孟君仁 牛良 潘磊 崔國朝 孫世航 段文宜 曾文芳 王志強

摘要：【目的】多數(shù)桃品種果實在成熟后迅速軟化，導致來不及采收、采后易腐爛，是制約桃產業(yè)發(fā)展的關鍵問題。慢 溶質桃具有較長的硬熟期，可以減輕因果實軟化造成的損耗，是未來桃耐貯運育種的重要方向之一?！痉椒ā恳月苜| 品種春雪、春瑞為試材，通過構建群體、肉質評價，對慢溶質性狀進行遺傳分析和集群分離分析（bulk segregant analysis， BSA）定位?！窘Y果】通過對比慢溶質品種和非慢溶質品種成熟過程中軟化的特點，發(fā)現(xiàn)慢溶質留樹時間較長，乙烯 延遲釋放。在慢溶質分離群體中，留樹時間呈明顯的雙峰分布，遺傳傾向分析表明慢溶質受到單基因或主效數(shù)量性狀 基因座（quantitative trait locus，QTL）控制，春雪慢溶質位點為雜合，春瑞為純合。以春雪桃自交群體為試驗材料，基于 BSA分析，將慢溶質定位到桃第4 號染色體4 個區(qū)段，總長度7.87 Mb?！窘Y論】桃慢溶質性狀遺傳受顯性單基因或主效 基因控制，其控制基因位于第4號染色體。

關鍵詞：桃；果實；慢溶質；軟化

中圖分類號：S662.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）06-1064-08

桃（Prunus persica）原產中國，自1993 年起中國 桃的栽培面積和產量全面超過意大利和美國，成為 世界第一產桃大國，并一直保持至今[1]。桃因皮薄 肉厚、味道鮮美而廣受消費者喜愛[2]。與柑橘、蘋 果、梨等水果不同，大多數(shù)桃果實成熟后迅速軟化， 留樹時間和貨架期短，若提前采收又會導致果實品 質下降，影響消費體驗。此外，隨著桃產業(yè)向集約化 方向的發(fā)展，采后遠距離運輸成為常態(tài)，軟溶質桃不耐貯運的短板很大程度上限制了該種肉質類型桃的 發(fā)展。

質地影響桃果實留樹期和貯運性。目前桃果肉 質地性狀主要包括：溶質（melting flesh，MF）、不溶 質（non- melting flesh，NMF）、硬質（stony hard） 等[3]。不溶質桃成熟后果實有韌性，留樹時間較長， 傳統(tǒng)上多用于加工罐頭，當前也有部分品種進入鮮 食市場。硬質桃果實成熟后不釋放乙烯，果實保持 硬脆，留樹時間2 周以上，具備優(yōu)異的采后貯運特 性[4]，但該種類型果實成熟后不變軟，伴隨著沒有果 實成熟期桃特征性香氣，因此也有一些局限性。此 外，國外最早于2011 年報道了油桃品種Big Top 獨 特的軟化特征，這種肉質雖然最終會釋放乙烯使果 實變軟，但果實在成熟前期能保持較高的硬度，具有 較長的留樹期和貨架期[5-6]，并將這一質地類型分類 為慢溶質桃（slow-melting flesh，SMF）。Chen 等[7]對 慢溶質單株S11-8 與非慢溶質單株M12-10 成熟過 程硬度變化規(guī)律進行比較，發(fā)現(xiàn)S11-8 軟化速度比 M12-10 慢得多，而且S11-8 完全軟化的發(fā)生相對較 晚。Ghiani 等[6]通過比較慢溶質型桃Big Top 和溶質 型桃Bolero 采收后硬度和乙烯的變化，發(fā)現(xiàn)果實成 熟期的Big Top 果實硬度比Bolero 明顯更硬，采后室 溫放置5 d 后果實變軟，最終果實硬度與Bolero 類 似。在果實成熟期采收后，Bolero 桃迅速釋放乙烯， 而Big Top 桃果實采收后4 d 才開始釋放乙烯。對于 慢溶質性狀定位的研究也有一些報道，但由于肉質 判別標準的缺乏導致基因定位困難，已發(fā)表的定位 結果表現(xiàn)出較大的差異，相關分子標記仍未能實踐 應用[7-9]。

慢溶質桃成熟后既有較長的留樹時間和貨架 期，又能夠保持桃果實的特殊風味，已成為歐美國家 桃肉質改良和發(fā)展的主要方向，但是，慢溶質桃在中 國相對較晚才被利用，遺傳資源匱乏，相關機制研究 甚少。筆者在本研究中以春雪、春瑞等慢溶質桃品 種為材料，通過構建分離群體，對后代表型進行分 析，明確慢溶質性狀的遺傳傾向，利用BSA 分析對 該性狀進行初步定位。研究結果初步揭示了桃果實 慢溶質肉質類型的生理特征、遺傳傾向及初步定位， 為今后慢溶質候選基因的挖掘以及調控機制的研究 奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以SMF品種春雪、春瑞為主要親本構建遺傳群 體，具體信息見表1。對雜交單株的肉質鑒定于 2021 年5—8 月和2022 年5—8 月在中國農業(yè)科學院 鄭州果樹研究所新鄉(xiāng)試驗基地的雜種苗定植圃內進 行，株行距為1.0 m×4.0 m，2017 年定植。慢溶質桃軟化特點分析所用品種為春麗、春瑞，非慢溶質分析 所用品種為春美、春蜜，均來自中國農業(yè)科學院鄭州 果樹研究所桃育種圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 自交選擇生長健壯的成年樹作母本樹，于 蕾期對全株進行套袋，防止異花授粉，2 周后去除紙 袋。其他管理按常規(guī)。

1.2.2 雜交選擇生長健壯的成年樹作母本，于大 蕾期去雄，點授父本花粉，套袋，10 d 后去袋，其他管 理按常規(guī)。

1.2.3 果實生理指標測定果實成熟階段的樣品， 果實達到八成熟開始采集，每3 d 取樣1 次，每次20 個果實。采樣時間點設為R、R+3、R+6、R+9、R+12、 R+15，代表八成熟后天數(shù)。果實采收后，立即帶回 實驗室，選取大小均勻、成熟度一致、無病蟲害和機 械損傷的果實，用于軟化生理特點分析。隨機選取9 個果實，在果實赤道處，削去縫合線兩側及對面部 位的果皮，用水果硬度計GY-4 測定果實去皮硬度， 每個果實的三個部位的平均值作為每個果實的果肉 硬度，單位為牛頓（N）。乙烯測定參考Zeng 等[10]的 方法：隨機選取9 個果實，3 個為一組，置于密封的 2.0 L保鮮罐中，密閉2 h，取1 mL氣體，用氣相色譜 儀GC-2010（島津，日本）測定乙烯釋放量，單位為 nL · g- 1 · h- 1。氣相色譜儀條件為：AI2O3/S 色譜柱 （30 m×0.53 mm，0.25 μm）；柱溫50 ℃，SPL1 檢測室 溫度為200 ℃，F(xiàn)ID1 檢測室溫度為200 ℃；載氣氮 氣流速為32 mL·min-1，氫氣流速為40 mL·min-1，空 氣流速為400 mL·min-1。

1.2.4 雜交群體后代果實性狀調查通過判斷果實 著色完全、果個已膨大到商品果大小、果皮底色已完 成褪綠、品質風味已可食用，即果實成熟，之后每2 d 調查1 次果實硬度，參考王力榮等[11]的方法將硬度 劃分為“很硬、硬、中、軟、很軟”5 個等級，統(tǒng)計雜種 單株70%果實在成熟后變軟之前的掛樹時間，大于 等于10 d為慢溶質，小于10 d 為非慢溶質。

1.2.5 BSA 分析在群體后代中分別選取非慢溶 質（留樹時間＜6 d）或慢溶質（留樹時間＞14 d）各 20 株，組成2 個極端性狀混池（非慢溶質混池為NSMF pool，慢溶質混池為SMF pool），提取基因組 DNA，委托北京百邁客生物科技有限公司進行重測 序，全部樣品的測序深度為30 倍。參考基因組為桃 Lovell（https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/prunus_ persica_v2.0.a1/）。利用兩混池間基因型存在差異 的SNP、InDel 位點[12]，統(tǒng)計差異位點在不同混池中 的深度，并計算每個位點ED（歐氏距離，Euclidean Distance）值。為消除背景噪音，對原始ED 值進行 乘方處理，筆者在本試驗中取原始ED的5 次方作為 關聯(lián)值以達到消除背景噪音的功能，然后采用DISTANCE 方法[13]對ED值進行擬合。取所有位點擬合 值的median+3SD 作為分析的關聯(lián)閾值，計算得 0.10，設定為篩選的閾值，閾值外的區(qū)域為潛在候選 調控基因定位區(qū)域。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖 采用微軟Excel 2019。

2 結果與分析

2.1 慢溶質品種成熟過程中硬度變化與乙烯釋放

為了顯示慢溶質桃成熟過程中的軟化特征，選 擇成熟期相近的兩組慢溶質桃vs 非慢溶質桃—春 麗vs 春美（圖1）和春瑞vs春蜜（圖2）進行比較。結果 顯示，非慢溶質品種春美、春蜜果實硬度在成熟后9 d 已降至最低，慢溶質品種春麗、春瑞果實在成熟后15 d 才完全軟化。非慢溶質桃春美和春蜜成熟階段硬度 保持在15 N以上的時間僅6 d；慢溶質桃春麗和春瑞 至少12 d。因此，將果實成熟后硬度保持在15 N以 上水平的時期定為果實留樹時間，慢溶質桃留樹時間 （天數(shù)）是非慢溶質桃的2 倍左右。慢溶質桃品種春 麗在R+12 階段之前乙烯釋放量很低，春瑞在R+12 階段之前沒有乙烯釋放，慢溶質桃直到最終軟化發(fā)生 時才伴隨乙烯大量釋放；而非慢溶質桃品種在R+6階 段開始就產生很高的乙烯釋放量。綜上兩組數(shù)據(jù)，慢 溶質桃春瑞、春麗留樹時間至少12 d，相較非慢溶質桃春美、春蜜長6 d，乙烯也相應延遲釋放。

2.2 慢溶質群體后代肉質鑒定及遺傳傾向

為了更高效快速鑒定群體后代表型，筆者對不 同組合后代果實留樹時間進行評價，判別果實肉 質。對春雪自交群體進行表型評價，發(fā)現(xiàn)后代留樹 時間呈雙峰分布，集中在＜5 d 和≥10 d，中間類型 6～9 d幾乎沒有（圖3-A），慢溶質桃∶非慢溶質桃=67∶ 21。對春雪×99-30-33 群體進行表型評價，發(fā)現(xiàn)后代 留樹時間呈雙峰分布，集中在＜5 d 和≥10 d，中間類 型6～9 d 只有5 個單株（圖3-B），慢溶質桃∶非慢溶質 桃=28∶33。對04-1-91×春瑞和04-3-25×春瑞進行表 型評價，后代留樹時間只有≥10 d 一種類型，后代沒 有出現(xiàn)＜10 d 的類型，群體后代全部為慢溶質桃類 型（圖3-C～D）。

春雪組合后代群體中肉質分離，春瑞組合后代 中肉質不發(fā)生分離。因此，推測親本慢溶質桃基因型春雪為雜合，春瑞為純合。春雪自交群體慢溶質 桃∶非慢溶質桃分離數(shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗符合3∶1 孟德 爾理論分離比例，春雪×99-30-33 群體慢溶質桃∶非 慢溶質桃分離數(shù)據(jù)符合1∶1 的分離比例（表2），說 明慢溶質桃性狀的分離比例與顯性單基因或主效 基因調控性狀的分離比例一致。

2.3 慢溶質性狀初步定位

以春雪為親本自交構建的遺傳分離群體為試 材，根據(jù)分離單株肉質表型的鑒定結果，選取極端非 慢溶質單株和極端慢溶質單株各20 株，構建非慢溶 質、慢溶質基因池，進行BSA定位分析。為了鑒定慢 溶質桃調控位點，對兩個混池進行高通量特異性片段測序，非慢溶質池和慢溶質池的測序深度分別為 33 倍和37 倍。在混池之間共獲得79 304 個SNP 和 21 715 個InDel，采用歐氏距離法（Euclidean Distance， ED算法）定位分析方法，將該性狀的調控位點 關聯(lián)到了第4號染色體（圖4）。關聯(lián)分析共得到4個 與慢溶質桃性狀相關的候選區(qū)域，總長度為7.87 Mb （表3）。

3 討論

桃是典型的呼吸躍變型果實，在成熟后期出現(xiàn) 很高的呼吸高峰，果實迅速軟化[14]。筆者對慢溶質 桃品種春麗、春瑞成熟軟化的生理特點進行分析，留 樹時間長達12 d 以上，在成熟前期保持較高的硬度， 這與前人[7]對慢溶質桃雜交單株S11-8 的生理特征觀察結果一致。慢溶質桃與MF相比，前者果實乙 烯釋放延遲發(fā)生，果實軟化相應延遲，這可能是慢溶 質桃硬熟期長的原因。除此之外，對慢溶質桃遺傳 傾向的分析也與前期春雪×春美雜交后代的研究結 果一致[15]。此外，Chen等[7]通過對春雪和紅不軟的F1 群體分析，發(fā)現(xiàn)后代慢溶質桃∶非慢溶質桃接近1∶1， 推測春雪慢溶質桃位點也為雜合，可能受顯性單基 因控制。

慢溶質性狀的基因定位研究相對匱乏，并且沒 有獲得準確的定位區(qū)間。Serra 等[8]以慢溶質型桃品 種Big Top 為父本，兩種溶質型（Armking 和Nectaross） 分別為母本，構建雜交群體，通過高密度SNP芯 片構建遺傳圖譜，定位了與慢溶質桃性狀相關聯(lián)的 3 個區(qū)段，分別位于第4、5、6 三條染色體上。Ciacciulli 等[9]通過建立力學模型，對慢溶質型BRebus028 和MF型BMax10 雜交后代進行表型評價，進行連鎖 作圖，將慢溶質桃定位到第8 號染色體上的一個 QTL（qSwS8.1），并利用全基因組關聯(lián)分析（genomewide association study，GWAS）進行了驗證。Chen 等[7]通過BSA-seq 鑒定到了第4 號染色體兩個QTL， 并結合轉錄組分析，在5.6 Mb定位區(qū)間內鑒定到了 29 個可能的慢溶質基因。筆者在本試驗中通過對 春雪自交后代的連續(xù)調查，結合遺傳定位分析將慢 溶質桃定位在了桃第4 號染色體上，與Serra 等[8]和 Chen 等[7]的定位結果一致，且有一定的重疊，未來需 要進一步研究縮小慢溶質桃定位區(qū)間，挖掘慢溶質 桃性狀的候選基因。

此外，桃果實成熟期也可能對肉質有影響，在對 春雪分離群體的調查發(fā)現(xiàn)，親本春雪含有極早熟的 基因，5 月底之前成熟的極早熟單株中沒有發(fā)現(xiàn)慢 溶質桃，之后全部為慢溶質桃。由于控制成熟期的 遺傳位點被定位在第4 號染色體[15-17]，與慢溶質桃在 同一連鎖群上，后代極早熟單株中沒有慢溶質型，可 能是慢溶質桃與熟期性狀存在不完全連鎖。筆者在 本試驗中進行BSA 定位的兩個混池之間除了肉質 的顯著差別外，也無法規(guī)避熟期的差異，熟期會影響 對肉質的判定。因此，定位結果中包括了與熟期相 關的基因，這也為慢溶質候選基因的篩選增加了一 定難度。后續(xù)筆者將利用基因組重測序數(shù)據(jù)，在定 位區(qū)間開發(fā)更多標記，通過更多群體進行驗證，更精 細地對慢溶質性狀進行定位，為慢溶質分子標記輔 助育種提供幫助。

4 結論

通過對慢溶質和非慢溶質桃成熟軟化的生理差 異進行比較，發(fā)現(xiàn)慢溶質桃春麗、春瑞成熟期留樹時 間長達12 d，是非慢溶質桃春美、春蜜的2 倍左右， 乙烯延遲釋放，果實最終變軟。遺傳傾向分析表明， 慢溶質性狀為顯性單基因或主效基因控制遺傳，且 調控基因定位在第4號染色體上。

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