付嘉琦,董曙馨,李 珺 ,李 春 ,2

(1. 北京理工大學 化學與化工學院 生物化工研究所 醫(yī)藥分子科學與制劑工程工信部重點實驗室,北京 100081;2. 清華大學 化學工程系,北京 100084)

燃料乙醇作為一種新型能源已逐漸進入人們的日常生活,更成為國內(nèi)外學者的研究熱點[1-2]。通過提高乙醇轉(zhuǎn)化率和濃度,并且降低生產(chǎn)成本,能極大地提高乙醇總產(chǎn)值,帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。由于工業(yè)發(fā)酵條件復雜,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)需要面對高溫、高乙醇濃度、高滲透壓、毒性副產(chǎn)物(如乙酸)和底物毒性等苛刻環(huán)境[3],這些不利因素影響細胞的多種代謝過程,造成有毒物質(zhì)在胞內(nèi)的積累,進而使細胞穩(wěn)態(tài)失衡[4-5],最終導致目標產(chǎn)物產(chǎn)量下降和生產(chǎn)成本升高。為了給發(fā)酵菌株提供適宜的生長條件,需要嚴格控制發(fā)酵過程,這極大地增加了生產(chǎn)成本和能耗。因此,可直接對耐受相關途徑進行工程化設計以增強工業(yè)酵母的耐受性,以期獲得能適應工業(yè)生產(chǎn)復雜脅迫環(huán)境的、穩(wěn)定可遺傳的優(yōu)良工業(yè)菌株。

工業(yè)菌株抵御脅迫環(huán)境一般涉及碳、脂質(zhì)、氨基酸等代謝途徑的重塑,以修復由脅迫因子引起的細胞損傷,同時增加菌株清除對自身有害因子的能力。維持細胞穩(wěn)態(tài)對工業(yè)菌株高產(chǎn)目標產(chǎn)物有重要作用[6-7]。釀酒酵母基因組測序的完成為利用轉(zhuǎn)錄組分析其基因特征及全面解讀奠定基礎[8],轉(zhuǎn)錄組分析包含細胞過程、細胞組分及分子生物學功能等方面。特別是深度分析轉(zhuǎn)錄組獲得的數(shù)據(jù),對挖掘能夠提高菌株耐受能力的潛在關鍵基因、潛在代謝通路、了解工業(yè)酵母的復雜代謝機制至關重要。Baeza等[9]對8種適應低溫但生長特性各不相同的酵母的轉(zhuǎn)錄組分析后發(fā)現(xiàn),差異表達基因的總數(shù)與每個酵母面臨的溫度變化有關。Kocaefe-?zen等[10]對酵母的轉(zhuǎn)錄組和基因組分析后發(fā)現(xiàn),實驗室進化的抗氧化脅迫釀酒酵母對其他類型的脅迫具有交叉抗性,同時產(chǎn)生更高水平的海藻糖和糖原,這兩種產(chǎn)物對維持細胞器膜結(jié)構(gòu)有著積極作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等膜結(jié)合的細胞器是許多關鍵代謝途徑的場所,它們通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)的氧化還原平衡、維持線粒體膜上的電子傳遞鏈與輸入機制等方式參與調(diào)節(jié)細胞在脅迫環(huán)境下的穩(wěn)態(tài)[11-12],但關于細胞器調(diào)控細胞穩(wěn)態(tài)的機制研究尚不深入。

有研究證明,硫胺素途徑對菌株耐受性的貢獻除了其在糖酵解、磷酸戊糖途徑(PPP)和三羧酸循環(huán)(TCA)等中央細胞代謝中的作用外,硫胺素及其磷酸化衍生物依賴的應激保護功能也是利于酵母存活的關鍵[13-14]。硫胺素(thiamine)又稱維生素 B1,是一種維持酵母正常生長代謝的水溶性 B 族維生素,通常以能量代謝關鍵酶輔酶的形式參與物質(zhì)代謝與能量代謝。Wolak等[15]研究發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵過程中,硫胺素的缺乏不僅會引起胞內(nèi)氧化還原失衡以及活性氧(ROS)的產(chǎn)生,而且進一步引發(fā)細胞生長抑制、細胞死亡和發(fā)酵停滯,可見硫胺素在釀酒酵母中的應激保護作用與它在細胞中的從頭合成途徑密切相關。在人體中,硫胺素缺乏會觸發(fā)介導細胞死亡的線粒體通透孔開放[16]。一般線粒體產(chǎn)生的能量通常以電化學勢能儲存在線粒體內(nèi)膜,形成相對穩(wěn)定的線粒體膜電位,當菌株出現(xiàn)不同程度穩(wěn)態(tài)失衡甚至衰老時,就會出現(xiàn)不同程度線粒體膜電位下降的趨勢。如,硫胺素反應性巨幼細胞貧血的成因涉及線粒體氧化磷酸化和硫胺素代謝途徑[17],這不僅證實細胞器線粒體是硫胺素作用的場所,而且硫胺素途徑與細胞穩(wěn)態(tài)有著密切的關系。如果缺失硫胺素合成途徑的基因則會影響菌株的生長,如THI5缺失的菌株在缺乏硫胺素的培養(yǎng)基上生長嚴重受阻,而缺失THI4的菌株對DNA 損傷敏感[18-19];尤其是THI80所編碼的硫胺素二磷酸(TDP),以輔因子的形式不僅調(diào)控著丙酮酸代謝途徑和磷酸戊糖途徑中的關鍵酶及線粒體轉(zhuǎn)運蛋白,還通過促進乙酰輔酶A和NADPH的生成間接影響著蛋白質(zhì)、脂類、DNA、RNA的合成和胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持,同時THI80以負反饋的形式調(diào)節(jié)著硫胺素途徑中的THI調(diào)節(jié)子,保證硫胺素途徑的基因在轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)平衡[20-22]。因此,硫胺素途徑與維持細胞穩(wěn)態(tài)和響應脅迫存在必然聯(lián)系,值得深入研究。

筆者針對所在課題組前期獲得的工業(yè)菌株釀酒酵母A223熱脅迫相關的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行深度分析,對差異基因進行功能富集,建立關鍵代謝途徑與細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的相關性,同時挖掘確定了與酵母菌株耐熱性相關的硫胺素代謝途徑。因此,本研究對得到的硫胺素代謝途徑相關基因PDX3、SNZ1、BUD16、THI80和PHO3進行進一步基因敲除、過表達及硫胺素回補實驗驗證及分析,以期揭示乙醇代謝途徑利用硫胺素途徑來應對高溫脅迫的細胞器調(diào)節(jié)機制,為豐富酵母細胞抗逆機制的動態(tài)變化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

釀酒酵母BY4742 菌株,筆者所在實驗室保藏;工業(yè)釀酒酵母菌株 CY,中糧集團營養(yǎng)與健康研究所生物技術中心;工業(yè)釀酒酵母菌株 A223,實驗室前期對工業(yè)釀酒酵母CY進行篩選及適應性改良所得到的具有多層次防御系統(tǒng)的耐受菌株,具體的改造包括將多個耐受線路的隨機整合到基因組多拷貝位點、常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、自適應進化,再經(jīng)高通量篩選所得[23]。用于質(zhì)粒構(gòu)建的DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞,New England BioLabs公司。用于載體構(gòu)建的質(zhì)粒HcKan-P 和HcKan-T ,深圳市高等技術研究院戴俊彪教授惠贈。本研究中用到的菌株和質(zhì)粒如表1 所示。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒

1.1.2 引物設計

本研究所用引物如表 2 所示。

1.1.3 試劑及儀器

酵母提取物、胰蛋白胨、D-葡萄糖、瓊脂粉,北京東旭靈美生物科技有限公司;30% H2O2溶液、乙酸溶液,北京化學試劑公司;羅丹明 123 、 D-山梨醇、20 ×磷酸鹽緩沖溶液(PBS),索萊寶生物科技有限公司;活性氧檢測探針,南京碧云天生物科技公司。

壓力蒸汽滅菌器,日本株式會社;PCR 儀,杭州博日公司;紫外酶標儀、全自動凝膠成像系統(tǒng),美國 Syngene公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱,德國 Martin Christ公司;紫外可見分光光度計,上海知楚儀器有限公司;Waters 1515型高效液相色譜(配Waters 2414型示差檢測器和Aminex HPX-87H色譜柱),Bio-Rad公司。

1.1.4 培養(yǎng)基及其他溶液

YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20、無氨基酸酵母氮源10、葡萄糖20;滅菌條件為115 ℃、20 min。若需配制固體培養(yǎng)基,則在滅菌前在液體YPD培養(yǎng)基的基礎上加入瓊脂粉20 g/L。

1 mol/L山梨醇(g/L)：D-山梨醇182.2;滅菌條件為 121 ℃、20 min。

1 mg/L羅丹明123溶液：準確稱取1 mg羅丹明123于1.5 mL離心管中,在超凈臺中加入1 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組分析

對在高溫、高糖雙重脅迫條件下(37 ℃、200 g/L葡萄糖)培養(yǎng)的菌株 A223選取10和24 h這2個時間點進行 RNA-Seq測序分析。本次測序使用華大公司DNBSEQ平臺,將所測數(shù)據(jù)進行質(zhì)控,去除低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads后得到clean reads,再分別利用序列比對軟件HISAT和Bowtie2將參考基因組序列與參考基因序列進行比對。最后,通過檢測平臺一共得到5 897個基因,對這些基因進行定量分析、基于基因表達水平的各項分析,再對篩選出的樣品間差異表達基因(DEGs)進行pathway顯著性富集分析。使用軟件RSEM計算各個樣品的基因表達水平,篩選DEGs條件為校正后的Q值<0.05且|log2(差異倍數(shù))|>1。

1.2.2 菌株構(gòu)建

基因片段的構(gòu)建使用表2所列的相關引物,以BY4742基因組DNA為模板分別擴增長度為600 bp左右目標敲除基因的上下游片段(用作同源重組左右臂)SNZ1L(L-left)、SNZ1R(R-right),PDX3L、PDX3R,BUD16L、BUD16R,THI80L和THI80R,以T 載體為模板,分別擴增相應的G418表達盒。

表2 本研究所用引物

將純化后的目標敲除基因的上下游片段分別與G418表達盒進行OE PCR連接擴增,最后得到SNZ1L-G418-SNZ1R、PDX3L-G418-PDX3R、BUD16L-G418-BUD16R和THI80L-G418-THI80R。以SNZ1L/R、PDX3L/R、BUD16L/R和THI80L/R部分作為同源融合片段,用電轉(zhuǎn)化的方法將所構(gòu)建基因片段導入BY4742 菌株進行同源重組,在添加 3 g/L G418 抗生素的YPD 平板上培養(yǎng)后,利用驗證引物篩選陽性克隆。

過表達菌株的構(gòu)建以BY4742基因組DNA為模板,用表2所列引物分別擴增目標基因片段PHO3、PDX3、BUD16和THI80,啟動子TDH3p,終止子CYC1t以及同源整合位點的左右臂HOL/R,將純化后的基因片段進行 OE PCR 連接擴增,得到表達盒TDH3p-PHO3-CYC1t、TDH3p-PDX3-CYC1t、TDH3p-BUD16-CYC1t和TDH3p-THI80-CYC1t。將上述基因表達盒分別與整合位點的左右臂、G418 表達盒進行OE PCR連接擴增,最后得到HOL-TDH3p-PHO3-CYC1t-G418-HOR、HOL-TDH3p-PDX3-CYC1t-G418-HOR、HOL-TDH3p-BUD16-CYC1t-G418-HOR和HOL-TDH3p-THI80-CYC1t-G418-HOR。HOL/R部分作為同源融合片段,利用電轉(zhuǎn)化的方法將所構(gòu)建基因片段導入BY4742菌株進行同源重組,在添加3 g/L G418抗生素的YPD平板上培養(yǎng)后,利用驗證引物篩選陽性克隆。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵

將活化后的一級釀酒酵母種子液按10%(體積分數(shù))接種量轉(zhuǎn)接到含有YPD液體培養(yǎng)基的試管中,在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h,使大部分酵母細胞處于對數(shù)生長期,然后以初始OD600為0.1接種到細口錐形瓶中,使用硅膠塞封閉瓶口以維持微氧發(fā)酵條件,前12 h每隔4 h取樣檢測生物量(OD600),最后在24和36 h時分別取樣測OD600。

1.2.4 細胞發(fā)酵產(chǎn)物檢測

用高效液相色譜(HPLC)法檢測葡萄糖、乙醇和副產(chǎn)物甘油的濃度。取1 mL培養(yǎng)36 h的發(fā)酵液,12 000 r/min離心1 min后,準確吸取100 μL上層清液轉(zhuǎn)移至裝有900 μL蒸餾水的離心管中進行稀釋,振蕩混勻。將混勻后的溶液通過0.22 μm水系濾膜轉(zhuǎn)移至HPLC進樣小瓶。HPLC分析條件：柱溫65 ℃、檢測器溫度50 ℃、流動相5 mmol/L H2SO4、流速0.6 mL/min。

1.2.5 釀酒酵母ROS檢測

酵母的ROS含量用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-HA)法測定。取1 mL培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液, 5 000 r/min 離心2 min,棄上層培養(yǎng)基。然后吸取1 mL 1×PBS(pH 7.4)重懸細胞,5 000 r/min 離心2 min后棄上清,同樣操作步驟重復1次。再準確吸取900 μL 1× PBS重懸酵母細胞并在避光條件下添加已經(jīng)稀釋好的100 μL DCFH-HA 探針,充分混合均勻后,避光染色45 min,將染色后的菌液5 000 r/min離心2 min后棄上清。再吸取1 mL 1×PBS重懸菌體后,5 000 r/min離心 2 min,并重復1次,將重懸后的釀酒酵母菌液取適量體積加入96孔黑色酶標板內(nèi),每個樣品進行3次平行實驗,測其OD600,并以488 nm 的激發(fā)和 525 nm 的發(fā)射波長測定其熒光強度。

1.2.6 釀酒酵母線粒體膜電位檢測

酵母線粒體膜電位變化情況用羅丹明123(Rh123)來檢測,熒光強度與細胞膜電位成反比。取1 mL培養(yǎng)24 h發(fā)酵液,5 000 r/min離心2 min,棄上層培養(yǎng)基,然后吸取1 mL 1×PBS重懸細胞,5 000 r/min離心2 min,棄上清,同樣操作步驟重復1次。再準確吸取950 μL 1×PBS重懸酵母細胞并在避光添加已經(jīng)稀釋好的50 μL 1 mg/L Rh123溶液,充分混合均勻后避光條件下染色20 min,將染色后的菌液,5 000 r/min、離心2min后棄上清。再吸取1 mL 1×PBS重懸菌體,5 000 r/min、離心2 min,并重復1次,將重懸后的釀酒酵母菌液取適量體積加入96孔黑色酶標板內(nèi),每個樣品進行3次平行實驗,測其OD600,并以488 nm的激發(fā)和525 nm的發(fā)射波長測定其熒光強度。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)以Means±SD表示。組間比較使用了最小顯著差異(LSD)多重比較方法,P<0.05時,差異有統(tǒng)計學意義,并且用字母法來標注差異顯著的有統(tǒng)計學意義的組別。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫胺素途徑的轉(zhuǎn)錄組深度分析

筆者所在實驗室前期對耐受工業(yè)釀酒酵母CY進行了篩選及適應性改良,獲得了一株具有多層防御系統(tǒng)的工業(yè)菌株 A223[23]。該菌株在中試發(fā)酵中表現(xiàn)出較高的細胞活性及乙醇產(chǎn)量。與親本菌株相比,工程菌株具有明顯提高的ROS清除效率、質(zhì)膜及線粒體膜的完整性,丙二醛含量、細胞凋亡及壞死的比例也大大降低。本研究先對工業(yè)菌株 A223培養(yǎng)10和24 h的轉(zhuǎn)錄組進行深度分析,總結(jié)得到A223 菌株為抵御37 ℃高溫脅迫所進行的代謝重塑改變,再比較30和37 ℃條件下相同菌株和相同脅迫條件下不同菌株(A223 和CY)的轉(zhuǎn)錄組,構(gòu)建3個比較組：CY_37 ℃與CY_30 ℃、A_37 ℃與A_30 ℃、A_37 ℃與 CY_37 ℃,其中CY是出發(fā)菌株CY,A是A223菌株。在3 個比較組中共鑒定出5 447個DEGs,這些DEGs 經(jīng)過壓力響應基因相關分析,進一步選定了183 個耐受型壓力響應基因的DEGs,使用GO 數(shù)據(jù)庫進行生物通路分類和分析,結(jié)果見圖1(a)和(b)。

圖1 硫胺素合成途徑相關基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.1 Transcription level analysis of thiamine synthesis pathway related genes

由圖1(a)和(b)可知：在37 ℃的脅迫條件下,酵母細胞為降低脅迫環(huán)境對細胞器、細胞膜的破壞以及細胞正常生長和代謝的影響,胞內(nèi)相關代謝基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著變化,有20 個DEGs參與了硫胺素代謝過程(圖1(a)),其中 13個基因上調(diào)(THI20、THI4、THI5、THI12、BUD16、PDC1、PDC5、THI21、PHO3、THI80、THI3、THI7和THI6),7個基因下調(diào)(SNO1、SNO3、PDX3、SNZ1、SNZ2、SNZ3和PDC2)?？梢?在脅迫條件下,硫胺素的合成與代謝可能有助于酵母細胞應對不利環(huán)境的影響。由圖1(b)可以發(fā)現(xiàn),正常生長條件下,硫胺素合成相關基因在A223 和CY 菌株的表達量都不高。除編碼吡哆醇磷酸氧化酶PDX3基因外,催化吡哆醛磷酸鹽(PLP)到硫胺素焦磷酸(TDP)的相關基因(THI11、THI12、THI13、THI4、THI6和BUD16 等)FPKM 值均小于400,而催化生成PLP 的相關基因(SNZ1、SNZ2和SNZ3)相對于前者表達水平較高,這可能是為了增加硫胺素前體PLP所導致的。PLP 是多種酶促反應必不可少的輔因子,它能參與氨基酸代謝、維生素的代謝、能量代謝、碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝[24-25]。當菌株受到脅迫壓力時,CY和A223的硫胺素合成相關基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)整是相似的,參與硫胺素前體PLP 生成的部分基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)(如編碼吡哆醛激酶的BUD16),這可能會為硫胺素途徑上游提供豐富的前體PLP,也會導致多種酶促反應的上調(diào)。催化PLP到TDP的大部分基因轉(zhuǎn)錄都上調(diào),特別是編碼三功能酶(羥甲基嘧啶、磷酸甲基嘧啶激酶、硫胺素酶)的THI20基因[25]。同時,當CY菌株遭受脅迫壓力時,調(diào)控硫胺素基因表達的轉(zhuǎn)錄因子THI3以及催化TDP、硫胺素相互轉(zhuǎn)化的PHO3、THI80基因轉(zhuǎn)錄都上調(diào)。可見,硫胺素途徑在脅迫條件下發(fā)生重塑,體現(xiàn)了菌株調(diào)動所有資源對硫胺素進行富集,也進一步驗證了關于硫胺素的合成與代謝有助于酵母應對脅迫環(huán)境的猜想。

在37 ℃條件下,CY和A223菌株生長的前期,丙酮酸代謝途徑中的PDC1、PDC5和戊糖磷酸途徑中的TKL1都在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了上調(diào)(圖1(b)),因為這些重要代謝作用與升高的 TDP共同參與酵母應激反應,構(gòu)成了一個復雜且微妙的細胞防御系統(tǒng)[26]。因為丙酮酸途徑和戊糖磷酸途徑都是受到TDP輔因子調(diào)控的糖酵解的下游途徑,其中戊糖磷酸途徑的產(chǎn)物海藻糖對膜完整性維持有著積極作用,所以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等膜細胞器的穩(wěn)態(tài)對提高酵母菌株耐受性是至關重要的[13]。同時,具有緩解菌株內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用的氨基酸合成途徑基因ILV2的轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)。在工業(yè)上廣泛應用的耐受性強的酵母中,多達20個硫胺素基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化,由此可見,硫胺素途徑與菌株的耐熱性存在潛在聯(lián)系。

2.2 硫胺素合成相關基因缺失菌株在高溫下的調(diào)控機制

2.2.1 在高溫脅迫下基因缺失菌株的細胞性能

溫度是影響微生物正常生長代謝的重要參數(shù)之一。提高的菌株耐熱性不僅可以使細胞保持較好的生長代謝狀態(tài),還可為工業(yè)生產(chǎn)節(jié)省更多成本。為了表征菌株應對高溫脅迫對硫胺素合成關鍵基因的影響,詳細分析缺乏編碼硫胺素合成基因的酵母菌株ΔSNZ1、ΔPDX3、ΔBUD16和 ΔTHI80在30和37 ℃下的生長情況,結(jié)果見圖2(a)和(b)。由圖2(a)和(b)可知：在發(fā)酵后期缺失菌株的細胞生長均受到抑制,其中ΔTHI80生長抑制效果最明顯。因為THI80 編碼硫胺素焦磷酸激酶,負責將硫胺素磷酸化形成輔酶TDP,TDP是硫胺素發(fā)揮作用的主要活性形式[26],如果TDP缺乏會降低 NADPH,從而影響細胞合成代謝并導致葡萄糖消耗停止[27]。這解釋了敲除THI80后菌株的生長受到抑制,可見,這種酶對于細胞的一般代謝功能很重要。同時發(fā)現(xiàn),硫胺素途徑中單個基因的敲除對菌株在30和37 ℃條件下的生長無顯著影響。

圖2 在高溫脅迫下硫胺素途徑基因缺失菌株的生長曲線與細胞損傷測定Fig.2 Growth curves and cell damage of thiamine gene deletion strains under heat stress

為了探討硫胺素途徑基因的缺失對酵母細胞生長的影響機制,因此對缺失菌株胞內(nèi)的線粒體膜電位情況、ROS水平進行檢測。將突變株ΔTHI80、ΔSNZ1、ΔPDX3、ΔBUD16以初始OD600為0.1分別轉(zhuǎn)接至20 mL YPD培養(yǎng)基中,在30和37 ℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵24 h 后,利用ROS 檢測探針、羅丹明123 熒光染料進行表征,結(jié)果見圖2(c)和(d)。

事實上,硫胺素參與催化細胞質(zhì)中的酶促反應,而且線粒體等細胞器是硫胺素作用的場所,所以線粒體參與細胞響應脅迫的代謝網(wǎng)絡[22]。當菌株出現(xiàn)不同程度穩(wěn)態(tài)失衡甚至衰老時,就會出現(xiàn)不同程度線粒體膜電位下降的趨勢。由圖2(c)可知：在30 ℃條件下,菌株ΔTHI80、ΔPDX3的線粒體膜電位分別降低了24.5%和18.2%;當溫度為37 ℃時,ΔBUD16菌株的線粒體膜電位極顯著降低,檢測到的Rh123探針的熒光強度比對照升高1.66倍,ΔSNZ1菌株的線粒體膜電位升高25%,這是因為在37 ℃時,BUD16、SNZ1的敲除會導致酵母細胞線粒體膜完整性受到不同程度的損傷。

SNZ1編碼5′-磷酸吡哆醛合酶[24]、PDX3編碼吡哆醇磷酸氧化酶[28]、BUD16編碼吡哆醛激酶[29],這3個酶都參與催化硫胺素合成途徑主要中間產(chǎn)物 PLP的合成。因此,高溫條件下的細胞生長抑制可能是無法正常合成硫胺素所導致的。由圖2(d)可知：ΔPDX3在37 ℃高溫脅迫下的生長活性下降19%,同時菌株在30及37 ℃下對胞內(nèi)ROS清除能力都顯著減弱,導致ROS累積水平分別升高80%和286%。編碼吡哆醇磷酸氧化酶的PDX3缺失會導致擬南芥對溫度變得敏感,同時還積累大量的5′-磷酸吡哆醇胺(PMP),導致氮代謝受損[30]。在釀酒酵母中,PDX3的缺失導致菌株在含有2 mmol/L H2O2的YPD液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯的生長缺陷[31]。在本研究中,PDX3的缺失菌株表現(xiàn)為生長遲緩以及ROS清除能力嚴重受損。對菌株ΔBUD16、ΔSNZ1來說,在30 ℃時胞內(nèi)ROS累積量分別上升60%、50%,在37 ℃時胞內(nèi)ROS累積量分別上升277%、217%;特別在37 ℃條件下,菌株線粒體穩(wěn)態(tài)失衡,Rh123含量分別提高167%、26%。PLP缺失會導致DNA 損傷,進而威脅基因組完整性[29],本研究中ΔPDX3、ΔSNZ1和ΔBUD16 菌株的胞內(nèi)ROS 含量顯著增長亦證實該結(jié)果。ΔTHI80菌株的細胞損傷可能是TDP的合成受阻造成營養(yǎng)缺乏所導致的。由此可見,硫胺素途徑中的PLP和TDP對維持酵母細胞平衡活性氧水平以及調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)的能力十分重要。

2.2.2 回補硫胺素的基因缺失菌株在高溫脅迫下的細胞性能分析

為了考察敲除硫胺素途徑的基因造成的細胞受損是否由硫胺素缺乏所導致,因此在YPD 培養(yǎng)基中加入400 μg/L硫胺素[14],將ΔTHI80、ΔSNZ1、ΔPDX3和ΔBUD16 菌株在30 和37 ℃搖瓶中發(fā)酵并檢測細胞生長性能,結(jié)果見圖3。由圖3可知：在正常溫度條件下,添加400 μg/L 的硫胺素可以緩解THI80、PDX和BUD16基因缺失造成的細胞生長缺陷,不過ΔSNZ1菌株的生長卻受到了抑制;當溫度升至 37 ℃時,外源添加硫胺素無法緩解這4株菌的細胞生長缺陷。

圖3 添加400 μg/L硫胺素的缺失菌株在高溫脅迫下的生長曲線和細胞損傷測定Fig.3 Growth curves and cell damage of thiamine gene deletion strains added 400 μg/L thiamine solution under heat stress

同時發(fā)現(xiàn),在30 ℃條件下,外源添加硫胺素可以緩解ΔTHI80和ΔBUD16菌株的線粒體損傷和維持氧化還原能力,線粒體膜電位水平、胞內(nèi)ROS含量與相同條件下的對照菌株相比沒有顯著差別。在相同溫度下添加硫胺素,ΔSNZ1菌株的OD600降低了19%,生長被抑制,ROS累積量也提高了123%。SNZ2/3作為SNZ1的旁系同源物,可以滿足細胞對5′-磷酸吡哆醛和硫胺素的需求[24],所以可以推測SNZ1基因的缺失所帶來的負面影響不僅是缺乏硫胺素所導致的,外源添加的硫胺素也給細胞造成了毒效應,導致菌株生長受阻。當溫度升至37 ℃時,外源添加硫胺素無法彌補高溫對菌株代謝產(chǎn)生的影響,添加硫胺素后,ΔPDX3和ΔBUD16菌株的線粒體膜電位比相同條件下的BY4742菌株受損嚴重,Rh123含量分別提高86%和80%,同時胞內(nèi)ROS含量比BY4742菌株的分別升高81%、130%。由此可見,SNZ1、PDX3和BUD16基因缺失對細胞造成損傷是多種機制共同作用的結(jié)果。雖然外源添加硫胺素能緩解30 ℃條件下THI80缺失對菌株造成的損傷,但是不能補償37 ℃高溫脅迫給所有基因敲除菌株帶來的影響,說明硫胺素途徑的基因THI80缺失通過減少硫胺素合成對細胞生長產(chǎn)生影響。

2.3 過表達硫胺素合成基因菌株在高溫脅迫下的調(diào)控機制

2.3.1 過表達基因菌株在高溫脅迫下的細胞生長及發(fā)酵性能

為了考察硫胺素途徑的單基因過表達是否能提升細胞生長性能與穩(wěn)態(tài),因此,對過表達菌株BYTDH3p-PHO3、BYTDH3p-PDX3、BYTDH3p-BUD16和BYTDH3p-THI80分別在 30和37 ℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵36 h,結(jié)果見圖4。由圖4可知：在正常溫度條件下,過表達菌株的生長狀態(tài)與對照菌株相比沒有明顯差異;當發(fā)酵溫度為37 ℃時,過表達菌株的生長活性和乙醇產(chǎn)量也未表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。值得關注的是,在37 ℃脅迫下,THI80的缺失沒有造成菌株生長活性的顯著抑制,但過表達該基因卻造成菌株生長進入對數(shù)生長期的速度變慢、乙醇的緩慢累積及殘?zhí)堑木徛?。這可能是由于生物合成硫胺需要磷酸化的步驟較多,且THI80的底物游離硫胺素的合成需要經(jīng)歷兩個蛋白質(zhì)的合成和降解[13],這些都是耗能的過程。由此推斷,高溫脅迫條件下,過表達THI80過多地占用酵母菌株的能量資源,造成菌株的生長和代謝受損。

圖4 過表達基因菌株在高溫脅迫下的細胞生長曲線及發(fā)酵性能Fig.4 Cell curves and fermentation performance of the thiamine gene overexpression strains under heat stress

2.3.2 過表達基因菌株在高溫脅迫下的細胞損傷測定

菌株衰老的標志是線粒體功能下降[32-33],細胞凋亡也伴隨著線粒體膜的去極化,因此考察過表達基因菌株在高溫脅迫下的細胞損傷情況,結(jié)果見圖5。由圖5可知：在 30 ℃時,過表達PDX3、PHO3、BUD16和THI80的菌株線粒體膜電位分別上升了20%、21%、51%和48%;在 37 ℃時,相應菌株的線粒體膜電位分別上升33%、39%、41%和16%。在 30 ℃條件下,對照菌株與過表達菌株的胞內(nèi) ROS 含量沒有顯著區(qū)別;當溫度升高為37 ℃后,除過表達PDX3的菌株外,其余菌株的胞內(nèi)ROS含量都有不同幅度的增加,其中過表達THI80使菌株的胞內(nèi)ROS含量比對照菌株的提高了101%。

圖5 過表達基因菌株在高溫脅迫下的細胞損傷Fig.5 Cell damage of thiamine gene overexpression strains under heat stress

在缺乏維生素的情況下,PHO3編碼的酸性磷酸酶,在周質(zhì)空間水解硫胺素磷酸鹽,增加細胞對硫胺素的吸收[34]。因為過表達PHO3能加快胞外游離硫胺素進入胞內(nèi),而過表達PDX3、BUD16則可提高硫胺素前體PLP的合成,所以過表達這3個基因可通過富集硫胺素途徑的上下游關鍵化合物,有助維持菌株線粒體穩(wěn)態(tài)。THI80編碼的硫胺素焦磷酸激酶催化生成的TDP會被轉(zhuǎn)運到線粒體中發(fā)揮功能[26],所以過表達THI80 能增強硫胺素與線粒體活性之間的聯(lián)系,使線粒體穩(wěn)態(tài)有所增強。但是在高溫脅迫下,過表達參與硫胺素負反饋機制[35]的THI80則可能會擾亂整個硫胺素途徑的動態(tài)平衡,使菌株生長活性受到較大影響,導致氧化還原能力下降?？偟膩碚f,過表達硫胺素途徑的基因PHO3、PDX3、BUD16和THI80對酵母細胞在正常及高溫條件下的線粒體的穩(wěn)態(tài)都有顯著的增強作用。

2.4 討論

在乙醇工業(yè)發(fā)酵過程中,釀酒酵母面臨著高溫、高乙醇濃度、高滲透壓、高黏度及底物毒性等環(huán)境脅迫。這些胞外脅迫可以通過不同的方式擾亂蛋白質(zhì)的活性、細胞膜和代謝途徑,并誘發(fā)更深層的胞內(nèi)脅迫,從而導致蛋白質(zhì)的變性、活性氧的產(chǎn)生、細胞器的損傷和代謝紊亂。近年來,研究人員通過各種非理性和理性手段來提高釀酒酵母的耐受性,如基因組重排、馴化、誘變和CRISPR編輯,在系統(tǒng)水平上人為構(gòu)建抗脅迫系統(tǒng)等[36-38],但是對耐受性酵母菌株的轉(zhuǎn)錄組進行分析并關注差異代謝途徑與菌株在脅迫下穩(wěn)態(tài)的聯(lián)系的研究成果甚少。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組學和系統(tǒng)生物學對改造后具有多重耐受性的 A223 菌株進行深度分析,發(fā)現(xiàn)有20 個DEGs參與了硫胺素代謝過程,其中上調(diào)了13個基因(THI20、THI4、THI5、THI12、BUD16、PDC1、PDC5、THI21、PHO3、THI80、THI3、THI7和THI6),下調(diào)了7個基因(SNO1、SNO3、PDX3、SNZ1、SNZ2、SNZ3和PDC2)。Nosaka等[39]發(fā)現(xiàn),在釀酒酵母中,硫胺素的合成受到嚴格控制。從整體上看,菌株在脅迫條件下催化PLP合成TDP 的大部分基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),這可能是為了增加硫胺素水平,從而幫助酵母細胞應對不利環(huán)境的影響。硫胺素途徑中眾多基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著波動,說明該途徑與菌株耐受性存在密切聯(lián)系。

由于線粒體在呼吸作用和氨基酸代謝中起核心作用,且線粒體內(nèi)部進行的區(qū)室特異性代謝反應能幫助酵母適應高溫脅迫[40],可見線粒體穩(wěn)態(tài)所介導的細胞器調(diào)節(jié)對于脅迫環(huán)境下的菌株生長是至關重要的。由于SNZ1、BUD16等基因還可能參與調(diào)控其他代謝途徑,所以敲除硫胺素途徑中單個基因使菌株中的代謝平衡受到了擾動,導致菌株的ROS平衡能力顯著降低,這無法通過回補硫胺素來緩解。有趣的是,THI80基因的缺失和過表達都會對菌株的性能產(chǎn)生一定的負面影響。同時,Szappanos等[41]發(fā)現(xiàn),THI80催化產(chǎn)生的TDP在野生型菌株中受胞內(nèi)硫胺素含量動態(tài)調(diào)控,當硫胺素途徑中的前體物質(zhì)及硫胺素分子累積時,TDP暫時被抑制;當胞內(nèi)硫胺素含量達到一定程度時,TDP正常分泌,它不僅能與參加氧化應激信號傳導的基因相互作用,幫助菌株抵御外界脅迫[41],而且還能以輔因子的形式調(diào)控中心碳代謝途徑[26],使菌株的生長更好。所以THI80的敲除或過表達都會擾動硫胺素途徑的動態(tài)調(diào)控,造成菌株無法達到最佳生長狀態(tài),這個發(fā)現(xiàn)尚未見報道。

3 結(jié)論

硫胺素途徑中單個基因PDX3、SNZ1、BUD16、THI80和PHO3的缺失和過表達,對菌株的生長活性和乙醇產(chǎn)量的整體趨勢沒有顯著影響,但在37 ℃高溫脅迫下,基因缺失菌株的線粒體穩(wěn)態(tài)嚴重失衡,而且過表達這些基因?qū)暝?0和37 ℃的線粒體穩(wěn)態(tài)則具有顯著增強作用,表明硫胺素途徑對酵母細胞維持線粒體膜完整性有著直接的影響。特別是催化生成TDP的相關基因THI80的敲除與過表達分別會造成菌株在30與37 ℃條件下的生長抑制與平衡活性氧的能力降低,但THI80缺失對菌株造成的負面影響可以通過外源添加硫胺素來緩解,表明實現(xiàn)硫胺素對菌株脅迫的調(diào)控需要對途徑基因進行整體的組合調(diào)動。

本研究利用生物信息學和系統(tǒng)生物學更加深入地解析了細胞響應脅迫的變化,在轉(zhuǎn)錄水平上確定了酵母細胞利用硫胺素途徑來應對高溫脅迫,并以實驗驗證硫胺素途徑在高溫脅迫下對維持線粒體膜穩(wěn)態(tài)有積極作用,為硫胺素途徑調(diào)控酵母細胞應對高溫脅迫的細胞器調(diào)節(jié)機制提供理論支持。