馬金昭，許文靜,2，邵鵬帥，趙盈涵，董凱凱，張冬杰，楊紅軍，孫景寬

(1.濱州學(xué)院，山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256603；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，泰山森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，山東 泰安 271018)

黃河三角洲是由黃河攜帶的大量泥沙在入?？谔幉粩喽逊e形成的緩沖帶，是中國(guó)暖溫帶最完整的濕地生態(tài)系統(tǒng)，兼具河、海、陸等生態(tài)系統(tǒng)特性[1]。然而在其長(zhǎng)期的成陸過程中，因復(fù)雜的人為和自然因素影響導(dǎo)致土壤鹽漬化加重，嚴(yán)重抑制了植物根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收[2]，改變植物細(xì)胞膜功能，影響細(xì)胞中多種酶的活性和蛋白質(zhì)構(gòu)型，造成離子毒害，最終造成濱海濕地植被退化，生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞[3-4]。近年來，由于化肥的大量施用、生活和生產(chǎn)污水排放以及水土流失等人類活動(dòng)的影響，黃河口的營(yíng)養(yǎng)鹽入海通量始終保持在較高水平且有波動(dòng)增加的趨勢(shì)，這不僅影響到河口近岸水體的營(yíng)養(yǎng)水平，還將對(duì)潮灘土壤的營(yíng)養(yǎng)狀況產(chǎn)生重要影響[5-6]。

氮和磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝的主要營(yíng)養(yǎng)元素，影響著生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能[7-8]。氮作為植物生命活動(dòng)必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，是蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素和次生代謝產(chǎn)物的重要組分，是植物光合作用的關(guān)鍵性限制因子[9-10]。磷是參與植物生長(zhǎng)、繁殖及細(xì)胞間能量傳遞的重要元素，影響著核酸代謝以及葉綠素等光合蛋白的合成[11-13]。鹽脅迫下，氮素可有效減少植物對(duì)Na+和Cl-的吸收與積累，提高地上部分K+含量[14]。研究發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)为?dú)添加氮和磷時(shí)，達(dá)烏里胡枝子葉片的凈光合速率、水分利用效率和氣孔限制值均顯著增加[9]；同時(shí)添加氮磷可有效增加車桑子葉片的葉綠素含量，進(jìn)而增加其凈光合速率和PSⅡ活性[12]；鹽脅迫下，適量氮素可優(yōu)化芥菜中乙烯的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)脯氨酸含量，促進(jìn)其光合作用和生長(zhǎng)發(fā)育[15]。氮和磷是河口濕地的重要限制性養(yǎng)分元素，其在生態(tài)系統(tǒng)中的養(yǎng)分供應(yīng)狀況直接影響著植物的形態(tài)特征與生理性狀[16-17]，且氮磷之間存在著復(fù)雜的耦合關(guān)系[18]，這對(duì)于緩解植物在生存環(huán)境中的養(yǎng)分限制與鹽分脅迫尤為關(guān)鍵[7,19]。

黃河三角洲的天然植被組成簡(jiǎn)單，多以耐鹽植物為主，其中鹽地堿蓬(Suaeda salsa)具有極強(qiáng)的耐鹽性，作為高鹽土壤生長(zhǎng)的先鋒植物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的正常演替和生物多樣性具有重要作用[20-21]。目前關(guān)于鹽地堿蓬的研究多集中于其在鹽堿脅迫下的種子萌發(fā)[22]、生態(tài)化學(xué)計(jì)量[23]以及生理生態(tài)與基因表達(dá)[24-26]等方面，關(guān)于其在氮磷添加下的光合特性和抗氧化系統(tǒng)研究較少，氮磷營(yíng)養(yǎng)對(duì)鹽地堿蓬生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)制尚不清晰。因此，本研究以鹽地堿蓬為對(duì)象，通過分析其在不同氮磷添加量下的光合生理參數(shù)與抗氧化酶活性變化，明確鹽地堿蓬光合生理和抗逆系統(tǒng)對(duì)氮磷添加的響應(yīng)特征，以期為黃河三角洲的植被恢復(fù)和生態(tài)改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于山東省東營(yíng)市河口區(qū)仙河鎮(zhèn)黃河三角洲區(qū)域(N38°1′18″，E118°44′2″)，該區(qū)域?qū)儆谂瘻貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，年均溫度12.5 ℃，年均蒸發(fā)量1 900 mm，年均降水量660 mm，降水多集中于6—8 月。土壤類型為濱海鹽土，其基本理化性狀為：pH 7.83，電導(dǎo)率5.38 ms/cm，有機(jī)質(zhì)含量16.2 g/kg，全氮含量0.32 g/kg，全磷含量0.64 g/kg，全鉀含量11.2 g/kg，全鹽含量7.82 g/kg。主要植被為蘆葦和鹽地堿蓬等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021 年5—10 月進(jìn)行。選取地勢(shì)相對(duì)一致、地上植被分布均勻的鹽地堿蓬群落作為樣地，以分析純尿素(含N 46%)為氮源、磷酸二氫鉀(含P2O552%)為磷源[13]，采用裂區(qū)設(shè)計(jì)，主區(qū)為4 個(gè)氮處理(N0、N5、N15和N45分別為0、5、15 和45 g/m2)，副區(qū)為2 個(gè)磷處理(P0和P1分別為0 和1 g/m2)，共設(shè)置8 個(gè)處理：N0P0、N5P0、N15P0、N45P0、N0P1、N5P1、N15P1和N45P1。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，共計(jì)24 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)樣地面積為2 m × 2 m，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。為避免交叉影響，小區(qū)間設(shè)置寬2 m 的緩沖帶，并采用圍欄隔斷防止被破壞。于2021 年5—8 月中上旬，按照各處理小區(qū)所需氮磷量分別將氮磷源溶于4 L 去離子水后均勻噴施于樣地表面，對(duì)照(N0P0)處理噴灑等量的去離子水，每次噴施間隔約1 個(gè)月，共噴施4 次。各小區(qū)的常規(guī)管理措施保持一致。

1.3 樣品采集與測(cè)定

于2021 年8 月中下旬鹽地堿蓬的生長(zhǎng)旺盛期對(duì)每個(gè)樣方進(jìn)行樣品采集與數(shù)據(jù)測(cè)定。在每個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)選取5 株鹽地堿蓬，采用鋼卷尺測(cè)定株高；采用游標(biāo)卡尺在植株根莖處測(cè)定莖粗；采用便攜式葉面積儀(YMJ-B，杭州碩聯(lián))測(cè)定葉面積；將植株完整取樣，去除泥土后測(cè)定其鮮質(zhì)量；帶回實(shí)驗(yàn)室放入烘箱105 ℃殺青30 min，以60 ℃烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定其干質(zhì)量。

鹽地堿蓬中上部健康、成熟功能葉片的光合參數(shù)(凈光合速率Pn、氣孔導(dǎo)度Gs、胞間CO2濃度Ci、蒸騰速率Tr和實(shí)際大氣CO2濃度比值Ca)采用便攜式光合儀Li-6400XT (LI-Cor，Lincoil，NE，USA)在設(shè)定光照強(qiáng)度1 000 μmol/(m2·s)、葉室內(nèi)溫度25 ℃下測(cè)定，并計(jì)算氣孔限制值(Ls)和水分利用效率(WUE)，計(jì)算公式為：Ls=1-Ci/Ca；WUE=Pn/Tr[8,11]。

采集各小區(qū)鹽地堿蓬相同部位的健康功能葉片帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鮮樣測(cè)定。采用95%乙醇和80%丙酮的混合液(體積比為1∶1)浸提24 h，運(yùn)用分光光度法分別在663、646 和470 nm 處測(cè)定葉片葉綠素含量[27]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑NBT 法測(cè)定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫法測(cè)定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用蒽酮比色法測(cè)定[27]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 處理；采用SAS 8.2 軟件進(jìn)行雙因素差異顯著性分析和ANOVA方差分析；采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析；采用R 語言4.1.0 軟件進(jìn)行主成分分析；采用Sigmaplot 12.0 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)鹽地堿蓬植株生長(zhǎng)特征的影響

由圖1 可知：不同氮磷處理對(duì)鹽地堿蓬單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響顯著，且氮磷添加具有顯著的交互作用。N45P1處理下鹽地堿蓬的單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均最高，較其他處理分別顯著增加47.2%～645.6%和97.9%～543.9%；當(dāng)?shù)砑恿繛?～15 g/m2時(shí)，是否添加磷對(duì)鹽地堿蓬的單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均無顯著影響。此外，N45P0處理的鮮質(zhì)量較N15P0、N5P0和N0P0處理分別顯著增加62.0%、251.1%和406.6%。

圖1 不同處理下鹽地堿蓬的單株鮮質(zhì)量與干質(zhì)量Fig.1 Fresh and dry weight of per plant of Suaeda salsa under different treatments

由圖2 可知：不同氮磷處理對(duì)鹽地堿蓬的株高、莖粗和葉面積有顯著影響，且氮磷交互作用對(duì)株高有顯著影響。N45P1處理的株高分別較N45P0、N0P1、N5P1和 N15P1處理顯著增加30.3%、277.2%、77.5%和57.5%；當(dāng)?shù)砑恿繛?5～45 g/m2時(shí)，與P0處理相比，P1處理可顯著增加鹽地堿蓬的株高。當(dāng)添加磷時(shí)，N15和N45處理的莖粗較N0和N5處理顯著增加，N45處理的葉面積較N0、N5和N15顯著增加25.5%～116.1%。在相同氮添加量下，是否添加磷對(duì)鹽地堿蓬的莖粗和葉面積均無顯著影響。

圖2 不同處理下鹽地堿蓬的株高、莖粗和葉面積Fig.2 Plant height,stem diameter,and leaf area of S.salsa under different treatments

2.2 不同處理對(duì)鹽地堿蓬葉片光合色素含量的影響

由表1 可知：不同氮磷處理對(duì)葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量有極顯著影響，且對(duì)葉綠素a 和葉綠素b 含量存在顯著的交互作用。與N15、N5和N0處理相比，未添加磷時(shí)，N45處理的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量分別顯著增加103.7%～233.7%、130.6%～274.1%和86.6%～204.6%；磷添加量為1 g/m2時(shí)，N45處理的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量分別顯著增加84.0%～408.4%、99.0%～499.6%和71.9%～269.9%。氮添加量為0～15 g/m2時(shí)，是否添加磷對(duì)葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量均無顯著影響；氮添加量為45 g/m2時(shí)，添加磷可顯著增加葉片的葉綠素a 和類胡蘿卜素含量。

表1 不同處理下鹽地堿蓬葉片的光合色素含量Tab.1 Photosynthetic pigment content of Suaeda salsa leaves under different treatments mg/g

2.3 不同處理對(duì)鹽地堿蓬葉片光合特性的影響

由圖3 可知：不同氮處理對(duì)鹽地堿蓬葉片的凈光合速率(Pn)有極顯著影響，且未與磷處理有顯著的交互作用。N45P0處理的Pn較N0P0、N5P0和N15P0處理顯著增加20.9%～168.4%；N45P1處理的Pn較 N0P1和 N5P1處理顯著增加58.2%～168.4%；當(dāng)?shù)砑恿繛?～45 g/m2時(shí)，是否添加磷對(duì)Pn無顯著影響。

圖3 不同處理下鹽地堿蓬葉片的光合特性Fig.3 Photosynthetic characteristics of S.salsa leaves under different treatments

由圖3 還可知：不同氮處理對(duì)鹽地堿蓬葉片的氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和氣孔限制值(Ls)有極顯著影響，不同磷處理對(duì)Ci和Ls的影響極顯著，且氮磷添加對(duì)Gs、Ci和Ls存在顯著的交互作用。未添加磷時(shí)，N15處理的Gs較其他氮處理顯著增加16.5%～81.3%；添加磷時(shí)，N5處理的Gs較其他氮處理顯著增加38.8%～46.8%。N45P0處理的Ci較N0P0、N5P0和N15P0處理分別顯著降低29.2%、30.1% 和 22.5%，N15P1和N45P1處理的Ci也顯著低于N0P1和N5P1處理。未添加磷時(shí)，N45處理的Ls較其他氮處理顯著增加37.5%～66.3%；添加磷時(shí)，N15和N45處理的Ls無顯著差異。

圖3 顯示：不同磷處理對(duì)葉片水分利用效率(WUE)的影響顯著，不同氮處理及與磷的交互作用對(duì)鹽地堿蓬葉片的蒸騰速率(Tr)和WUE 的影響顯著。當(dāng)?shù)砑恿繛?～5 g/m2時(shí)，磷添加較未添加處理的Tr顯著增加20.9%～44.3%；當(dāng)?shù)砑恿繛?5 g/m2時(shí)，是否添加磷對(duì)Tr無顯著影響。當(dāng)未添加磷時(shí)，N45處理的WUE 較其他氮處理顯著增加37.5%～66.3%；當(dāng)添加磷時(shí)，N15與N45處理的WUE 無顯著差異；除氮添加量為15 g/m2外，其他氮添加量下P0與P1處理的WUE 均無顯著差異。

2.4 不同處理對(duì)鹽地堿蓬葉片抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化的影響

由表2 可知：不同氮處理對(duì)鹽地堿蓬葉片的SOD、POD 和CAT 活性有極顯著影響，且氮磷交互作用對(duì)葉片SOD 和POD 活性有顯著影響。當(dāng)?shù)砑恿繛? 和15 g/m2時(shí)，磷添加處理的葉片SOD 活性較未添加磷分別顯著增加59.0%和20.6%；當(dāng)?shù)砑恿繛?、5 和45 g/m2時(shí)，磷添加處理的POD 活性較未添加磷分別顯著增加117.6%、67.3%和20.6%；當(dāng)?shù)砑恿繛?～45 g/m2時(shí)，是否添加磷對(duì)CAT 活性無顯著影響。與N0P1、N5P1和N15P1處理相比，N45P1處理的 SOD、POD 和CAT 活性分別顯著增加15.7～149.6%、98.5%～260.2%和96.4%～294.4%。

表2 不同處理下葉片抗氧化酶活性以及丙二醛和可溶性蛋白含量Tab.2 Antioxidant enzyme activity,MDA,and soluble protein content of leaves under different treatments

由表2 還可知：不同氮處理對(duì)MDA 和可溶性蛋白含量有極顯著影響。N45P1處理的MDA含量分別較 N0P1和 N5P1顯著降低 56.2% 和 32.2%，但與N15P1和N45P0處理無顯著差異；當(dāng)?shù)砑恿繛?～45 g/m2時(shí)，是否添加磷對(duì)MDA 含量無顯著影響。N45P1處理的可溶性蛋白含量最高，較N0P1、N5P1和N15P1分別顯著增加111.0%、21.6%和41.4%，較N45P0處理顯著增加43.1%；當(dāng)?shù)砑恿繛?～15 g/m2，是否添加磷對(duì)可溶性蛋白含量無顯著影響。

2.5 鹽地堿蓬光合特性與抗氧化系統(tǒng)的關(guān)系

由表3 可知：鹽地堿蓬的鮮質(zhì)量和株高以及葉片的氣孔限制值和水分利用效率與抗氧化系統(tǒng)呈極顯著的相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。鹽地堿蓬葉片的葉綠素含量和凈光合速率與抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性和可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)、與MDA 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)；氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率僅與MDA 含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05 或P＜0.01)；胞間CO2濃度與抗氧化酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)、與MDA 含量呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)、與可溶性蛋白含量顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

表3 鹽地堿蓬生長(zhǎng)特性、光合特性與抗氧化酶的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis among growth,photosynthetic characteristics and antioxidant of S.salsa

主成分分析發(fā)現(xiàn)前兩個(gè)主成分解釋了數(shù)據(jù)變異性的85.33%，能夠較好地反映這12 個(gè)指標(biāo)的表達(dá)信息。從主因子載荷向量(圖4)中發(fā)現(xiàn)：第1 主成分解釋了64.12%，主要包括以葉綠素含量、凈光合速率、氣孔限制值以及SOD 和POD活性為代表的因子；第2 主成分解釋了21.21%，其中起作用的正向負(fù)載因子主要為氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率。延第1 主成分方向，N45P0、N45P1、N15P0和N15P1處理的光合特性及抗氧化系統(tǒng)與N0P0、N0P1組有明顯分離；延第2 主成分方向N5P0、N5P1和與N0P0、N0P1組有明顯分離。

圖4 鹽地堿蓬葉片光合特性與抗氧化系統(tǒng)的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of photosynthetic characteristics and antioxidant system of S.salsa leaves

3 討論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育與光合作用密切相關(guān)，光合作用是植物獲取光能、合成有機(jī)物質(zhì)、提高養(yǎng)分含量和促進(jìn)器官發(fā)育的關(guān)鍵生物過程[28-29]。葉片凈光合速率作為反映植物光合作用的直接指標(biāo)，在本研究中隨著氮素添加量的增加而顯著提高，這與王雪梅等[12]的研究相似；然而在本研究中，添加磷素并未顯著影響凈光合速率。植物葉片的光合色素含量也是植物光合作用的關(guān)鍵因素，密切反映了植物的光合能力[29-30]。在本研究中，氮添加顯著提高了葉片的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量，且隨著氮素添加量的增加而提高，磷也可顯著提高植物的光合色素含量，且與氮素的交互作用可顯著影響葉綠素a 和葉綠素b 的含量。鹽地堿蓬葉片光合作用顯著提高的主要原因是氮素的添加提高了葉片Rubisco 酶及其他參與光合作用的酶活性，促進(jìn)了葉綠素合成[12,31]，并且與添加的磷素發(fā)生耦合作用，共同促進(jìn)了鹽地堿蓬的光合作用。

氮磷營(yíng)養(yǎng)的合理添加在影響光合作用的同時(shí)還能調(diào)節(jié)植物葉片的蒸騰速率，進(jìn)而影響水分利用效率[9]。生長(zhǎng)在鹽漬化區(qū)域的植物通常具有細(xì)胞小、細(xì)胞壁厚和氣孔導(dǎo)度小等特點(diǎn)，以減少水分流失，增施氮肥可以有效增大細(xì)胞尺寸，使細(xì)胞壁變薄，進(jìn)而提高氣孔導(dǎo)度[32]，通過增加細(xì)胞間隙的CO2供應(yīng)來提高作物的光合能力。在本研究中，氮添加顯著影響葉片的氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度，且與磷添加具有顯著的交互作用。5 g/m2氮添加量處理的蒸騰速率顯著高于其他氮處理，而磷添加對(duì)其有顯著影響。45 g/m2氮添加量處理的水分利用效率顯著高于0 和5 g/m2處理，并與磷添加產(chǎn)生了顯著的交互作用，促進(jìn)了水分利用效率的提高，表明氮磷添加可以有效提高植物的水分吸收與利用能力，有助于其更好地適應(yīng)不利環(huán)境；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：鹽地堿蓬的光合特性與抗氧化系統(tǒng)存在顯著的相關(guān)關(guān)系，葉片光合速率和葉綠素含量的提高可有效增加抗氧化酶活性，降低MDA 含量。

植物受到鹽分脅迫時(shí)，體內(nèi)急劇增加的活性氧自由基容易對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，而植物體內(nèi)會(huì)通過增加SOD、POD 和CAT 等抗氧化酶的活性來減少這種損害，從而使活性氧的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)[24,33]。張雪等[34]研究發(fā)現(xiàn)：氮素缺乏會(huì)引起黃瓜幼苗葉片內(nèi)過氧化氫和超氧陰離子積累，進(jìn)而造成抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)：添加氮使得抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性顯著提高，且SOD 與POD 的活性隨著氮素水平的增加而顯著增加；磷添可顯著增強(qiáng)SOD和POD 活性，且與氮添加產(chǎn)生顯著的交互作用，進(jìn)而提高鹽地堿蓬的抗逆性。MDA 作為細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量是反映膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和膜脂損傷程度的重要指標(biāo)[33,35]。氮添加顯著降低了鹽地堿蓬葉片中的MDA 含量，然而15 和45 g/m2處理間的MDA 含量無顯著差異，這可能與其生命活性所需的氮素達(dá)到飽和狀態(tài)有關(guān)。在外源氮添加的情況下，鹽地堿蓬的可溶性蛋白含量顯著增加，并與磷添加有顯著的交互作用。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，氮和磷均是參與蛋白質(zhì)合成的主要元素，故氮磷添加能有效提高鹽地堿蓬抗氧化酶的活性，增強(qiáng)其生存能力。

4 結(jié)論

氮添加能顯著影響鹽地堿蓬的形態(tài)特征，且與磷素在生物量與株高上存在顯著的交互作用，其中氮添加量為45 g/m2且配施磷處理的生物量最高。光合色素含量隨著氮素添加量的增加而增加，且與磷素在葉綠素a 和葉綠素b 含量上有顯著的交互作用。氮添加可顯著提高葉片的光合特性，且氮磷添加對(duì)葉片Gs、Tr和WUE 有顯著的交互作用。氮處理能有效增加葉片抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量，降低MDA 含量，且對(duì)于SOD 和POD 活性氮磷交互作用顯著?？梢?，氮磷添加可有效增加黃河三角洲鹽地堿蓬的光合特性與抗氧化酶活性，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。