盧 娜，梁棟龍，李 靜，余南生

（佛山市順德區(qū)樂從醫(yī)院，廣東 佛山 528315）

增生性瘢痕是一種纖維化皮膚病，增生性瘢痕組織會對皮膚的美觀和功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，給患者造成不同程度的心理負(fù)擔(dān)，影響其生活質(zhì)量。為此，國內(nèi)外對增生性瘢痕的研究都非常重視。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、打磨、冷凍、壓迫、外用藥物、激素封閉等，但效果并不理想。5- 氨基酮戊酸光動力療法（5-ALA-PDT）是近年來的一種新的治療方式，在皮膚科的應(yīng)用較為多樣化，包括在腫瘤皮膚科、感染性皮膚科和皮膚美容科都有應(yīng)用。該療法優(yōu)點(diǎn)突出，如療效好、安全性高、患者耐受性好等，且應(yīng)用范圍廣泛，有較好的治療和美容效果。從增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞的病理生理學(xué)來看，5-ALA-PDT 可用于治療增生性瘢痕。近年來，國內(nèi)有學(xué)者研究了光動力療法在體外對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響[1]，也有學(xué)者測試了光動力療法在動物中治療增生性瘢痕的適用性[2]，均取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞增殖可過度產(chǎn)生膠原纖維，主要為Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，而抑制這兩種膠原纖維的產(chǎn)生可有效治療增生性瘢痕[3]。本研究就5-ALA-PDT 對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smads 信號通路的影響進(jìn)行分析，現(xiàn)將研究方法和結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選取2020 年1 月至2022 年8 月我院收治的增生性瘢痕患者66 例作為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有不同程度和類型的增生性瘢痕的臨床表現(xiàn)：皮膚傷口愈合后疤痕擴(kuò)散并突出于皮膚表面，不規(guī)則，凹凸不平，伴發(fā)紅、阻塞、發(fā)硬、發(fā)熱、發(fā)癢、發(fā)緊等；（2）年齡25 ～35 歲；（3）在研究開始前1 個(gè)月內(nèi)停用其他藥物；（4）知悉研究內(nèi)容，并簽署知情同意書。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重的心、肝、腎疾??；（2）治療依從性差；（3）對5-ALA-PDT 不耐受。將患者分為對照組和研究組，各33 例。研究組中，男10 例，女23 例，平均年齡（29.68±4.78）歲。對照組中，男12 例，女21 例，平均年齡（28.67±4.57）歲。兩組基線資料相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并已向有關(guān)部門報(bào)告和登記。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 用5- 氨基酮戊酸（5-ALA，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司）和BIOF 水合凝膠配制成20% 的凝膠溶液對研究組進(jìn)行光動力治療。在治療前，將患者安置在黑暗的房間內(nèi)40 min，用清水沖洗局部皮膚，然后遮陽20 min。治療時(shí)讓患者戴上護(hù)目鏡，在距離皮膚15 cm 處接受波長為（633±3）mm、能量為128 J 的紅光照射治療。治療后，用薄膜包裹患處，外用無菌紗布覆蓋，4 h 后拆除敷料，囑患者在24 h 內(nèi)避免強(qiáng)光照射患處。給予對照組單純激光治療，半導(dǎo)體激光器的輸出功率為100 mW/cm2，總能量為40 ～50 J/cm2，波長為635 nm，每次治療30 min。兩組均每5 d 治療1 次，共治療6 次。

1.2.2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 切開瘢痕組織，切取皮下組織，在平衡鹽水中切成0.5 cm×0.5 cm 的小塊，在膠原酶溶液中切割1 h，以200 目尼龍網(wǎng)過濾，離心過濾細(xì)胞液，棄去上清液，加入DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用第4 ～8 代細(xì)胞進(jìn)行測試。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定不同濃度（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）ALA對成纖維細(xì)胞TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）分泌的影響。將胰蛋白酶消化的單層培養(yǎng)細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)板的1.0×104孔中，培養(yǎng)48 h 后，在96 孔板中加入不同濃度（分別為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）的ALA，并加入無血清的DMEM 培養(yǎng)液，分別在燈光下照射20 min 作為對照組。將培養(yǎng)物在無ALA 和僅有光照的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，并加入含有10% 血清的培養(yǎng)基。24 h 后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定成纖維細(xì)胞在不同濃度ALA 下分泌的TGF-β1、MMP-1 的含量。

1.2.4 Western Blot 法 采 用Western Blot 法 檢 測MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的水平，按文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法進(jìn)行檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）觀察研究組治療前后成纖維細(xì)胞的狀態(tài)。（2）觀察不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞增殖能力的影響。通過MTT 比色法檢測細(xì)胞的增殖率來確定成纖維細(xì)胞的增殖能力，A 值越低說明5-ALA 對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用越顯著。（3）觀察不同濃度5-ALA對成纖維細(xì)胞前膠原（包括Ⅰ前膠原/β-actin、Ⅲ前膠原/β-actin）mRNA 表達(dá)的影響。（4）觀察5-ALA對MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件處理各項(xiàng)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料、計(jì)量資料分別用%、±s表示，分別行χ2、t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組治療前后成纖維細(xì)胞狀態(tài)的觀察

治療前，顯微鏡下觀察研究組的成纖維細(xì)胞：細(xì)胞間隔緊密，呈放射狀，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核仁不一，細(xì)胞質(zhì)向兩極突出，細(xì)胞核為淺藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為粉紅色；用5-ALA 進(jìn)行光動力處理后，顯微鏡下觀察到成纖維細(xì)胞為橢圓形或圓形，細(xì)胞間連接松散，失去正常細(xì)胞排列，在線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中觀察到了超微結(jié)構(gòu)的變化。

2.2 不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞增殖能力的影響

研究組在0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L濃度的5-ALA 下，成纖維細(xì)胞增殖能力的A 值分別為（0.215±0.011）、（0.215±0.011）、（0.188±0.007）。詳見表1。對照組成維細(xì)胞增殖能力的A 值為（0.244±0.011）。研究組不同濃度5-ALA 下成纖維細(xì)胞的增殖能力均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 研究組不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞增殖能力的影響（n=33）

2.3 不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞前膠原mRNA表達(dá)的影響

研究組不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞前膠原（包括Ⅰ前膠原/β-actin、Ⅲ前膠原/β-actin）mRNA 表達(dá)的影響不同，且均低于對照組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞前膠原mRNA 表達(dá)的影響（± s）

表2 不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞前膠原mRNA 表達(dá)的影響（± s）

注：*與對照組相比，P ＜0.05；β-actin 為β- 肌動蛋白。

指標(biāo) 研究組（n=33）對照組（n=33）0.25（mmol/L）0.5（mmol/L）1.0（mmol/L）2.0（mmol/L）Ⅰ前膠原/β-actin 0.847±0.151* 0.737±0.126* 0.721±0.115* 0.694±0.051* 1.337±0.054*Ⅲ前膠原/β-actin 0.763±0.105* 0.551±0.063* 0.548±0.035* 0.527±0.015* 1.145±0.036*

2.4 不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞TGF-β1、MMP-1 分泌的影響

通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，給予不同濃度5-ALA 測定發(fā)現(xiàn)，與對照組的TGF-β1、MMP-1（23.4±1.3）ng/L、（409.5±10.2）ng/L 相 比，研 究 組0.5 mmol/L、1.0 mmol/L 濃度的5-ALA 對TGF-β1的分泌起到抑制作用，對MMP-1 的分泌則起到誘導(dǎo)作用。詳見表3。

表3 不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞TGF-β1、MMP-1分泌的影響（n=33，ng/L，± s）

表3 不同濃度5-ALA 對成纖維細(xì)胞TGF-β1、MMP-1分泌的影響（n=33，ng/L，± s）

指標(biāo) 0.25 mmol/L 0.5 mmol/L 1.0 mmol/L TGF-β1 17.5±1.6 15.1±1.0 14.6±0.9 MMP-1 601.4±10.3 802.3±11.4 895.7±11.3

2.5 5-ALA 對MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的影響

用適當(dāng)濃度的5-ALA 處理細(xì)胞，輻照1 h 后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，采用Western Blot 法測定MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在研究組中，觀察到MAPK 家族的信號在0.5 mmo/L時(shí)明顯增強(qiáng)，與對照組相比，ERK（44 ku）、P38（38 ku）和JNK（46 ku）分別增加了113.0%、36.0% 和67.0%（P＜0.05）。

3 討論

增生性瘢痕是一種纖維化皮膚病，其特點(diǎn)是成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維（主要的細(xì)胞外基質(zhì)）的過度形成，導(dǎo)致膠原細(xì)胞外基質(zhì)大量異常沉積，引起局部皮膚畸形和功能障礙。Smad 蛋白是TGF-β 信號通路中重要的受體后信使，TGF-β1與相應(yīng)的受體結(jié)合并發(fā)揮生物效應(yīng)，TβR Ⅰ、TβR Ⅱ和TβR Ⅲ具有信號傳導(dǎo)所必需的Ser/Thr 蛋白激酶活性。具有Ser/Thr 蛋白激酶活性的跨膜信號受體對信號傳導(dǎo)至關(guān)重要，它參與受體下游的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[4]。被激活的TGF-β 受體通過蛋白分子（如Smads）調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)，Smads 將細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)到轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞核。TGF-β1通過調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞外基質(zhì)成分來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的形成（細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平）和表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)水解酶的形成和活性抑制細(xì)胞外基質(zhì)的代謝。成纖維細(xì)胞分泌的TGF-β1是瘢痕形成過程中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的重要刺激因子。增生性瘢痕的傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)、磨削、冷凍、壓縮、局部用藥和激素封閉等，但效果并不理想[5]。由于增生性瘢痕中的成纖維細(xì)胞比正常皮膚細(xì)胞有更強(qiáng)的積累光敏劑的能力，故可通過在非熱激光和光敏劑存在的情況下對其進(jìn)行照射來達(dá)到治療的目的。光敏劑吸收光能并進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，在此狀態(tài)下光敏劑將能量傳回給氧氣，產(chǎn)生活性氧和自由基，對瘢痕組織成纖維細(xì)胞的生物膜造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。5-ALA 作為第二代光敏劑，很容易被瘢痕組織中的成纖維細(xì)胞吸收，并由ALA 脫水酶和一系列的酶轉(zhuǎn)化為強(qiáng)效的光敏劑，如原卟啉IX（PpIX），在特定光的照射下它通過產(chǎn)生活性氧和自由基來傷害目標(biāo)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，ALA 的濃度影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)，其抑制作用隨著濃度和光照時(shí)間的增加而增加[6]。本研究結(jié)果也表明，增生瘢痕組織中的成纖維細(xì)胞在采用5-ALA 進(jìn)行光動力治療后形態(tài)發(fā)生了顯著改變：體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞呈正常的貝殼狀，壁附著良好，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)完整，邊界清晰；5-ALA 濃度超過一定界值時(shí)，細(xì)胞形態(tài)的折疊隨著濃度的增加而增加。另一方面，隨著5-ALA濃度的增加，成纖維細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破裂增加，細(xì)胞質(zhì)過度充盈，細(xì)胞核減少或碎裂，出現(xiàn)不同大小的細(xì)胞質(zhì)顆粒。5-ALA-PDT 治療增生性瘢痕的原理主要是：活躍增殖的目標(biāo)細(xì)胞比周圍的正常細(xì)胞具有更大的積累光敏劑的能力，通過使用特定波長的光在合適的時(shí)間照射目標(biāo)細(xì)胞，能誘發(fā)一系列的生化反應(yīng)，破壞活躍增殖細(xì)胞的生物膜，進(jìn)而達(dá)到滅活的目的[7]。研究顯示，5-ALA-PDT 對增殖性瘢痕成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞前膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的基因表達(dá)在不同濃度下存在差異性，且對第4 ～第8 代原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的TGF-β1/Smads 信號通路確實(shí)存在影響[8]。

本 研 究 發(fā) 現(xiàn)，0.5 mmol/L、1.0 mmol/L 濃 度的5-ALA 對TGF-β1的分泌起到了抑制作用，對MMP-1 的分泌起到了誘導(dǎo)作用?？赡艿脑蚴牵篗MP-1 是一種正常存在于人體內(nèi)的蛋白酶，其生理功能是降解膠原Ⅳ，早期MMP-1 的分泌增加促進(jìn)了膠原Ⅳ的重塑；TGF-β1能促進(jìn)膠原蛋白的合成，改善皮膚老化；光敏劑能明顯增加細(xì)胞的光吸收性，增強(qiáng)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制TGF-β1的分泌。但人體內(nèi)是否存在一種機(jī)制來對抗MMP-1 的異常增加或激活補(bǔ)償途徑需要進(jìn)一步研究。本研究中，在研究組中觀察到MAPK 家族的信號在0.5 mmo/L 時(shí)明顯增強(qiáng)，與對照組相比，ERK（44 ku）、P38（38 ku）和JNK（46 ku）分別增加了113.0%、36.0% 和67.0%（P＜0.05）。主要原因是：一方面，一定量的5-ALA 可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡，這種作用可能抵消ERK 的增殖作用，或?yàn)檠a(bǔ)償性激活；另一方面，5-ALA 影響其他兩個(gè)與應(yīng)激有關(guān)的MAPK 激酶，即JNK 和P38，它們相互作用，共同決定細(xì)胞的反應(yīng)。相關(guān)報(bào)道指出，ALA 可能通過刺激P38 和激活JNK 來抑制成纖維細(xì)胞的增殖[9]。本研究中，5-ALA-PDT 對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用是在MTT 試驗(yàn)中檢測到的，在0.25 ～2.0 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，抑制作用隨著5-ALA 濃度的增加而增加，在5-ALA 濃度為0.5 mmol/L 時(shí)達(dá)到高峰[10-11]。

綜上所述，采用5-ALA-PDT 治療增生性瘢痕可取得一定的成效。5-ALA-PDT 可通過抑制Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白基因的合成來抑制增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞的增殖，并對TGF-β1起到抑制作用，對MMP-1 起到誘導(dǎo)作用，同時(shí)觀察到MAPK 信號通路在濃度為0.5 mmo/L 的5-ALA 下增強(qiáng)，該濃度可作為5-ALA-PDT 治療增生性瘢痕的參考濃度。