劉 渝,孫敏捷

(中國(guó)藥科大學(xué) 藥劑系,江蘇 南京 210009)

細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞釋放的一系列具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡,包括外泌體、微囊泡以及凋亡小體(apoptotic body)[1]。細(xì)胞外囊泡由各種脂質(zhì)和膜蛋白組成,其中一部分特殊的膜蛋白有助于靶向特定的組織和細(xì)胞,而另一部分蛋白則確保將非特異性相互作用降到最低[2-3],這些生理特性賦予了其優(yōu)異的生物相容性和靶向病灶的能力,使細(xì)胞外囊泡能夠廣泛用于藥物遞送領(lǐng)域的研究[4-6]。

與活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體和微囊泡相比,來(lái)源于凋亡細(xì)胞的凋亡小體具有更高的產(chǎn)生效率[7]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)將生物分子包裝成囊泡的自然過(guò)程,基于此,藥物可通過(guò)此過(guò)程高效地裝載到凋亡小體中[8-9],所以完整的凋亡小體可作為一種具有潛力的藥物遞送載體。一些凋亡小體衍生物(如重組凋亡小體[10]、凋亡小體膜修飾的納米顆粒[11]等)既保留了凋亡小體優(yōu)異的生理特性,又具有藥物遞送所需的合適尺寸以及更高的載藥效率,這可進(jìn)一步推動(dòng)基于凋亡小體的藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用。基于此,本文在概述凋亡小體的形成機(jī)制基礎(chǔ)上,對(duì)近年來(lái)基于凋亡小體的藥物遞送系統(tǒng)的相關(guān)研究進(jìn)行綜述,以期為凋亡小體藥物遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

1 凋亡小體的形成機(jī)制

細(xì)胞凋亡是一種保守的程序性細(xì)胞死亡方式,通常出現(xiàn)在多細(xì)胞生物體中[12],以此維持生物體中正常細(xì)胞群體的動(dòng)態(tài)平衡,因此在發(fā)育和衰老過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[13]。這種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程是由多種因素(包括細(xì)胞應(yīng)激、DNA損傷和免疫監(jiān)視)觸發(fā)的相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)的[14]。在整個(gè)凋亡過(guò)程中,細(xì)胞經(jīng)歷了一系列形態(tài)變化,并最終導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的分解。凋亡細(xì)胞的解體分為三個(gè)不同的形態(tài)學(xué)過(guò)程,即質(zhì)膜起泡、形成凋亡膜突起以及最終分解為凋亡小體(圖1)[15-16]。

圖1 凋亡小體的形成機(jī)制[16]Fig.1 Formation mechanism of apoptotic body[16]

1.1 質(zhì)膜起泡

質(zhì)膜起泡是凋亡細(xì)胞分解的第一步,即在凋亡細(xì)胞表面形成大的圓形凸起,這一過(guò)程由細(xì)胞骨架塌陷和靜水壓力增加驅(qū)動(dòng),而肌動(dòng)球蛋白收縮過(guò)程中產(chǎn)生的壓縮應(yīng)力會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的靜水壓力,使細(xì)胞溶質(zhì)從膜附著較弱的區(qū)域擠出,最終導(dǎo)致質(zhì)膜起泡[17]。此過(guò)程使得最終形成的凋亡小體保留了豐富的細(xì)胞內(nèi)容物和相關(guān)蛋白分子。在分子水平上,質(zhì)膜起泡過(guò)程受多種激酶的調(diào)節(jié),包括p21激活激酶2(PAK2)、Lim結(jié)構(gòu)域激酶1(LIMK1)和Rho相關(guān)激酶1(ROCK1),其中,ROCK1被認(rèn)為是質(zhì)膜起泡過(guò)程的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)因子[18-19]。

1.2 凋亡膜突起形成

在質(zhì)膜起泡后,一些細(xì)胞可以繼續(xù)產(chǎn)生長(zhǎng)的凋亡膜突起,稱(chēng)為凋亡足(apoptopodia)和珠狀凋亡足(beaded apoptopodia)[20]。凋亡足在質(zhì)膜起泡后從質(zhì)膜中被擠出并具有長(zhǎng)串狀外觀(guān),沿這些突起能觀(guān)察到凋亡小體樣結(jié)構(gòu),可見(jiàn)凋亡足是通過(guò)分離膜泡來(lái)促進(jìn)凋亡小體的形成。相比之下,珠狀凋亡足由幾個(gè)連續(xù)的凋亡小體連接而成,其長(zhǎng)度可以達(dá)到親代細(xì)胞的數(shù)倍,單個(gè)珠狀凋亡足的斷裂可導(dǎo)致10～20個(gè)大小一致的凋亡小體釋放,其中每個(gè)凋亡小體的直徑為1～3 μm[15]。泛連接蛋白-1(PANX1)通道[21]、Plexin B2(PlexB2)受體[22]、細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及囊泡運(yùn)輸過(guò)程等[20]參與調(diào)節(jié)凋亡膜突起的形成。PANX1是凋亡細(xì)胞分解過(guò)程的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子,因?yàn)樽钄郟ANX1通道可以促進(jìn)凋亡小體的形成,進(jìn)而提高巨噬細(xì)胞對(duì)于凋亡細(xì)胞的吞噬和清除效率,這有利于治療與凋亡細(xì)胞清除缺陷相關(guān)的炎癥和自身免疫疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化等[18,23]。

1.3 凋亡小體形成

凋亡膜突起斷裂形成分散的凋亡小體是凋亡細(xì)胞分解的最后一步,通常這一過(guò)程需要在外部因素(如剪切力、細(xì)胞間物理相互作用)和內(nèi)部因素(如脫落樣過(guò)程)的協(xié)同來(lái)完成[13]。調(diào)節(jié)細(xì)胞分解上游步驟的許多因素都會(huì)影響凋亡小體的產(chǎn)量。如,通過(guò)抑制ROCK1、肌動(dòng)蛋白聚合以及囊泡運(yùn)輸不僅能抑制質(zhì)膜起泡或凋亡膜突起形成,而且還能導(dǎo)致凋亡小體的總體產(chǎn)量減少。與之相反,抑制PANX1活性可增強(qiáng)凋亡膜突起的形成,導(dǎo)致隨后的凋亡小體數(shù)量增加。另外,缺乏LIMK1的細(xì)胞在誘導(dǎo)凋亡后產(chǎn)生了更多的凋亡小體[9,18]。

基于目前對(duì)凋亡細(xì)胞分解過(guò)程的機(jī)制解析,凋亡小體的形成被認(rèn)為是一個(gè)可干預(yù)的生物發(fā)展過(guò)程,通過(guò)抑制或者促進(jìn)凋亡小體的形成可以獲得針對(duì)不同疾病的理想治療結(jié)果[16,23]。如,使用抗精神病藥物氟哌啶醇抑制凋亡單核細(xì)胞分解產(chǎn)生凋亡小體,可以有效減少甲型流感病毒在細(xì)胞間的傳播,并減輕小鼠模型中流感的嚴(yán)重程度[24]。而PANX1抑制劑,如丙磺舒和羧甲氧芐啶,可以促進(jìn)凋亡小體的形成,因此可被用于動(dòng)脈粥樣硬化、唐氏綜合征等疾病的治療[23]。

2 凋亡小體在藥物遞送方面的應(yīng)用

凋亡小體可以裝載一系列細(xì)胞內(nèi)容物(如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等),并將這些物質(zhì)轉(zhuǎn)移到其他可以吞噬凋亡小體的細(xì)胞中,促進(jìn)細(xì)胞間的物質(zhì)和信息交流,這表明凋亡小體具有作為藥物遞送載體的巨大潛力。目前,基于凋亡小體的藥物遞送系統(tǒng)主要分為四類(lèi)：①完整凋亡小體直接作為藥物載體;②重組凋亡小體藥物遞送系統(tǒng);③基于凋亡小體原位生成的藥物遞送系統(tǒng);④類(lèi)凋亡小體仿生遞送系統(tǒng)。

2.1 完整凋亡小體直接作為藥物載體

由于凋亡小體的尺寸效應(yīng)以及獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì),研究者們?cè)J(rèn)為其不適合作為藥物遞送載體,然而最近的研究[25-27]正逐漸推翻這一論斷。研究者們利用各種方法(包括紫外照射、藥物處理以及饑餓乏氧處理等)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28-30],并收集產(chǎn)生的凋亡小體來(lái)構(gòu)建載藥凋亡小體,這些載藥凋亡小體保留了親代細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性,表現(xiàn)出優(yōu)異的靶向病灶部位的能力。Wang等[31]通過(guò)紫外照射聯(lián)合H2O2刺激誘導(dǎo)預(yù)先攝取抗TNF-α反義寡核苷酸(ASO)的B16F10腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體,構(gòu)建載有ASO的凋亡小體(sCABs),經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：這些腫瘤細(xì)胞來(lái)源的凋亡小體表面可高表達(dá)細(xì)胞黏附分子CD44v6,在CD44v6的介導(dǎo)下,凋亡小體可以高效跨越血腦屏障(BBB);在帕金森癥(PD)小鼠模型中,sCABs能有效跨越BBB并通過(guò)ASO介導(dǎo)的抗炎作用顯著改善PD癥狀(圖2)。同樣,載藥凋亡小體在腫瘤的靶向治療中也取得了優(yōu)異的治療效果。Zuo等[32]利用X線(xiàn)照射腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡微粒,然后通過(guò)電穿孔使凋亡微粒負(fù)載5-氨基乙酰丙酸己酯鹽酸鹽(HAL)和3-溴丙酮酸(3BP),成功構(gòu)建凋亡微粒復(fù)合物HAL/3BP@X-MP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)尾靜脈給藥后,HAL/3BP@X-MP可特異性靶向腫瘤細(xì)胞,并在HAL和3BP的協(xié)同作用下產(chǎn)生優(yōu)異的光動(dòng)力治療效果。

圖2 通過(guò)腫瘤細(xì)胞衍生的小凋亡小體跨血腦屏障遞送反義寡核苷酸[31]Fig.2 Delivering antisense oligonucleotides across the blood-brain barrier by tumor cell-derived small apoptotic bodies[31]

一般認(rèn)為,微米級(jí)的凋亡小體很難通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留(EPR)效應(yīng)聚集于腫瘤區(qū)域,但是可以通過(guò)體內(nèi)“搭便車(chē)”效應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送?！按畋丬?chē)”效應(yīng)是指利用合成的藥物載體對(duì)體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行靶向,這些藥物載體被內(nèi)源性細(xì)胞吞噬或吸附在細(xì)胞表面之后,利用內(nèi)源性細(xì)胞天然的歸巢能力,可將藥物靶向遞送到病灶部位[33-34]。由于凋亡小體表面暴露了大量磷脂酰絲氨酸(PS),這種特殊的磷脂可以作為“吃我”信號(hào)被體內(nèi)專(zhuān)職吞噬細(xì)胞(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)識(shí)別從而促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)凋亡小體的吞噬[35],然后利用單核/巨噬細(xì)胞的腫瘤歸巢能力實(shí)現(xiàn)負(fù)載藥物的靶向腫瘤遞送。Zheng等[36]開(kāi)發(fā)了一種載有金納米棒和CpG免疫佐劑的凋亡小體遞藥平臺(tái)AuNR-CpG/AB,其尺寸為1～5 μm,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：AuNR-CpG/AB可被炎性L(fǎng)y-6C+單核細(xì)胞特異性吞噬,然后通過(guò)單核細(xì)胞天然的腫瘤歸巢效應(yīng)被主動(dòng)運(yùn)送至腫瘤部位,這種細(xì)胞介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)能有效將藥物靶向遞送到腫瘤部位,然后在近紅外光照射下高效消融原發(fā)腫瘤,并且可以誘發(fā)免疫激活效應(yīng)來(lái)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

不同尺寸的凋亡小體可通過(guò)不同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送,納米級(jí)的凋亡小體可以與傳統(tǒng)的納米藥物一樣通過(guò)EPR效應(yīng)及同源靶向作用來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤或其他疾病的靶向治療[31,37],而微米級(jí)的凋亡小體則可以通過(guò)體內(nèi)“搭便車(chē)”的方式將藥物遞送到靶向部位[36]?？梢钥隙ǖ氖?無(wú)論通過(guò)哪種轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,利用凋亡小體進(jìn)行藥物遞送是一種非常有潛力的遞藥策略。

2.2 重組凋亡小體藥物遞送系統(tǒng)

為了保留凋亡小體的生物相容性及靶向能力,同時(shí)提高載藥的效率和穩(wěn)定性,研究者先將制備的凋亡小體與藥物進(jìn)行混合,然后通過(guò)各種力學(xué)作用重組凋亡小體并高效負(fù)載藥物。Bose等[10]通過(guò)簡(jiǎn)單的饑餓策略來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體,再將收集的凋亡小體與抗生素萬(wàn)古霉素(vancomycin)混合后并進(jìn)行超聲和凍融處理,最后通過(guò)濾膜過(guò)濾擠壓形成大小均一的負(fù)載萬(wàn)古霉素的重組凋亡小體ReApoBds,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：重組過(guò)程顯著降低了凋亡小體的尺寸并提高了萬(wàn)古霉素的封裝效率;體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與游離萬(wàn)古霉素相比,加載萬(wàn)古霉素的ReApoBds能更好地靶向巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞并有效殺死細(xì)胞內(nèi)的金黃色葡萄球菌(S.aureus)。因此,該策略可用于抗腫瘤治療引起的細(xì)菌感染的治療(圖3)。Zhang等[7]通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)膜起泡和擠壓相結(jié)合的方法誘導(dǎo)4T1細(xì)胞凋亡產(chǎn)生凋亡小體,并將凋亡小體優(yōu)化為藥物遞送所需的合適尺寸,最后通過(guò)電穿孔負(fù)載皂草素蛋白和抗twist siRNA得到凋亡小體類(lèi)似物ABA,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：由于繼承了親代細(xì)胞的膜蛋白成分(如CD47和細(xì)胞黏附分子),ABA同時(shí)具備抗免疫細(xì)胞吞噬和同源靶向能力;在4T1腫瘤原位轉(zhuǎn)移模型中,ABA在腫瘤部位顯示出較強(qiáng)靶向蓄積能力,并且能夠防止腫瘤細(xì)胞的增殖和肺轉(zhuǎn)移。

通過(guò)不同的誘導(dǎo)方法[38-39]與力學(xué)作用[40-42]組合可以制備各種符合需求的重組凋亡小體藥物遞送系統(tǒng)。這些重組凋亡小體既保留了凋亡小體的生物學(xué)特性,又具有高效的藥物裝載效率和合適的尺寸。更重要的是,通過(guò)合理設(shè)計(jì)制備方法可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)所需要的重組凋亡小體,這將有助于其進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化。

2.3 基于凋亡小體原位生成的遞送系統(tǒng)

細(xì)胞凋亡產(chǎn)生凋亡小體后,不僅可以被專(zhuān)職吞噬細(xì)胞吞噬,還可以被鄰近細(xì)胞吞噬并處理?；谶@種鄰近效應(yīng)(neighboring effect),凋亡小體可以在細(xì)胞凋亡后將剩余的藥物攜帶至鄰近腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤內(nèi)的深層滲透[43-44]。Zhao等[45]制備了一種由喜樹(shù)堿(CPT)和乏氧(hypoxia)激活型前藥PR104A組成的前藥納米粒CSSP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CPT殺死外部常氧(normoxia)腫瘤細(xì)胞以產(chǎn)生凋亡小體,而PR104A保持非活性;剩余藥物被凋亡小體有效地輸送到內(nèi)部的深層腫瘤細(xì)胞中,在腫瘤深部乏氧環(huán)境中PR104A被激活,發(fā)揮較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,進(jìn)一步促進(jìn)剩余藥物的深度滲透(圖4)。這種方法增強(qiáng)了凋亡小體的鄰近效應(yīng),從而放大腫瘤治療效果。同樣,利用凋亡小體的鄰位效應(yīng)也可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的光動(dòng)力治療,Zheng等[46]設(shè)計(jì)了一種載有光敏劑PpIX前體的淋巴細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這種淋巴細(xì)胞能特異性地積聚在腫瘤組織中,在630 nm激光照射下,淋巴細(xì)胞產(chǎn)生含有PpIX的凋亡小體,隨即被鄰近的腫瘤細(xì)胞吞噬,并在第二次激光照射下實(shí)現(xiàn)腫瘤的光動(dòng)力治療。

圖4 凋亡小體介導(dǎo)的細(xì)胞間遞送以增強(qiáng)藥物滲透和整個(gè)腫瘤破壞[45]Fig.4 Apoptotic body-mediated intercellular delivery for enhanced drug penetration and whole tumor destruction[45]

因此,通過(guò)凋亡小體的鄰近效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的深層滲透,再聯(lián)用放射治療、光治療等方法,是一種非常有前景的腫瘤治療策略。然而,為了更好地增強(qiáng)納米藥物的腫瘤滲透性,仍需要進(jìn)一步明確基于鄰近效應(yīng)的細(xì)胞間藥物傳遞的具體作用機(jī)制,這樣有助于我們?cè)O(shè)計(jì)和制備具有針對(duì)性的藥物遞送系統(tǒng)以放大鄰近效應(yīng),進(jìn)而提高納米藥物治療腫瘤的效率并促進(jìn)其臨床應(yīng)用。

2.4 類(lèi)凋亡小體仿生遞送系統(tǒng)

受吞噬細(xì)胞能特異性吞噬凋亡小體的啟發(fā),研究者們?cè)O(shè)計(jì)出一系列類(lèi)凋亡小體仿生納米藥物載體來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物靶向巨噬細(xì)胞的遞送[47-48]。這些仿生納米藥物載體既保留了凋亡小體優(yōu)異的靶向能力,又具有納米藥物載體易于制備和修飾的優(yōu)點(diǎn)[49-50]。Dou等[11]利用T細(xì)胞來(lái)源的凋亡小體膜修飾載藥介孔硅納米粒(MSN),構(gòu)建了用于按需調(diào)節(jié)炎癥的嵌合凋亡小體CAB,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MSN預(yù)裝載抗炎劑(microRNA-21或姜黃素),并用刺激響應(yīng)分子進(jìn)行修飾,實(shí)現(xiàn)藥物的定點(diǎn)釋放;CAB能主動(dòng)靶向炎癥區(qū)域的巨噬細(xì)胞并促進(jìn)這些巨噬細(xì)胞由M1表型向M2表型極化以調(diào)節(jié)炎癥(圖5)。通過(guò)這種策略,他們已經(jīng)在動(dòng)物層面成功實(shí)現(xiàn)了包括結(jié)腸炎[11]和心肌梗死[51]等在內(nèi)的多種炎癥的有效治療。然而,在制備凋亡小體膜修飾的納米粒過(guò)程中,很可能會(huì)引起部分膜蛋白損失或原本位于凋亡小體膜外側(cè)的靶向分子未展示在顆粒外表面從而降低靶向效率。因此,需要在后續(xù)研究過(guò)程中對(duì)關(guān)鍵靶向分子進(jìn)行定量分析并不斷優(yōu)化制備過(guò)程以最大程度保留凋亡小體膜的靶向能力。

圖5 具有天然膜和模塊化遞送系統(tǒng)功能的嵌合凋亡小體用于炎癥調(diào)節(jié)[11]Fig.5 Chimeric apoptotic bodies functionalized with natural membrane and modular delivery system for inflammation modulation[11]

另一種有效的基于凋亡小體的仿生遞送策略是利用PS修飾納米藥物載體[10]。Wu等[52]將PS修飾到載有PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮的脂質(zhì)體表面,構(gòu)建了凋亡小體仿生脂質(zhì)體(AP-Lipo)以實(shí)現(xiàn)將吡格列酮靶向遞送到動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域的巨噬細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未修飾的脂質(zhì)體相比,AP-Lipo能更有效地識(shí)別和穿透活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞,靶向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,通過(guò)上調(diào)抗炎巨噬細(xì)胞數(shù)量,穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。同樣,通過(guò)這種策略可將藥物遞送至腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤治療。Liu等[53]設(shè)計(jì)了一種PS修飾的達(dá)沙替尼脂質(zhì)體,靶向并耗竭TAMs,從而提高抗腫瘤療效。因此,無(wú)論是基于凋亡小體膜修飾還是PS修飾的仿生納米粒,均可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向遞送,這為炎癥以及腫瘤治療提供了一種新思路。

3 總結(jié)與展望

近年來(lái),基于凋亡小體的藥物遞送系統(tǒng)受到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注,并取得了一系列矚目的研究成果,為藥物的靶向遞送提供了新的思路和理念。然而,由于凋亡小體的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚未完全明確以及缺乏統(tǒng)一規(guī)范的生產(chǎn)及提純工藝標(biāo)準(zhǔn),因此將其廣泛應(yīng)用于藥物遞送仍需進(jìn)一步研究。未來(lái)我們需要更加深入地研究凋亡小體的生物學(xué)特性,闡述凋亡小體的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,并開(kāi)發(fā)新的制備方法以提高凋亡小體的穩(wěn)定性及病灶靶向能力,從而進(jìn)一步推動(dòng)基于凋亡小體的藥物遞送系統(tǒng)的臨床轉(zhuǎn)化,使其更好地應(yīng)用于各種疾病的有效治療。