劉楚祺，趙高坤，鄧小鵬，馬二登，李軍營(yíng)，陳 頤，姜永雷，王 聰

(1.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021)

烤煙(Nicotiana tabacum)為茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)一年生或有限多年生草本植物，是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。2020 年中國(guó)煙草種植面積達(dá)887 362 hm2，居世界前列，而云南省以44.5%的占比成為中國(guó)煙草種植面積最大的省份，煙草是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源[2]。近年來(lái)，受耕地資源、種植條件以及生產(chǎn)成本等諸多因素的限制，在中國(guó)大多數(shù)煙區(qū)很難實(shí)行煙草輪作和休耕的種植方式，常年的煙草連作種植較為普遍。連作障礙已成為制約中國(guó)煙草生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題[3]。煙草是忌連作作物，隨著植煙年限延長(zhǎng)，連作障礙加劇，植煙土壤養(yǎng)分比例失調(diào)，病蟲害加重，導(dǎo)致煙草產(chǎn)量和質(zhì)量下降等問(wèn)題日益突出[3]。因此，烤煙的健康經(jīng)營(yíng)和長(zhǎng)期生產(chǎn)力維持成為遺傳育種學(xué)和農(nóng)藝栽培學(xué)研究的重要課題。

在煙草生產(chǎn)中，煙農(nóng)往往會(huì)投入大量的化肥與農(nóng)藥應(yīng)對(duì)連作障礙造成的土壤肥力下降和煙草病害發(fā)生。然而，連作障礙是多種因素共同作用的結(jié)果，包括土壤理化性質(zhì)、土壤微生態(tài)和根系分泌物等[4]，其機(jī)制是作物與土壤相互作用，使土壤結(jié)構(gòu)、理化指標(biāo)和微生物群落等發(fā)生變化，進(jìn)而影響作物生長(zhǎng)[5-6]。土壤微生物代謝產(chǎn)生的胞外酶可以將土壤中復(fù)雜的有機(jī)化合物降解為簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物，然后被植物根系和土壤微生物重新吸收利用，是土壤中生化反應(yīng)的催化劑，也是土壤養(yǎng)分循環(huán)代謝的重要?jiǎng)恿7-9]。土壤胞外酶活性既能反映土壤肥力的優(yōu)劣，又能夠體現(xiàn)土壤中微生物的活力，是土壤生態(tài)功能的重要指標(biāo)[10]。土壤中不同種類的酶可通過(guò)分解復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)為微生物提供可直接利用的碳(C)、氮(N)、磷(P)和硫(S)等營(yíng)養(yǎng)成分，從而影響土壤微生物[11]，其計(jì)量關(guān)系可有力表征土壤微生物養(yǎng)分限制[8-9]。連作土壤中植物根系將植物光合作用同化CO2后的產(chǎn)物部分轉(zhuǎn)運(yùn)至根際環(huán)境，土壤微生物通過(guò)分泌能催化土壤有機(jī)質(zhì)解聚的胞外酶來(lái)獲取C、N、P[10]。土壤胞外酶的化學(xué)計(jì)量學(xué)與C、N、P 養(yǎng)分獲取相關(guān)酶的化學(xué)計(jì)量學(xué)可以確定微生物所需的養(yǎng)分與土壤中有效養(yǎng)分的關(guān)系[12]。C、N、P 是土壤養(yǎng)分的核心，研究其化學(xué)計(jì)量特征能反應(yīng)土壤中三者之間的相互關(guān)系；而土壤胞外酶作為土壤中所有反應(yīng)的催化劑，直接參與土壤中C 和P 的循環(huán)，其化學(xué)計(jì)量特征也能反映土壤的養(yǎng)分供應(yīng)和土壤質(zhì)量[13]。隨著連作年限的增加，土壤中微生物分布程度降低，土壤中的脲酶(urease，Ure)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等活性隨之降低。微生物是土壤胞外酶活性的主要參與者，在土壤有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-17]。目前，開展植煙土壤長(zhǎng)期連作如何影響土壤胞外酶活性及化學(xué)性質(zhì)的研究并不全面。鑒于此，本研究以不同連作年限植煙土壤為對(duì)象，分析不同連作年限植煙土壤C、N、P 及其相關(guān)胞外酶活性，以探究產(chǎn)生連作障礙的機(jī)制，為煙草連作種植年限的確定提供理論基礎(chǔ)，以促進(jìn)煙草種植行業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植煙試驗(yàn)田位于云南省玉溪市紅塔區(qū)龍樹村(N24.17°，E102.32°，海拔1 786 m)，供試土壤為云南典型的砂質(zhì)紅壤。當(dāng)?shù)啬昶骄鶜鉁?1.4 ℃，年降水量約850 mm，烤煙大田生育期內(nèi)(5—7 月)降水量約600 mm；前作均為大麥，且管理和施肥均一致?？緹熎贩N為當(dāng)?shù)刂髟云贩NK326，每年烤煙種植理墑前施農(nóng)家肥12 t/hm2作為底肥；根據(jù)品種養(yǎng)分需求，施用煙草專用復(fù)合肥(mN∶mP2O5∶mK2O=12∶12∶24)保證施用純氮90 kg/hm2，烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中施用硫酸鉀(mK2O=50%)調(diào)節(jié)氮、磷、鉀養(yǎng)分比為1∶1∶3；所有肥料在栽后40 d前施用完畢。

1.2 樣地設(shè)置和采樣

根據(jù)前期定位田的設(shè)置，選取同一試驗(yàn)基地內(nèi)不同種植年限(1、2、4、6 和9 a)的植煙土壤為研究對(duì)象，于2021 年9 月25 日(即烤煙采烤后)采集根際周圍0～20 cm 的耕層土壤，每個(gè)植煙田塊設(shè)置3 個(gè)2 m×2 m 的樣方，樣方間隔3～5 m。每個(gè)土壤樣本用土鉆采集每個(gè)樣方的四角和中心位置(5 點(diǎn)采樣法)，將5 份土壤樣品混合作為1 個(gè)土壤樣本；將土壤樣本置于無(wú)菌自封袋中，放入保溫盒運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室中進(jìn)行分析。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)挑出植物根系，將土壤分為2 份進(jìn)行保存：一份風(fēng)干后用于土壤化學(xué)性質(zhì)分析；另一份用液氮速凍后迅速置于-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物胞外酶活性和微生物量碳、氮、磷的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 土壤化學(xué)指標(biāo)測(cè)定

pH 值采用電位法測(cè)定；全磷(TP)含量采用高氯酸—濃硫酸消解、鉬藍(lán)比色法測(cè)定[18]；全氮(TN)含量采用半微量凱氏法測(cè)定；有機(jī)碳(TC)含量采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定；銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)按照鍍銅鎘還原—重氮化偶合比色法測(cè)定。

1.3.2 土壤微生物量碳、氮、磷測(cè)定

土壤微生物量碳(MBC)和土壤微生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸—K2SO4浸提法浸提，用碳氮分析儀測(cè)定；土壤微生物量磷(MBP)采用氯仿熏蒸—NaHCO3浸提法測(cè)定[19]。

1.3.3 土壤胞外酶活性測(cè)定

Ure 活性采用苯酚鈉—次氯酸鈉比色法測(cè)定[20]；PPO 和 POD 活性分別采用紅紫棓精比色法和鄰苯三酚比色法測(cè)定[20]；β-1,4-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase，βG)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，AP)、β-1,4-N-乙?；被咸烟擒彰?β-1,4-Nacetylglucosaminidase，NAG)、亮氨酸氨基肽酶(leucine arylamidase，LAP)和纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)活性采用各自的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量學(xué)的向量長(zhǎng)度分析計(jì)算微生物資源限制[21]。根據(jù)SINSABAUGH 等[22]的方法，將酶活性數(shù)據(jù)歸一化為每克土壤有機(jī)碳的單位，然后用以下公式計(jì)算向量長(zhǎng)度(L，無(wú)單位)和向量角(A，°)：

式中：a為βG 活性；b為AP 活性；c為NAG 活性；d為L(zhǎng)AP 活性；ATAN2代表求方位角的反正切函數(shù)。L值越大表示有機(jī)碳限制越大；A小于45°表示氮(N)的相對(duì)限制程度，大于45°表示磷(P)的相對(duì)限制程度。

采用Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用SPSS 19.0 軟件，用單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(Duncan 法)分析植煙土壤化學(xué)性狀及土壤胞外酶在不同連作年限的差異；采用Canoco 5.0 軟件進(jìn)行土壤化學(xué)性狀和土壤微生物胞外酶之間的冗余分析(redundancy analysis，RDA)，分析前進(jìn)行去趨勢(shì)分析(gradient lengths＜3)檢驗(yàn)線性模型的適宜度。采用Origin 2019 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同連作年限植煙土壤的化學(xué)性狀

由表1 可知：在保證前期施肥一致的條件下，隨著連作年限的增加，植煙土壤TC、TN、TP、NH4+-N 和NO3--N 含量呈明顯變化，都表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，且各指標(biāo)在連作4 a 時(shí)達(dá)到最小值；土壤pH 值也呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，變化范圍在5.68～6.43，呈酸性。與連作1 a 的植煙土壤相比，連作4 a 的土壤TC 含量降低16.04%，TN 含量降低3.6%，TP 含量降低17.78%，NH4+-N 和NO3--N 含量分別降低45.75%和60.32%；連作9 a 的土壤TC 和TP 含量顯著增加(P＜0.05)；連作6 a 的土壤NH4+-N 含量顯著減少(P＜0.05)；連作6 和9 a 的土壤NO3--N 含量顯著減少(P＜0.05)。

表1 不同連作年限的植煙土壤化學(xué)性狀Tab.1 Chemical properties of tobacco-planting soil under different continuous cropping years

2.2 不同連作年限植煙土壤微生物量的變化

由表2 可知：隨著連作年限的增加，植煙根際土壤MBC 和MBN 呈先降低后增加趨勢(shì)，均以連作4 a 的植煙土壤最低，與連作1 a 相比，分別降低了68.76%和26.99%；而MBP 在不同連作年限下無(wú)顯著變化。此外，隨著連作年限的增加，MBC/MBN 和MBC/MBP 也呈先降低后增加的趨勢(shì)，且以連作4 a 的植煙土壤最低；MBN/MBP 隨著連作年限增加也呈先降低后增加的趨勢(shì)，但不同連作年限之間變化不顯著。

表2 不同連作年限植煙土壤微生物量的變化Tab.2 Changes of soil microbial biomass of tobacco-planting soil under different continuous cropping years

2.3 不同連作年限植煙土壤胞外酶活性的變化

由圖1 可知：連作1 a 時(shí)Ure 活性最高，分別是連作2、4、6 和9 a 的1.18 倍、2.62 倍、2.04倍和1.34 倍，隨著連作年限的增加，Ure 活性先降低后升高，在連作4 a 時(shí)活性最低；連作1 a時(shí)POD 活性顯著高于其他連作年限；隨著連作年限的增加，土壤PPO 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，并在連作4 a 時(shí)活性最高(0.443 mg/g)、連作9 a 時(shí)活性最低(0.357 mg/g)；土壤AP 活性隨著連作年限的增加而逐年增加，連作9 a 時(shí)活性最高(11.91 U/g)；與碳循環(huán)相關(guān)的土壤βG 和CBH 活性在連作4 a 時(shí)最低；與氮循環(huán)相關(guān)的土壤NAG 和 LAP 活性隨著連作年限的增加總體變化趨勢(shì)不顯著，在連作1～6 a 時(shí)差異不顯著，在連作9 a 時(shí)其活性顯著升高。

圖1 不同連作年限的植煙土壤胞外酶活性變化Fig.1 Changes of extracellular enzymes activities of tobacco-planting soil under different continuous cropping years

2.4 不同連作年限植煙土壤胞外酶化學(xué)計(jì)量分析

不同連作年限土壤胞外酶的化學(xué)計(jì)量特征變化不同。由圖2a 可知：連作1、4 和6 a 土壤中，微生物投入較多的資源用于合成驅(qū)動(dòng)有機(jī)碳礦化的β-1,4-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶(βG+CBH)，從而提高土壤中碳源的獲取效率。由圖2b可知：向量長(zhǎng)度的范圍為0.995～1.048，最大值為連作2 a 的土壤。由圖2c 可知：向量角度的范圍為27.76°～30.55°，均小于45°，說(shuō)明連作植煙土壤中微生物受氮限制較大。由圖2d 的線性回歸方程可知：向量長(zhǎng)度和角度呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

圖2 不同連作年限植煙土壤胞外酶化學(xué)計(jì)量特征比較分析Fig.2 Comparative analysis of the chemometric characteristics of extracellular enzymes in tobacco-planting soils with different continuous crop years

2.5 長(zhǎng)期連作下土壤胞外酶活性與土壤理化性狀的關(guān)系

由圖3 可知：RDA 分析的前兩軸共解釋了土壤胞外酶活性和根際土壤化學(xué)性狀變量間60.07%的變異，其中RDA1 和RDA2 分別能解釋41.76%和18.31%的環(huán)境變量。土壤胞外酶活性的變異能夠被TC 含量解釋34.10% (F=2.7，P=0.018)，能被pH 值解釋26.01% (F=4.6，P=0.018)，能被TP 含量解釋24.90% (F=4.3，P=0.036)。連作1 a 分布在第2 象限，連作2 和 9 a 分布在1、4 象限，連作4 a 分布在第3 象限，連作6 a 分布在3、4 象限。由箭頭長(zhǎng)度和箭頭間的夾角可以看出：土壤TC 含量與NAG、Ure、LAP、CBH活性呈正相關(guān)，且與NAG 活性的相關(guān)性最高；土壤TN 含量、TP 含量分別與AP 活性、βG 活性呈顯著正相關(guān)，且相關(guān)性最高；氮獲取相關(guān)的酶NAG 和LAP 活性與土壤TC、TN、TP 含量均顯著正相關(guān)。

圖3 煙田根際土壤肥力屬性與胞外酶活性間的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of extracellular enzyme activities in the rhizosphere physical and chemical properties of tobacco-planting soil

3 討論

前人針對(duì)連作障礙開展了較多研究，明確了連作障礙是植物與土壤生態(tài)系統(tǒng)諸多因素作用下長(zhǎng)期互作的結(jié)果[5,13,20]。土壤中養(yǎng)分含量變化也是衡量土壤肥力和健康的重要指標(biāo)，在本研究中，植煙土壤的TC、TN 和TP 含量均呈先降低后升高的趨勢(shì)，不同連作年限之間存在差異，這與杜杏蓉等[13]、王鵬等[23]和王棋等[24]的研究結(jié)論相似。本研究土壤的pH 值為5.68～6.43，處于煙草種植的最適宜pH 范圍(5.5～6.5)[19]。此外，氮素對(duì)于農(nóng)作物的生長(zhǎng)至關(guān)重要，NH4+-N 和NO3--N 是大部分作物主要的氮素來(lái)源。本研究中，連作1～4 a 植煙土壤的NH4+-N 和NO3--N 含量均下降，土壤肥力降低；而連作4 a 后土壤養(yǎng)分含量又逐漸上升，即隨著連作年限增加，部分養(yǎng)分會(huì)在土壤中積累，出現(xiàn)土壤養(yǎng)分含量增加的現(xiàn)象，這可能是由于土壤發(fā)生連作障礙后導(dǎo)致施入土壤的肥料無(wú)法被烤煙充分吸收，使土壤中積累了較多的氮和磷。

韓翠蓮等[25]對(duì)不同連作年限馬鈴薯土壤中酶活性的研究發(fā)現(xiàn)：連作6 a 內(nèi)，土壤中Ure 和AP 活性隨連作年限的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，且均在馬鈴薯連作2 a 時(shí)活性最高；土壤中POD 活性則表現(xiàn)為隨著馬鈴薯連作年限的增加而顯著下降。苜蓿連作有利于土壤蔗糖酶、磷酸酶和Ure 活性升高，而對(duì)POD 的影響不明顯[26]。在草莓連作過(guò)程中，Ure 活性的變化呈先升后降的趨勢(shì)，蔗糖酶活性則呈升高的趨勢(shì)[27]。通過(guò)以上研究可以看出：不同作物連作對(duì)土壤胞外酶活性的影響存在明顯差異。Ure 作為植煙土壤中分解銨類物質(zhì)的酶，為煙草生長(zhǎng)提供氮源，保證煙株正常生長(zhǎng)[20]。本研究中，連作前4 a Ure 的活性呈下降趨勢(shì)，與張迪等[28]的研究結(jié)果相同，但在連作4 a 后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。PPO 能夠促進(jìn)土壤中酚類物質(zhì)降解，并且能夠保護(hù)植物生長(zhǎng)免受生物和非生物的脅迫[29]，本研究中隨著連作年限的增加PPO 活性逐漸降低。βG 和CBH 在連作2 a 時(shí)活性最強(qiáng)，在連作4 a 后活性呈增強(qiáng)趨勢(shì)，這可能是由于土壤中含碳化合物隨著連作年限增加逐漸積累使酶活增強(qiáng)；連作1～6 a 間NAG 和LAP 的活性沒有顯著變化；而AP 活性則一直呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。本研究表明：不同連作年限植煙土壤的胞外酶活性變化不同，Ure、PPO、βG 和CBH 以及NAG 和LAP 變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)均在連作4 a，其中氮水解酶隨連作年限的增加變化不顯著，這與蔡秋燕等[30]的研究結(jié)果不完全一致，其研究發(fā)現(xiàn)植煙土壤胞外酶活性隨著連作年限的延長(zhǎng)呈不同程度地下降。但杜杏蓉等[13]的研究發(fā)現(xiàn)：烤煙連作5 a 后，紫色土、水稻土和紅壤的POD 活性均顯著下降，但紅壤的蔗糖酶活性則增加，紫色土、水稻土和紅壤的Ure 和磷酸酶活性均有所增加，其中，紫色土的Ure 活性增幅最小、磷酸酶活性增幅最大。分析以上研究結(jié)果不同的原因可能與不同類型土壤的質(zhì)地有關(guān)，不同質(zhì)地的土壤其機(jī)械組成不同，而土壤胞外酶活性與土壤黏粒含量呈正相關(guān)[31]，土壤質(zhì)地越黏重，土壤胞外酶的活性越強(qiáng)，反之，土壤粒徑越大，其土壤胞外酶尤其是水解酶的活性越弱。

土壤微生物量是指土壤中生存的活體微生物總量，具有很強(qiáng)的動(dòng)態(tài)性，是土壤中最活躍的部分[28]，能夠反映土壤肥力的高低。本研究中MBC 和MBN 含量隨著連作年限的增加呈先增后降趨勢(shì)，可能是短時(shí)間連作(1～4 a)使烤煙根系受到的影響較小，而長(zhǎng)期連作(6～9 a)使得土壤肥力下降，土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量隨之降低，微生物數(shù)量減少，導(dǎo)致生物量降低。研究表明：影響MBC、MBN 和MBP 含量變化的環(huán)境因子很多，如土壤含水量、TC 含量和TN 含量等[16,32]。冗余分析顯示：MBC、MBN、MBP 與TC、TN、TP 均呈正相關(guān)關(guān)系。MBC 代表土壤微生物量碳，MBN 代表土壤供氮能力，碳氮比越低，反映出土壤氮素具有較高的生物有效性，其利用效率較高。本研究中MBC/MBN 的變化趨勢(shì)與有機(jī)碳的變化趨勢(shì)基本相同，這可能是由于連作條件下，烤煙根際微生態(tài)環(huán)境惡化，微生物種群區(qū)系失衡，病原微生物大量繁殖所致。后續(xù)的研究需加強(qiáng)對(duì)連作土壤中病原微生物的研究。

4 結(jié)論

隨著連作年限的增加，土壤TC、TN、TP、NH4+-N 和NO3--N 含量呈先減少后增加的變化趨勢(shì)，且在連作4 a 時(shí)最低。連作土壤pH 值在5.68～6.43 之間，整體呈下降趨勢(shì)。因此，連作4 a的植煙土壤理化性狀最差。在烤煙連作4a 后，土壤pH 和碳、氮、磷元素發(fā)生變化，且與土壤氮循環(huán)相關(guān)的土壤胞外酶活性增加，將土壤中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氮以保持土壤中的氮平衡。