余慧林,王建豐,劉 義,劉玉堯,蔣 薇,孟承穎,王 歡,胡德林

膿毒癥是由于機體對感染的反應失調引起的危及生命的多器官功能衰竭[1]。燒傷患者由于皮膚屏障功能被破壞,以革蘭陰性菌為主的病原體更易入侵機體造成感染引發(fā)膿毒癥[2]。大部分革蘭陰性菌的致病力與其細胞壁最外層的脂多糖相關。目前膿毒癥的病理生理機制尚不明確,而內皮細胞屏障功能障礙在膿毒癥的多器官損傷和死亡中起著重要作用[3]。血管內皮細胞鈣黏蛋白(VE-cadherin)的水平與膿毒癥病情嚴重程度有一定相關性[4]。內皮屏障功能的破壞往往伴隨著VE-cadherin酪氨酸磷酸化的增加和細胞連接處聚合肌動蛋白絲(F-actin)聚合的減少[5]。目前膿毒癥的治療主要是通過連續(xù)血液濾過清除炎癥細胞因子,減輕炎癥反應,從而改善預后,尚無針對分子水平的治療。該研究旨在通過檢測連續(xù)血液濾過治療前后炎癥細胞因子及內皮通透性相關基因表達變化,探討膿毒癥內皮細胞通透性的調節(jié)作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥患者血清收集及連續(xù)血液濾過處理根據(jù)膿毒癥診斷標準,收集5例行連續(xù)血液濾過治療前后的膿毒癥患者血清,并進行無菌處理,-80 ℃保存?zhèn)溆?。應?ELISA 法檢測濾過前后血清中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、Ras同源基因家族成員A (Ras homologue A, RhoA)、白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,嚴格按照試劑盒說明書操作,應用酶標儀于450 nm波長檢測各樣品吸光度(optical density,OD)值,所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2 主要試劑和儀器DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司,RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司,反轉錄試劑盒購于Thermo Fisher公司,Real-time PCR試劑盒購于TaKaRa 公司,DEPC水、一抗稀釋液購于碧云天生物技術研究所,蛋白提取及定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司,Western blot聚丙烯酰胺凝膠試劑盒購于上海雅酶生物醫(yī)藥有限公司,廣譜彩虹預染蛋白 Marker、ECL超敏發(fā)光試劑盒購于Thermo Fisher 公司,VE-cadherin 抗體、F-actin 抗體購于 Abcam 公司,山羊抗小鼠 IgG(HRP)、山羊抗兔 IgG(HRP)購于 Bioworld 公司,酶標儀Multiskan GO 1510購于美國Thermo Fisher 公司,細胞培養(yǎng)箱 MCO-18AC 購于日本松下公司,普通 PCR 儀器2720購于美國ABI公司,-80 ℃超低溫冰箱 8950086A 購于美國 Thermo Fisher公司,熒光定量 PCR 儀 7500購于美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 常規(guī)復蘇凍存的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),于DMEM 完全培養(yǎng)基中吹打混勻,放入37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞至匯合度為 80%時,根據(jù)實驗設計進行后續(xù)實驗。應用 10%的濾過前后血清干預HUVEC 24 h,檢測膿毒癥血清對 HUVEC通透性的影響;同時,應用Real-time PCR、Western blot 和免疫熒光法分別檢測其對VE-cadherin 和 F-actin mRNA 及蛋白表達的影響。

1.3.2構建 TLR4 低表達株 根據(jù)TLR4(NM_138557)基因序列設計、合成 3 條干擾序列,干擾序列片段如下,TLR4-RNAi-I:5′-TATTCAAAGATACA-CCAGCGG-3′;TLR4-RNAi-Ⅱ:5′-ATATTAAGGTAG-AGAGGTGGC-3′;TLR4-RNAi-Ⅲ:5′- AAATTCTCCC-AGAACCAAACG-3′。并將其構建至質粒載體(GV298)上。Lipofectamine 3000進行細胞轉染,檢測分析各序列的干擾效率。選取干擾效率最高的序列(shRNA-Ⅰ),應用濃度為 1.0 μg/ml嘌呤霉素篩選6周,構建 TLR4 低表達穩(wěn)轉細胞株(TLR4-shRNA)。檢測TLR4低表達對VE-cadherin、F-actin 和RhoA 表達的影響及其對血管內皮細胞通透性的影響。

1.3.3Real-time PCR檢測VE-cadherin、F-actin 和TLR4 mRNA表達變化 遵照Real-time PCR試劑盒說明書,以cDNA為模板,采用 SYBRGreen 染料法進行實時熒光定量 PCR,檢測各目的基因的表達,見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.3.4Western blot法檢測VE-cadherin 和 F-actin、TLR4、RhoA蛋白表達變化 RIPA 裂解液(強)提取細胞總蛋白,采用BCA 法測量樣品在 562 nm波長附近的吸光度值,測定蛋白濃度,調整合適后進行蛋白變性處理(100 ℃,5 min)。根據(jù)待檢測蛋白分子量制備合適濃度的分離膠(GAPDH,10%;TLR4,7.5%;RhoA,15%;VE-cadherin,8%;F-actin,10%),經 SDS-PAGE 電泳分離后,分別進行轉膜、封閉、一抗孵育[TLR4 (1 ∶400),RhoA(1 ∶500),VE-cadherin(1 ∶500),F-actin(1 ∶400)]、二抗孵育(1 ∶10 000)及 ECL發(fā)光、顯影,以 GAPDH 為內參,進行灰度掃描及相對表達量分析。

1.3.5單層細胞通透性實驗 制備單細胞懸液,細胞計數(shù)后調整細胞濃度至1×104/ml,然后將100 μl的HUVEC接種于Transwell小室,待單層內皮細胞層形成,測定跨上皮電阻(trans-epithelial electrical resistance,TER)至穩(wěn)定后,無牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。雙層小室的頂室加入FITC-albumin(溶于D-Hank液),底室加入D-Hank液。繼續(xù)培養(yǎng)45 min,吸取雙層小室的頂室和底室液體,應用熒光分光光度計,設定激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm,檢測各樣品熒光強度值,分析細胞通透性系數(shù)。

2 結果

2.1 血液濾過前后血清中相關細胞因子含量變化ELISA法檢測結果顯示:與濾過前相比,濾過后血清中 TLR4、RhoA、IL-1、IL-6 和 TNF-α含量均降低(t=4.722,P<0.01;t=4.168,P<0.01;t=6.623,P<0.01;t=8.141,P<0.01;t=6.372,P<0.01)。見圖1。

圖1 濾過前后血清中細胞因子含量變化與同一指標濾過前比較:**P<0.01

2.2 濾過前后血清干預對細胞通透性的影響細胞通透性檢測分析結果表明,與正常組相比,濾過前血清干預組熒光強度明顯增強,單層細胞通透性系數(shù)明顯升高(t=6.999,P<0.01);與濾過前血清干預組相比,濾過后血清干預組細胞通透性明顯降低(t=5.195,P<0.01)。見圖2。

圖2 濾過前后血清干預對血管內皮細胞通透性的影響與正常組比較:**P<0.01;與濾過前比較:##P<0.01

2.3 濾過前后血清干預對 VE-cadherin 和 F-actin 表達的影響分析結果表明,與正常組相比,濾過前血清干預組 VE-cadherin 和 F-actin mRNA 表達水平均降低(t=9.996,P<0.01;t=9.524,P<0.01),同時其蛋白表達也明顯降低(t=6.849,P<0.01;t=12.340,P<0.01)。與濾過前干預組相比,濾過后血清干預組 VE-cadherin 和 F-actin mRNA表達水平均升高(t=3.237,P<0.01;t=4.605,P<0.01),見圖3。同時其蛋白表達也明顯升高(t=4.744,P<0.01;t=2.667,P<0.01),見圖4。

圖3 濾過前后血清干預對VE-cadherin和 F-actin mRNA 表達的影響與正常組比較:**P<0.01;與濾過前比較:##P<0.01

圖4 濾過前后血清干預對 VE-cadherin 和 F-actin 蛋白表達的影響

2.4 濾過前后血清干預對TLR4 mRNA 表達的影響與正常組相比,濾過前血清干預組 TLR4 mRNA 表達顯著升高(t=12.110,P<0.01);與濾過前血清干預組相比,濾過后血清干預組 TLR4 mRNA 表達顯著降低(t=8.825,P<0.01)。見圖5。

圖5 濾過前后血清干預對 TLR4 mRNA 表達的影響與正常組比較:**P<0.01;與濾過前比較:##P<0.01

2.5 濾過前后血清干預對 TLR4 和 RhoA 蛋白表達的影響與正常組相比,濾過前血清干預組 TLR4 和 RhoA 蛋白表達升高(t=8.117,P<0.01;t=6.037,P<0.01);與濾過前血清干預組相比,濾過后血清干預組 TLR4 mRNA 表達降低(t=6.909,P<0.01;t=3.266,P<0.01)。見圖6。

圖6 濾過前后血清干預對 TLR4 和 RhoA 蛋白表達的影響

2.6 TLR4 低表達對 RhoA 及 VE-cadherin 和 F-actin 表達的影響Real-time PCR 分析結果表明,TLR4 低表達可明顯促進 VE-cadherin 和 F-actin的 mRNA 表達,與正常組相比,差異有統(tǒng)計學意義(t=11.590,P<0.01;t=13.050,P<0.01)。同時,Western blot結果也表明,TLR4 低表達可抑制 RhoA 蛋白的表達(t=4.289,P<0.01),促進 VE-cadherin 和 F-actin 蛋白的表達(t=13.278,P<0.01;t=3.781,P<0.01)。見圖7。

圖7 TLR4 低表達對 RhoA、VE-cadherin 和 F-actin 表達的影響

3 討論

連續(xù)血液濾過治療對于清除炎癥因子,改善膿毒癥患者預后方面有著積極作用,但其在膿毒癥病理生理過程中發(fā)揮作用的機制尚不明確。該研究中,經連續(xù)血液濾過治療后,膿毒癥患者血清中 TLR4、RhoA、IL-1、IL-6和TNF-α含量均顯著降低,表明該療法能夠有效清除炎癥因子。使用經連續(xù)血液濾過治療前后的膿毒癥血清干預HUVEC,結果顯示濾過后血清干預組VE-cadherin、F-actin mRNA和蛋白表達明顯升高,細胞通透性明顯降低。提示通過連續(xù)血液濾過治療可以保護血管內皮組成相關基因VE-cadherin 和 F-actin的表達,通過保護其結構功能,改善血管內皮細胞骨架結構,進而穩(wěn)定血管內皮通透性。內皮細胞高通透性是膿毒癥病理生理過程中的重要一環(huán),這對于改善膿毒癥預后有著重要意義。同時在該研究中還伴隨著TLR4 和 RhoA 表達的顯著降低。

RhoA是屬于GTPases的Rho亞家族。研究[6]表明RhoA可通過調節(jié)細胞骨架的重組,降低緊密連接蛋白的表達,引起血管內皮屏障功能障礙。Rho蛋白是細胞骨架、細胞形態(tài)和運輸?shù)年P鍵調節(jié)因子,能夠在多種信號通路發(fā)揮作用。Amado-Azevedo et al[7]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者的肺微血管內皮細胞中,RhoA通過以Rho GTPase依賴性方式參與了增加黏附連接和細胞基質黏附的動力學來促進細胞回縮和間隙形成的過程。Rho家族的小GTPases在肌動蛋白細胞骨架動力學的控制中發(fā)揮關鍵作用[8]。Rho GTPase及其下游效應物Rho激酶(Rho associated kinase,ROCK)介導的Rho/ROCK信號通路已被證明參與細胞黏附、運動和收縮,參與調節(jié)內皮通透性[9]。研究[10]顯示經脂多糖處理可降低肺微血管內皮細胞中緊密連接蛋白和VE-cadherin的表達水平,RhoA激活劑的應用能使連接蛋白表達減少,引起內皮屏障功能受損,RhoA是脂多糖誘導的內皮細胞功能障礙信號通路中的關鍵蛋白質。

脂多糖作為一種典型的病原體相關分子模式,可以被天然免疫系統(tǒng)中模式識別受體識別,模式識別受體能使它們將自身組織和外來病原微生物區(qū)分開,從而針對入侵的病原體產生防御性炎癥反應[11]。這些受體中就包括Toll樣受體,其在膿毒癥中能夠驅動內皮細胞釋放細胞因子、趨化因子和促凝因子,并表達促黏附分子,引起內皮通透性增加致間質滲漏,最終導致微循環(huán)血流受損、組織灌注不足和危及生命的器官衰竭[12]。TLR4是Toll樣受體家族成員,參與先天免疫并通過識別脂多糖介導炎癥反應。TLR4的過度激活觸發(fā)各種炎癥因子的產生,在炎癥反應的誘導中起著關鍵作用[13]。

該研究進一步構建了TLR4 低表達細胞株,結果顯示TLR4低表達可明顯促進VE-cadherin 和 F-actin的 mRNA和蛋白質表達,同時可抑制 RhoA 蛋白的表達,內皮通透性隨之降低。TLR4/RhoA 信號通路能夠影響細胞通透性相關基因VE-cadherin 和 F-actin的表達在膿毒癥內皮細胞調節(jié)中發(fā)揮作用,而經過連續(xù)血液濾過治療能夠有效降低血液中 TLR4、RhoA 等細胞因子含量,從而影響膿毒癥形成過程中的信號通路的正常轉導,通過保護內皮細胞 VE-cadherin 和 F-actin 等結構以協(xié)助血管內皮功能的穩(wěn)定,同時能夠清除過多的IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子以減輕對免疫功能的破壞,從而改善膿毒癥患者預后,為膿毒癥的治療提供了新思路。