基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探析“黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的作用機(jī)制※

王夢(mèng)詩(shī),郭 玲,何學(xué)紅

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽(yáng) 116600;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽(yáng) 110000)

慢性腎衰竭(chronic renal failure,CRF)是因各類(lèi)慢性腎臟病持續(xù)進(jìn)展至后期,腎實(shí)質(zhì)發(fā)生損害,出現(xiàn)水電解質(zhì)及代謝產(chǎn)物紊亂、酸堿平衡失調(diào)等全身各系統(tǒng)癥狀的一種臨床綜合征。慢性腎臟病對(duì)人類(lèi)健康有較大威脅,西醫(yī)對(duì)本病的治療以透析為主,但不良反應(yīng)較為明顯,故在疾病發(fā)展早期應(yīng)用中醫(yī)藥延緩疾病進(jìn)程十分必要。

遼寧省名中醫(yī)何學(xué)紅教授師承全國(guó)老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師郭恩綿,其認(rèn)為CRF是由于脾腎受損,濕濁毒邪內(nèi)蘊(yùn),使五臟虛損,氣血陰陽(yáng)不足所致,針對(duì)本病臨床表現(xiàn)及病機(jī)提出補(bǔ)益脾腎、活血祛瘀利水的治法,沿用參芪泄?jié)犸嫹制诙?臨床療效顯著[1]。“黃芪-太子參-陳皮”為郭恩綿教授補(bǔ)脾常用藥對(duì)[2],符合張仲景《傷寒論》中對(duì)角藥的描述,3味藥物四氣五味相互融合,可增強(qiáng)療效[3]。本研究期望從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度闡釋參芪泄?jié)犸嬛薪∑⒁鏆獾乃幬铩包S芪-太子參-陳皮”與CRF 間的關(guān)聯(lián)性,挖掘其通過(guò)何種途徑發(fā)揮治療作用,以期為后續(xù)臨床應(yīng)用中醫(yī)藥治療CRF提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 “黃芪-太子參-陳皮”活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)檢索3味中藥的組成成分。設(shè)置口服生物利用度≥30%,類(lèi)藥性≥0.18,根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)(ADME)參數(shù)篩選獲得藥物主要有效成分,并預(yù)測(cè)活性成分相關(guān)靶點(diǎn),導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù),明確各蛋白匹配的基因名稱(chēng)。

1.2 篩選CRF 靶點(diǎn)基因 以“慢性腎衰竭”“chronic renal failure”為關(guān)鍵詞,在 Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)收集CRF 靶點(diǎn)基因。由于Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果過(guò)多,故以Relevance score＞中位數(shù)為基準(zhǔn),進(jìn)行3 次篩選大于中位數(shù)的疾病靶點(diǎn),最后合并3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行去重。

1.3 獲取藥物與疾病的共同靶點(diǎn) 將得到的“黃芪-太子參-陳皮”活性成分靶點(diǎn)基因和CRF 靶點(diǎn)基因輸入Bioinformatics平臺(tái),得到兩者交集靶點(diǎn),構(gòu)建韋恩圖。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò) 將1.3獲取的交集靶點(diǎn)基因提交STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置物種類(lèi)別為“Homo sapiens”,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。

1.5 GO、KEGG 通路富集分析 應(yīng)用Metascape分析平臺(tái)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因組與基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析和基因本體(GO)分析,計(jì)算P-value值,對(duì)目的基因進(jìn)行排序,得到信號(hào)通路、生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)及分子功能(MF)等信息。篩選前20 個(gè)結(jié)果,在Bioinformatics網(wǎng)站制作氣泡圖。

1.6 構(gòu)建“藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 輸入篩選完成的交集靶點(diǎn)的成分、靶點(diǎn)及KEGG 富集通路,在Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建“藥物活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析各節(jié)點(diǎn)Degree值、介度及緊密度,得出發(fā)揮主要藥效的成分。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索1.6中得到的核心成分化學(xué)結(jié)構(gòu),自PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。在Py Mol軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)去水及殘基處理,導(dǎo)入AutoDock Tools 加氫。在AutoDock Vina中對(duì)核心成分和靶點(diǎn)分別進(jìn)行對(duì)接,選取最優(yōu)結(jié)合能構(gòu)象與靶點(diǎn)蛋白對(duì)接,結(jié)果導(dǎo)入Python-Pymol 2.2.0。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及靶點(diǎn)篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)初步收集黃芪活性成分87 種,太子參75 種,陳皮5種,根據(jù)ADME 值及相關(guān)文獻(xiàn)再次篩選后,最終得到黃芪活性成分17種,太子參6種,陳皮5種,見(jiàn)表1(黃芪節(jié)選前10位活性成分)。篩選出的黃芪活性成分靶點(diǎn)379個(gè),太子參108個(gè),陳皮79個(gè),去除三者重復(fù)值,最終保留角藥活性成分靶點(diǎn)共232個(gè)。

表1 “黃芪-太子參-陳皮”角藥活性成分(黃芪選取排名前10位成分)

2.2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)的獲取 自Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)共收集疾病靶點(diǎn)基因4 597個(gè),3次篩選Relevance score＞中位數(shù)的基因,獲得CRF 靶點(diǎn)基因575個(gè),合并Drugbank、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)并去重,最終保留1 145個(gè)靶點(diǎn)基因。輸入Bioinformatics平臺(tái),共獲得藥物活性成分與疾病交集靶點(diǎn)75個(gè),見(jiàn)圖1。

圖1 “黃芪-太子參-陳皮”角藥-慢性腎衰竭疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物治療CRF的PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在STRING平臺(tái)輸入2.2 中得到的交集靶點(diǎn),繪制PPI網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2。應(yīng)用Cytoscape 3.8.2 繪制更為清晰的PPI網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖3。此網(wǎng)絡(luò)包含73個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 335條連線,節(jié)點(diǎn)面積大,顏色深,則越重要。根據(jù)Degree值由高到低排序,前5 位為IL6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53,分別是64、64、63、61、60,這些靶點(diǎn)則預(yù)測(cè)為“黃芪-太子參-陳皮”治療CRF的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用圖

圖3 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的靶點(diǎn)高級(jí)蛋白質(zhì)相互作用圖

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用Metascape進(jìn)行富集分析,分別得到169 條KEGG 富集通路,細(xì)胞組分(CC)51個(gè)條目,分子功能(MF)99個(gè)條目,生物過(guò)程(BP)1 427個(gè)條目,參考Metascape平臺(tái)分析結(jié)果,均取前20 個(gè),在Bioinformatics 繪制KEGG、GO 氣泡圖。圖左側(cè)為富集名稱(chēng),氣泡大小與該通路的基因計(jì)數(shù)呈正相關(guān),橫軸為輸入基因占該通路基因的比值。KEGG 富集分析結(jié)果包含HIF-1 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路等。GO 功能分析結(jié)果中,CC主要有膜筏、囊腔、細(xì)胞溶脂等,MF 主要有酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同型二聚體活性等,BP主要有凋亡信號(hào)通路、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等。見(jiàn)圖4。

圖4 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的京都基因組與基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析及基因本體(GO)分析

2.5 構(gòu)建“藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖 將“黃芪-太子參-陳皮”藥物活性成分、交集靶點(diǎn)、KEGG 富集通路,傳至Cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖5。結(jié)果反映藥物治療CRF 呈多成分、多靶點(diǎn)、多通路的機(jī)制。通過(guò)Network Analyzer內(nèi)置插件對(duì)結(jié)果進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,最終預(yù)測(cè)得出活性核心成分、核心靶點(diǎn)?；钚院诵某煞质情纹に亍⒛鞠菟?、山柰酚,Degree值為61、28、22,核心靶點(diǎn)是PTGS2、RELA、AKT1,Degree值為23、18、16。

圖5 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 將2.5中得到的核心活性成分及核心靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果見(jiàn)表2。Autodock軟件普遍認(rèn)為,配受體的結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1表示兩者的結(jié)合活性較好,若≤-7.0 kcal·mol-1則其結(jié)合活性較強(qiáng)[4]。從表2可見(jiàn),各核心活性成分及核心靶點(diǎn)間結(jié)合能力均較好,其中槲皮素與PTGS2、木犀草素與AKT1、山柰酚與RELA 之間具有最強(qiáng)結(jié)合力。在Python-Pymol 2.2.0中導(dǎo)入最優(yōu)對(duì)接結(jié)果,見(jiàn)圖6。

圖6 核心基因與“黃芪-太子參-陳皮”角藥核心靶點(diǎn)最優(yōu)值分子對(duì)接模型圖

表2 “黃芪-太子參-陳皮”角藥治療慢性腎衰竭的核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

中醫(yī)并無(wú)關(guān)于慢性腎衰竭病名的直接記載,但據(jù)其臨床表現(xiàn),可歸于“癃閉”“關(guān)格”“腰痛”“虛勞”等范疇[5]。何學(xué)紅教授認(rèn)為,CRF 患者總屬先天稟賦不足,脾腎虛損,濁瘀膠著,阻滯脈絡(luò),最終發(fā)展為五臟皆虛。數(shù)據(jù)顯示,遼寧地區(qū)CRF 患者中,脾腎兩虛證者為首位[6]。CRF臨床表現(xiàn)為水腫、少尿、腰酸痛、面少華、食少納呆、舌胖大、有齒痕等脾腎虛證之象。李中梓言:“脾具土德,脾安則土為金母,金實(shí)水源,且土不侮水,水安其位,故脾安則腎愈安也?！庇纱丝梢?jiàn),腎臟病病機(jī)與脾腎相關(guān)。關(guān)于本病的病因病機(jī),中醫(yī)古籍多有記載?！端貑?wèn)·至真要大論》言“諸濕腫滿,皆屬于脾”,脾虛則津液運(yùn)化失司,水液代謝紊亂,發(fā)為水腫。脾虛清氣不升、濁氣不降,腎虛開(kāi)闔失固,脾腎兩虛,久病致瘀,精微物質(zhì)失澀外泄,表現(xiàn)為尿有泡沫,稱(chēng)為蛋白尿。CRF患者也可見(jiàn)面色萎黃、貧血之象,《靈樞·決氣》言“中焦受氣取汁,變化而赤”,脾胃為氣血生化之源,CRF 患者多體弱病久,脾虛失于統(tǒng)血,血行滯,溢脈外,表現(xiàn)為面少華、舌紫暗有瘀斑等癥狀。周身乏力為CRF常見(jiàn)癥狀之一,可能為低鉀血癥或貧血等。中醫(yī)理論認(rèn)為,人體肌肉壯實(shí)與否,與脾胃運(yùn)化相關(guān),脾旺則血足,身體強(qiáng)壯,反之則四肢無(wú)力,甚或大肉盡脫。《四圣心源》言:“肌肉者,脾土之所生也,脾氣盛則肌肉豐滿而充實(shí)?！薄捌⒅骷∪狻?“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”,腎脾為先后天之本,脾之健運(yùn)依賴(lài)于腎陽(yáng)溫煦,腎藏精又依靠脾精滋養(yǎng),脾腎虧虛,則臟腑失養(yǎng),肌肉萎縮。綜上,何學(xué)紅教授在CRF的治療早期從健脾益氣補(bǔ)腎的基本治法入手,應(yīng)用參芪泄?jié)犸嬛委?以黃芪、太子參為君藥,配伍陳皮等理氣之藥,脾腎共治,以達(dá)補(bǔ)后天以養(yǎng)先天之效。黃芪補(bǔ)脾益氣、利水消腫。研究顯示,黃芪可提高血漿白蛋白水平,促進(jìn)水鈉排泄,改善腎臟微循環(huán)[7]。太子參是中醫(yī)臨床常用補(bǔ)虛藥,具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺之效,可治療脾虛體倦、氣陰不足等。兩藥相輔相成,補(bǔ)益肺、脾、腎氣機(jī),升清降濁,行血利水。陳皮味苦,辛散溫通,行理氣化痰和中之功,能有效緩解CRF患者脾胃氣滯、嘔惡納呆等胃腸道不適反應(yīng)[8]。三藥相合,共奏益腎健脾之功。

本研究結(jié)果顯示,“黃芪-太子參-陳皮”角藥治療CRF的活性核心成分可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚,核心靶點(diǎn)為PTGS2、RELA、AKT1。CRF 的疾病進(jìn)展與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān),槲皮素可抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá),減少系膜細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[9]。國(guó)內(nèi)外研究表明,槲皮素具有抗氧化、降低過(guò)氧化脂質(zhì)的作用[10],可通過(guò)影響腎小球細(xì)胞間黏附分子E-鈣粘素的表達(dá),從而保護(hù)腎臟細(xì)胞免受損傷[11]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí),槲皮素可增加腎衰竭大鼠腎組織中一氧化氮含量,對(duì)腎臟微循環(huán)和組織細(xì)胞起保護(hù)作用[12]。糖尿病腎病及高血壓腎病是罹患CRF的重要病因[13],木犀草素可通過(guò)抗氧化作用降低腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、纖溶酶原激活物抑制物-1的表達(dá),對(duì)腎臟起保護(hù)作用。山柰酚可降低腎組織中白介素細(xì)胞(IL)-1β、IL-6等炎癥因子水平,減緩脂多糖誘發(fā)的急性腎功能損害發(fā)生[14]。研究表明,山柰酚能抑制高糖誘發(fā)的腎系膜細(xì)胞增殖,保護(hù)腎臟功能,延緩纖維化發(fā)展[15]。PTGS2 又稱(chēng)環(huán)氧化酶2(COX-2),研究顯示COX-2與腎小球硬化及腎功能惡化相關(guān),在腎血流動(dòng)力學(xué)和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用,抑制COX-2的過(guò)度表達(dá)是防治CRF 的有效途徑之一[16]。AKT1在人體各組織中普遍表達(dá),是參與細(xì)胞增殖、代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)對(duì)改善腎臟間質(zhì)纖維化有重要意義[17]。RELA 又名轉(zhuǎn)錄因子p65,是構(gòu)成核因子κB(NF-κB)異二聚體的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子之一,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、免疫、氧化應(yīng)激等[18],調(diào)控氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞異常脂代謝,降低腎小球硬化過(guò)程的發(fā)生率[19]。KEGG 通路富集分析顯示,角藥治療CRF 與HIF-1通路有關(guān)。HIF-1稱(chēng)低氧誘導(dǎo)因子,在炎性反應(yīng)中具有重要作用,HIF-1α過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子生成增加,激活腎臟炎性反應(yīng)和纖維化機(jī)制[20]。分子對(duì)接結(jié)果顯示,活性核心成分槲皮素、木犀草素、山柰酚分別與PTGS2、AKT1、RELA結(jié)合具有穩(wěn)定性。

綜上所述,本研究立足于名老中醫(yī)治療CRF的用藥規(guī)律及治法經(jīng)驗(yàn)總結(jié),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參芪泄?jié)犸嬛薪∑⒁鏆饨撬帯包S芪-太子參-陳皮”作用于CRF的分子機(jī)制,預(yù)測(cè)得到活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚,可能作用于PTGS2、AKT1、RELA 等多個(gè)靶點(diǎn),通過(guò)HIF-1等信號(hào)通路,延緩腎間質(zhì)纖維化。角藥各有效成分均可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路干預(yù)CRF的進(jìn)展,但由于中藥包含的化學(xué)成分十分復(fù)雜,中藥組方配伍具有多變性,藥物作用及體內(nèi)代謝的多方式、多途徑,各類(lèi)中藥、疾病信息庫(kù)的同質(zhì)性,成分篩選指標(biāo)的局限性及眾多信息通路網(wǎng)絡(luò),使分析結(jié)果具有不確定性。在證明中醫(yī)藥通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)、多通路治療疾病的基礎(chǔ)上,后續(xù)可反向分析角藥中含量較多的多糖、皂苷等如何作用于各類(lèi)信號(hào)通路,其中的調(diào)控分子如何相互激活或抑制,為角藥發(fā)揮補(bǔ)脾益氣的作用機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)充。同時(shí)后續(xù)研究還可結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其驗(yàn)證補(bǔ)充,探析中藥復(fù)方各類(lèi)成分劑量對(duì)疾病治療的影響。