于雷，王光裕，裴德寧，安怡方，史新昌，周勇

中國(guó)食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

近年來，隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基于報(bào)告基因的生物活性分析方法越來越廣泛地應(yīng)用于重組蛋白類藥物的質(zhì)量控制［1-5］?！吨袊?guó)藥典》三部（2020版）已收錄了2個(gè)品種的報(bào)告基因測(cè)活方法：Ⅰ型干擾素和康柏西普［6］。藥物反應(yīng)性的報(bào)告基因細(xì)胞系是此類方法的基礎(chǔ)，細(xì)胞系的穩(wěn)定性是方法穩(wěn)定性的前提。因此，對(duì)于報(bào)告基因測(cè)活方法，報(bào)告基因細(xì)胞系的穩(wěn)定性至關(guān)重要?？赏ㄟ^監(jiān)測(cè)細(xì)胞傳代過程中報(bào)告基因拷貝數(shù)變化來考察細(xì)胞的穩(wěn)定性。目前檢測(cè)基因拷貝數(shù)的常用方法是qPCR，但該法為相對(duì)定量，需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［7-10］。而對(duì)于常用的報(bào)告基因，目前尚無拷貝數(shù)測(cè)定使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是一種對(duì)目標(biāo)核酸分子進(jìn)行直接計(jì)數(shù)、絕對(duì)定量的新興技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，具有無需標(biāo)準(zhǔn)品、絕對(duì)定量、高靈敏度、準(zhǔn)確度和耐受性等優(yōu)勢(shì)［11-16］。dPCR 檢測(cè)結(jié)果通常表示為每拷貝基因組所含目的基因的拷貝數(shù)，其準(zhǔn)確性受限于基因組DNA 定量的準(zhǔn)確性［17-18］。在樣本制備過程中，首先需提取基因組DNA，再對(duì)其進(jìn)行定量，可能會(huì)受基因組DNA 提取效率和定量準(zhǔn)確度的影響，造成實(shí)驗(yàn)間誤差較大。為了解決該問題，本研究利用相對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，選取高度保守的管家基因RPP30作為內(nèi)參基因［19-20］，以目的基因?qū)?nèi)參基因的相對(duì)拷貝數(shù)變化來評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性，相對(duì)拷貝數(shù)的結(jié)果不受基因組DNA 提取效率和定量準(zhǔn)確度的影響，檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定。本研究針對(duì)目前廣泛應(yīng)用的Luc2P系列報(bào)告基因細(xì)胞系，以RPP30為內(nèi)參基因，螢光素酶（luciferase，Luc）為目的基因，建立雙重dPCR 方法同時(shí)檢測(cè)2 種基因的拷貝數(shù)，再利用Luc的相對(duì)拷貝數(shù)（copiesLuc／copyRPP30）評(píng)價(jià)報(bào)告基因細(xì)胞系的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及質(zhì)粒 4 種原始細(xì)胞（CHO-K1、Hacat、HEK293 和UT7）購自ATCC；Luc2P報(bào)告基因質(zhì)粒及4種Luc2P報(bào)告基因細(xì)胞系（CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院重組藥物室構(gòu)建并保存。

1.2主要試劑及儀器 Taqman universal Master MixⅡ、Applied Biosystems?QuantStudio?3D數(shù)字PCR20K芯片試劑盒v2、QuantStudio?3D 數(shù)字PCR Mix、熒光定量PCR 儀（7500Fast）、芯片式數(shù)字PCR 儀（QuantStudio?3D Digital PCR System）購自美國(guó)ABI公司；ddPCRSupermixforProbes、DropletGenerationOilforProbes、DG8 Cartridges and Gaskets、基因擴(kuò)增儀（C1000 Touch）、液滴式數(shù)字PCR 儀（QX200 ddPCR System）購自美國(guó)Bio-Rad公司；基因組DNA提取試劑盒購自德國(guó)QIAGEN公司；Hind Ⅲ和EcoRⅠ內(nèi)切酶購自日本TaKaRa公司。本研究除適用性研究外，其他試驗(yàn)均采用芯片式數(shù)字PCR儀。

1.3引物和探針的設(shè)計(jì)及合成 采用Primer-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)引物和探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Luc基因全長(zhǎng)1 776 bp，針對(duì)212 ～331 bp 區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物序列為：5'-GGCTGAATACAAACCATC-3'，下游引物序列為：5'-CGTTGTAGATGTCGTTAG-3'，探針序列為：5'-（FAM）CACAGCCACACCGATGAACAG（MGB）-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為120 bp。RPP30內(nèi)參基因（GRCh38.p13 Primary Assembly）上游引物序列為：5'-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3'，下游引物序列為：5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'，探針序列為：5'-（VIC）TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG（MGB）-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為65 bp。

1.4模板制備 收集Luc2P系列報(bào)告基因細(xì)胞CHO-K1、Hacat、HEK293 和UT7，按照試劑盒說明書提取基因組DNA，并采用紫外法定量。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ分別進(jìn)行單酶切和雙酶切，酶切產(chǎn)物作為PCR模板。

1.5雙重dPCR 反應(yīng)體系共20μL，含2×dPCR Mix 10μL，10μmol／LLuc和RPP30上下游引物各1.8μL、探針各0.5μL，基因組DNA（100μg／mL）模板1.8μL?；靹蚝笕?4.5μL 進(jìn)行芯片dPCR 檢測(cè)。反應(yīng)程序：96 ℃10 min；60 ℃1 min，98 ℃30 s，共39 個(gè)循環(huán)；60 ℃2 min。

1.6方法的驗(yàn)證

參考《中國(guó)藥典》三部（2020 版）相關(guān)要求，對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6.1專屬性 PCR的專屬性主要是考查引物探針的特異性，使用Luc引物探針，分別采用qPCR 和dPCR法檢測(cè)4 種Luc2P報(bào)告基因細(xì)胞系及其原始細(xì)胞（CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7）基因組DNA，將qPCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6.2精密性 對(duì)同一基因組DNA 樣品（HEK293_1B1），采用芯片式dPCR 法重復(fù)檢測(cè)8 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），驗(yàn)證該方法的試驗(yàn)內(nèi)精密性；對(duì)同一細(xì)胞（HEK293_1B1），采用芯片式dPCR 法檢測(cè)6次獨(dú)立提取的基因組DNA 樣品，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），驗(yàn)證該方法的試驗(yàn)間精密性。

1.6.3線性 取基因組DNA酶切產(chǎn)物（HEK293-1B1），用Q水稀釋至100、80、60、40、20、10μg／mL，采用dPCR法檢測(cè)Luc和RPP30拷貝數(shù)，評(píng)價(jià)實(shí)測(cè)拷貝數(shù)與模板濃度間的線性關(guān)系。

1.6.4準(zhǔn)確性 將Luc2P報(bào)告基因質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ酶切后（5μg／mL），稀釋至0.000 1μg／mL，再與Q水等比混合，采用dPCR定量其Luc拷貝數(shù)為792 copies／μL。將此質(zhì)粒溶液分別稀釋至0.000 15（150%）、0.000 125（125%）、0.0001（100%）、0.00075（75%）、0.000050μg／mL（50%），分別與野生型UT7細(xì)胞基因組DNA（50μg／mL）等比混合后進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算Luc拷貝數(shù)的回收率，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1.6.5耐用性 分別采用芯片式和液滴式兩種dPCR體系（兩種體系的原理、設(shè)備、耗材和試劑均不相同）對(duì)同一HEK293-Luc細(xì)胞基因組樣品檢測(cè)6 ～8次，比較檢測(cè)結(jié)果之間的一致性。

1.7方法的適用性分析

1.7.1不同細(xì)胞克隆的Luc拷貝數(shù)檢測(cè) 利用建立的雙重dPCR 法，檢測(cè)同一報(bào)告基因細(xì)胞的不同細(xì)胞克隆，即在多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞克隆化分離中獲得的不同克隆，理論上這些細(xì)胞克隆中的外源基因拷貝數(shù)不同。

1.7.2不同細(xì)胞代次的Luc拷貝數(shù)檢測(cè) 利用建立的雙重dPCR 法，檢測(cè)同一報(bào)告基因細(xì)胞的不同代次（P8、P12、P31），評(píng)價(jià)報(bào)告基因細(xì)胞系的穩(wěn)定性。

1.8數(shù)據(jù)采集及分析 采用QuantStudio 3D AnalysisSuiteTM云軟件（version 3.1.6-PRC-build2）分析芯片式dPCR結(jié)果，QuantaSoftTM軟件（v1.2）分析液滴式dPCR結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1dPCR方法的建立

2.1.1dPCR分別檢測(cè)Luc和RPP30HEK293-Luc基因組DNA 分別用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切，采用芯片式dPCR 分別檢測(cè)Luc和RPP30，酶切后的樣品檢測(cè)結(jié)果陰性和陽性分離效果更好，見圖1。

圖1 基因組DNA酶切前后的dPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 dPCR results for genomic DNA with or without digestion

2.1.2雙重dPCR同時(shí)檢測(cè)Luc和RPP30經(jīng)雙重芯片式dPCR同時(shí)檢測(cè)Luc和RPP30，HindⅢ單酶切效果最佳，見圖2。確定基因組DNA模板制備條件為：HindⅢ酶切1h。

圖2 基因組DNA酶切前后的雙重dPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Duplex dPCR results for genomic DNA with or without digestion

2.2方法的驗(yàn)證

2.2.1專屬性 qPCR 和dPCR 檢測(cè)結(jié)果見圖3 和圖4。未轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的原始細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均為陰性，而4 種報(bào)告基因細(xì)胞系中均可檢測(cè)到陽性結(jié)果，且dPCR 結(jié)果中陰性和陽性區(qū)可明顯區(qū)分，表明所設(shè)計(jì)的引物探針特異性好。qPCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與理論序列一致。

圖3 qPCR檢測(cè)4種不同報(bào)告基因細(xì)胞系的Luc基因Fig.3 Analysis of Luc gene in 4 different reporter cell lines by qPCR

圖4 芯片式dPCR檢測(cè)4種不同報(bào)告基因細(xì)胞系的Luc基因Fig.4 Analysis of Luc gene in 4 different reporter cell lines by chip-type dPCR

2.2.2精密性 采用芯片式dPCR 法重復(fù)檢測(cè)8次同一基因組DNA 樣品Luc、RPP30拷貝數(shù)及Luc相對(duì)拷貝數(shù)（copiesLuc／copyRPP30）的RSD分別為6.09%、6.90%和3.25%，見表1。采用芯片式dPCR法檢測(cè)同一細(xì)胞6 次獨(dú)立提取的基因組DNA 樣品Luc、RPP30拷貝數(shù)及Luc相對(duì)拷貝數(shù)（copiesLuc／copyRPP30）的RSD分別為24.53%、16.38%和8.62%，見表2。表明采用相對(duì)拷貝數(shù)（copiesLuc／copyRPP30）進(jìn)行定量，結(jié)果更穩(wěn)定。

表1 雙重dPCR法的試驗(yàn)內(nèi)精密性檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Intra-assay precision of duplex dPCR

表2 雙重dPCR法的試驗(yàn)間精密性檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Inter-assay precision of duplex dPCR

2.2.3線性 兩個(gè)基因檢測(cè)結(jié)果的線性均較好，線性擬合R2均大于0.99，見圖5。以相對(duì)拷貝數(shù)（copiesLuc／copyRPP30）表示，6個(gè)樣品的結(jié)果分別為35.0、32.1、30.0、32.3、30.9和32.2，均值為32.1，RSD為5.3%。

圖5 Luc和RPP30基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果與模板濃度的線性擬合Fig.5 Linear fitting of Luc and RPP30 gene copy to template concentration

2.2.4準(zhǔn)確性 5組加標(biāo)回收樣本的Luc拷貝數(shù)分別為1 053.7、942.46、613.67、476.27和220.1 copies／μL，回收率分別為88.7%、95.2%、77.5%、80.2%和55.6%。一般qPCR 定量的回收率要求為50% ～150%，本方法的回收率在可接受范圍內(nèi)。基因的引入，可以校正基因組DNA 提取和定量帶來的誤差，使檢測(cè)結(jié)果更加可靠。

2.2.5耐用性 芯片式和液滴式兩種體系測(cè)得的Luc和RPP30拷貝數(shù)有差異，但Luc相對(duì)拷貝數(shù)（copiesLuc／copyRPP30）的結(jié)果一致，均為0.32，見表3。體現(xiàn)了采用相對(duì)拷貝數(shù)作為檢測(cè)指標(biāo)的優(yōu)勢(shì)。

表3 兩種不同體系dPCR檢測(cè)結(jié)果比較Tab.3 Comparison between results of two different dPCR systems

2.3方法的適用性

2.3.1不同細(xì)胞克隆的Luc拷貝數(shù) UT7-Luc細(xì)胞C1克隆的Luc相對(duì)拷貝數(shù)最高，C2克隆的Luc相對(duì)拷貝數(shù)最低；HEK293-Luc細(xì)胞2 個(gè)不同克隆的Luc相對(duì)拷貝數(shù)也不一致。見表4。表明該方法可區(qū)分不同細(xì)胞克隆的Luc相對(duì)拷貝數(shù)。

表4 不同細(xì)胞克隆的Luc拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Luc gene copies in different cell clones

2.3.2不同細(xì)胞代次的Luc拷貝數(shù) 3 個(gè)代次細(xì)胞Luc和RPP30拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果間差異較大，但Luc相對(duì)拷貝數(shù)的結(jié)果高度一致，見表5。進(jìn)一步表明內(nèi)參

表5 不同細(xì)胞代次的Luc拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Luc gene copies in cells of different passages

3 討論

對(duì)于細(xì)胞基因組中特定基因（包括內(nèi)源和外源基因）的拷貝數(shù)測(cè)定是個(gè)困擾多年的難題［8］。qPCR作為一種相對(duì)定量方法，需要花費(fèi)大量精力制備標(biāo)準(zhǔn)品，而且非同質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品如質(zhì)粒等，還存在擴(kuò)增效率不一致等問題［8，21］。dPCR 的出現(xiàn)解決了核酸絕對(duì)定量的難題［11］，但DNA 提取、定量，以及試驗(yàn)過程中帶來的誤差仍使檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定、變異度大，無法檢測(cè)出拷貝數(shù)的細(xì)微差異。而且，不同dPCR 體系之間也會(huì)存在差異［22］。本研究通過引入相對(duì)拷貝數(shù)的概念，校正了樣本制備及試驗(yàn)過程中帶來的誤差，可以更加真實(shí)地反映報(bào)告基因細(xì)胞系中目的基因拷貝數(shù)的變化，適用于評(píng)價(jià)基因修飾細(xì)胞系的穩(wěn)定性。一般PCR 體系的模板量?jī)H有數(shù)微升，加樣的細(xì)微差異引起的模板量不同也會(huì)使結(jié)果發(fā)生較大變異，而內(nèi)參基因的引入具有校準(zhǔn)模板量的作用，采用雙重dPCR 在同一體系中同時(shí)檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因，可避免不同PCR 體系加入模板量的不同造成的試驗(yàn)偏差［17］。本研究結(jié)果證明，同一組樣本的相對(duì)拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果比絕對(duì)拷貝數(shù)更加穩(wěn)定，相對(duì)拷貝數(shù)的指標(biāo)更能準(zhǔn)確反映目的基因在細(xì)胞基因組中的拷貝數(shù)變化情況，甚至在不同dPCR 體系也表現(xiàn)出較好的一致性。此外，該方法可有效檢測(cè)不同細(xì)胞克隆的外源基因相對(duì)拷貝數(shù)差異。

本研究不僅為L(zhǎng)uc2P系列報(bào)告基因細(xì)胞系建立了穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法，也提供了一種目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)的策略，如目前CAR基因拷貝數(shù)是CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的關(guān)鍵檢測(cè)項(xiàng)目［23-25］，采用本研究提供的思路可更加準(zhǔn)確地反映目標(biāo)基因修飾率。