th2比值呈負(fù)相關(guān)性,與IL-4、IL-10呈正相關(guān)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 miR-93-5p表達(dá)與Th1/Th2平衡的相關(guān)性

2.5影響RSV下呼吸道感染的多因素分析 以是否發(fā)生RSV下呼吸道感染作為因變量(否=0,是=1),以miR-93-5p(<1.56=0,≥1.56=1)、IL-2(≥1.94 ng/L=0,<1.94 ng/L=1)、IL-4(<8.89 ng/L=0,≥8.89 ng/L=1)、IL-10(<23.50 ng/L=0,≥23.50 ng/L=1)、IFN-γ(≥18.16 ng/L=0,<18.16 ng/L=1)、Th1/Th2(≥1.49=0,<1.49=1)為自變量,行Logistics回歸分析結(jié)果顯示高水平miR-93-5p與低水平的Th1/Th2是影響RSV下呼吸道感染的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表6。

表6 影響RSV下呼吸道感染的多因素分析

3 討 論

RSV下呼吸道感染患兒,機(jī)體免疫力減弱,常會(huì)出現(xiàn)再感染或并發(fā)癥,如RSV感染所致毛細(xì)支氣管炎、哮喘、肺損傷等,而RSV下呼吸道感染持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng),機(jī)體免疫損傷風(fēng)險(xiǎn)越高,影響患兒正常發(fā)育[7]。目前,臨床中關(guān)于RSV下呼吸道感染治療尚未有特效藥物,因此尋找RSV下呼吸道感染的治療靶點(diǎn)是近年來(lái)研究熱點(diǎn)。

miRNA為內(nèi)源性非編碼小RNA分子,經(jīng)調(diào)控多個(gè)轉(zhuǎn)錄本,介導(dǎo)超過(guò)30%基因及遺傳途徑,參與發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖相關(guān)的生物學(xué)作用[8]。miR-93-5p是miRNA-93家族成員,位于人7號(hào)染色體上,可阻斷核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路活化,發(fā)揮抑炎作用,維持機(jī)體免疫穩(wěn)定性[9]。miRNA-93-5p參與了多種自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病等[10]。陳瑜等[11]學(xué)者研究顯示,miR-93-5p可下調(diào)宮頸癌細(xì)胞增殖,加快NK細(xì)胞Th1細(xì)胞因子的分泌。陳曄等[12]學(xué)者報(bào)道,在miR-93-5p轉(zhuǎn)染的RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞中IL-6、TNF-α水平降低。Xiang等[13]研究表明,miR-93-5p在支氣管平滑細(xì)胞中呈高水平表達(dá),提示miR-93-5p水平可能與呼吸道疾病發(fā)生有關(guān)。miR-93-5p被認(rèn)為是促炎因子,可介導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá),從而在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用,本研究中顯示,RSV組miR-93-5p水平高于對(duì)照組(P<0.05),提示miR-93-5p可能參與RSV下呼吸道疾病感染的發(fā)病進(jìn)程。

RSV下呼吸道感染會(huì)誘導(dǎo)Th1、Th2兩大功能亞群的炎癥反應(yīng),Th1細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,消滅病毒與其胞內(nèi)病原體,其分泌的IFN-γ可抑制炎癥IL-4水平,而IL-4高表達(dá)會(huì)加快免疫球蛋白E形成,刺激下呼吸道功能發(fā)生喘息,所以INF-γ抑制IL-4可阻斷疾病進(jìn)展[14]。Th2細(xì)胞調(diào)節(jié)變態(tài)反應(yīng),其產(chǎn)生的IL-4、IL-10加快IgE分泌與嗜酸粒細(xì)胞細(xì)胞大量積聚在氣道中,活化釋放大量細(xì)胞因子,可引起毛細(xì)支氣管炎、哮喘等疾病的慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性,使成纖維細(xì)胞增殖與杯狀細(xì)胞分化而影響氣道與肺功能[15]。本研究結(jié)果顯示,RSV組Th1、Th1/Th2低于對(duì)照組(P<0.05),RSV組Th2高于對(duì)照組(P<0.05);RSV組IL-2、IFN-γ水平低于對(duì)照組(P<0.05);RSV組IL-4、IL-10水平高于對(duì)照組(P<0.05),提示RSV下呼吸道感染患兒Th1、Th2細(xì)胞失衡。褚亞娟等[16]報(bào)道,RSV肺炎患兒免疫應(yīng)答時(shí)以Th2作為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,而隨病情進(jìn)展肺功能下降與Th1、Th2細(xì)胞漂移嚴(yán)重相關(guān),機(jī)體CD4+T細(xì)胞在抗原刺激下出現(xiàn)極化反應(yīng),分泌Th1和(或)Th2細(xì)胞,兩者發(fā)生協(xié)同作用影響機(jī)體免疫加快機(jī)體炎癥表達(dá),促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展。廖廷彥等[17]研究顯示,RSV毛細(xì)支氣管炎患兒IL-4、IL-10等Th2細(xì)胞因子呈現(xiàn)高表達(dá),與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān);而曾瑞梅等[18]研究顯示,RSV感染主要是通過(guò)介導(dǎo)IL-4、IL-10和IFN-γ、IL-2表達(dá)來(lái)影響CD4+T細(xì)胞亞群,引起細(xì)胞免疫失衡。

miR-93-5p可通過(guò)IL-4/IFN-γ信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)機(jī)體免疫。本次進(jìn)一步分析顯示,miR-93-5p與IL-2、IFN-γ、Th1/Th2比值呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05);與IL-4、IL-10呈正相關(guān)性(P<0.05),說(shuō)明miR-93-5p可能調(diào)控Th1、Th2細(xì)胞亞群比例,影響細(xì)胞因子水平,參與RSV下呼吸道感染發(fā)生、發(fā)展。Logistics回歸分析顯示,結(jié)果顯示高水平miR-93-5p與低水平的Th1/Th2是影響RSV下呼吸道感染的危險(xiǎn)因素(P<0.05),提示降低miR-93-5p,改善Th1/Th2平衡可能會(huì)抑制RSV下呼吸道感染發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,RSV下呼吸道感染患兒外周血miR-93-5p水平較高,Th1/Th2下降,miR-93-5p可能介導(dǎo)免疫系統(tǒng)中相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子來(lái)影響Th1/Th2平衡,二者密切相關(guān)且均為影響RSV下呼吸道感染的危險(xiǎn)因素,有望成為干預(yù)或治療RSV下呼吸道感染的靶點(diǎn)。但本研究仍存在劣勢(shì),未探討外周血miR-93-5p及Th1/Th2平衡對(duì)RSV下呼吸道感染患兒病情嚴(yán)重程度的影響,作為未來(lái)研究方向深入探討。