劉光瑞,宗 淵,李 云,曹 東,劉寶龍,包雪梅,3,李建民

(1.青海師范大學 生命科學學院,青海 西寧 810008; 2.中國科學院 西北高原生物研究所,青海省作物分子育種重點實驗室,青海 西寧 810008; 3.中國科學院 藏藥研究重點實驗室,青海 西寧 810008)

當歸[Angelicasinensis(Oliv.) Diels]是傘形科當歸屬多年生草本植物,主要以根部入藥,是我國傳統(tǒng)的大宗藥材,藥用歷史悠久,廣泛應(yīng)用于各類方劑中[1-3]。當歸根中富含揮發(fā)油、有機酸、多糖、氨基酸、黃酮類等活性成分,藥理價值高,具有抗炎[4]、抗腫瘤[5-7]、抗氧化[8]、保肝護肝[9]、抗抑郁[10-11]、強腎健體[12],以及促進造血[13-14]、舒張平滑肌[15]等作用。與其他中藥材相比,當歸中有機酸多為酚酸類化合物[16],酚酸具有多種藥理作用,如抗腫瘤、抗癌等[17-20]。

藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成和積累受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,如MYB、bHLH、WRKY、ERF、bZIP等[21]。轉(zhuǎn)錄因子與植物多種生理活動、生長發(fā)育調(diào)控、脅迫應(yīng)答等過程密切相關(guān),例如,通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達,進而調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的合成和積累[22-28]。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的特征可分為4大類,包括1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB,進一步分為28個亞家族[29]。其中,R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在黃酮、萜類等化合物的合成代謝中具有明顯的調(diào)控作用[22],如苦蕎[Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.]FtMYB23通過調(diào)控黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達,促進原花青素的合成和積累[30];在低溫脅迫下FtJAZ2可正向調(diào)控花青素的合成和積累[31]。西伯利亞白刺(NitrariasibiricaPall.)NsMYB1能調(diào)控果實花青素的合成和積累[32]。紅花(CarthamustinctoriusL.)CtFRMYB1和CtFRMYB2能調(diào)控類黃酮的合成代謝[33]。盡管多種植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子已被克隆和驗證,但當歸MYB轉(zhuǎn)錄因子鮮有報道。

基于課題組前期的研究,從當歸不同時期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選到1個差異表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44,其在根中高表達。通過同源比對,初步推測AsMYB44與根部酚酸的特異積累相關(guān),但AsMYB44的功能尚不明確。本研究擬克隆轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44,通過生物信息學分析、農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)錄組學和廣泛靶向代謝組學對其調(diào)控次生代謝物合成的功能進行研究,為進一步研究AsMYB44參與當歸次生代謝產(chǎn)物合成的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

當歸(Angelicasinensis)、Samsun煙草(Nicotianatabacum)種植于青海省作物分子育種重點實驗室育種室。大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞DH5α、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態(tài)細胞EHA105購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司?？敲顾?kanamycin,Kan)、利福平(rifampicin,Rif)購自上海麥克林生化科技有限公司。DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)、Tiangen TIANgel Midi Purification Kit試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa Code No.6210A)、SacⅠ限制性內(nèi)切酶、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa(大連)公司。ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-02)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。Nano drop 2000 (Thermo Fisher Scientific)、QuantStudioTM3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)。

1.2 當歸RNA提取與cDNA合成

新鮮當歸經(jīng)液氮冷凍后,用高速研磨機打碎成粉末,使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)提取總RNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶質(zhì)量。用Nano drop 2000 (Thermo Fisher Scientific)測定其濃度,用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 基因克隆與植物過表達載體的構(gòu)建

根據(jù)本課題組前期篩選得到的AsMYB44基因序列,通過Primer Premier 5軟件設(shè)計引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以當歸cDNA為模板和表1中相應(yīng)引物擴增AsMYB44基因。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。用Tiangen TIANgel Midi Purification Kit試劑盒回收PCR產(chǎn)物,然后用XbaⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切,用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接,構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2300s：AsMYB44。然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞,菌落PCR鑒定后選取陽性單克隆,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序無誤后,挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒備用。

表1 引物序列

1.4 生物信息學分析

使用MEGA 11.0軟件的Neighbour-joining法構(gòu)建AsMYB44系統(tǒng)進化樹,用在線軟件NCBI Conservation Domain(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測分析AsMYB44編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和理化性質(zhì)。

1.5 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

利用液氮凍融法將pCAMBIA2300s：AsMYB44重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,涂布于LB固體培養(yǎng)基(Kan+Rif),28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取菌落進行PCR鑒定。陽性菌落于LB液體培養(yǎng)基(Kan+Rif)中28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)至D600為0.6～0.8;然后采用葉盤法侵染煙草[34],經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等,得到轉(zhuǎn)基因煙草植株。使用DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片DNA,用AsMYB44基因克隆引物進行PCR檢測,篩選陽性植株。

1.6 轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學聯(lián)合分析

分別選取3株野生型(WT)煙草、T0代轉(zhuǎn)基因煙草根,將符合質(zhì)量要求的樣本總RNA送至上海派森諾生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序,測序平臺為Illumina NovaSeq Pe150,每個樣本進行3次重復(fù)。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、質(zhì)控,得到高質(zhì)量clean reads。將煙草參考基因組(GCF_000715135.1_Ntab-TN90_genomic.fna)與高質(zhì)量clean reads進行比對組裝。組裝的unigenes提交至公共數(shù)據(jù)庫進行搜索,與Nr(非冗余核酸序列數(shù)據(jù)庫)、Swiss-Prot(蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫)、KOG(真核生物蛋白相鄰類的聚簇)、GO(http：//www.geneontology.org)、KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/)等數(shù)據(jù)庫進行分析比對、基因功能注釋和分類。通過FPKM(fragments per kilo bases per million fragments)確定基因表達量,以表達差異倍數(shù)|log2Fold Change|>1、顯著性P-value<0.05為標準對差異表達基因進行分析。同時,將選取的樣本送至武漢邁特維爾生物科技有限公司進行廣泛靶向代謝組學分析,每個樣本進行3次重復(fù)。樣品經(jīng)凍干、提取、LC-MS檢測、原始數(shù)據(jù)處理與質(zhì)控等過程,得到高質(zhì)量數(shù)據(jù),根據(jù)校正后的質(zhì)譜數(shù)據(jù),對代謝物進行鑒定注釋、差異代謝物統(tǒng)計與富集注釋分析。

1.7 AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵基因qRT-PCR分析

選取T0代陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株,提取根組織總RNA,使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa Code No.6210A)將上述提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA稀釋100倍備用。苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脫氫酶基因(NtCAD)、阿魏酸-5-羥化酶基因(NtF5H)和肉桂酰輔酶A還原酶基因(NtCCR)的qRT-PCR引物見表1,以煙草肌動蛋白(NtActin)基因為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達水平,用Graphpad prims 7.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析、作圖,3次生物學重復(fù),取平均值±標準差,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA),顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 AsMYB44克隆與生物信息分析

從當歸中分離克隆獲得AsMYB44的cDNA序列,其開放閱讀框(ORF)為903 bp(圖1-A),編碼300個氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量為33.057 ku,理論等電點為8.84。編碼的蛋白質(zhì)包含PLN03212、MYB domain、SANT結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。

A,AsMYB44基因克隆;M,DL5000 marker;1～3,當歸葉片cDNA為模板的PCR產(chǎn)物。B,結(jié)構(gòu)域分析。C,AsMYB44系統(tǒng)進化分析。A, AsMYB44 gene clone; M, DL5000 marker; 1-3, PCR product of Angelica sinensis leaf cDNA. B, Domain analysis. C, Phylogenetic analysis of AsMYB44.圖1 AsMYB44基因克隆、結(jié)構(gòu)域分析和系統(tǒng)進化分析Fig.1 Cloning, domain analysis and phylogenetic analysis of AsMYB44 gene

系統(tǒng)進化樹顯示,AsMYB44與AtMYB11(AF062863.1)、SmMYB97(KF059561.1)、AtMYB12(AF062864.1)聚到一類,同源性較高(圖1-C)。

2.2 植物表達載體的構(gòu)建與AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

將pCAMBIA2300s：AsMYB44植物表達載體轉(zhuǎn)化DH5α,并挑取單克隆進行陽性PCR檢測(圖2-A),同時測序驗證,測序無誤菌株提取重組質(zhì)粒備用。采用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105,并對農(nóng)桿菌菌落進行PCR檢測(圖2-B),用陽性菌落侵染煙草。對獲得的12株T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株,提取基因組DNA進行陽性鑒定,共有10株煙草擴增到特異性目的條帶,與陽性對照條帶大小一致(圖2-C)。與野生型煙草對比,AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草無明顯表型差異。

A,1～10為大腸埃希菌菌落PCR,11為以AsMYB44質(zhì)粒為模板的PCR,12為陰性對照;B,1～9為農(nóng)桿菌菌落PCR,10為以AsMYB44質(zhì)粒為模板的PCR,11為陰性對照;C,1～12為以轉(zhuǎn)基因煙草DNA為模板的PCR,13為以AsMYB44質(zhì)粒為模板的PCR,14為陰性對照;M,DL5000 marker。A, 1-10 were PCR products of E. coli colonies, 11 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 12 was negative control; B, 1-9 were PCR products of Agrobacterium colonies, 10 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 11 was negative control; C, 1-12 were PCR products with transgenic tobacco DNA as templates, 13 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 14 was negative control; M, DL5000 marker.圖2 大腸埃希菌菌落、農(nóng)桿菌菌液與轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測Fig.2 PCR detection of Escherichia coli colony, Agrobacterium liquid and transgenic tobacco

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草基因和化合物差異表達分析

AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草根轉(zhuǎn)錄組學測序共得到124 011 108個clean read。根據(jù)每個unigene的FPKM值和log2Fold Change進行差異表達基因篩選,共得到8 084個差異表達基因。與野生型煙草相比,4 119個基因上調(diào),3 965個基因下調(diào)(圖3-A、圖3-B)。KEGG結(jié)果顯示,34個差異表達基因富集到苯丙烷代謝途徑(圖3-C)。

A,差異表達基因統(tǒng)計圖;B,差異表達基因火山圖;C,差異表達基因KEGG富集因子圖。A, Statistical map of differentially expressed genes; B, Volcano map of differentially expressed genes; C, Map of KEGG enrichment factors of differentially expressed genes.圖3 差異表達基因統(tǒng)計圖、火山圖、KEGG富集因子圖Fig.3 Statistical graph, volcano graph and KEGG enrichment factor graph of differentially expressed genes

AsMYB44轉(zhuǎn)基因煙草根代謝組學分析共檢測到1 137個代謝物,其中339個代謝物差異顯著,187個上調(diào)、152個下調(diào),差異代謝物主要為酚酸、脂質(zhì)、生物堿、黃酮類等化合物(圖4-A)。KEGG分析顯示,差異代謝物主要集中于氨基酸、黃酮類、苯丙氨酸等合成代謝途徑(圖4-B)。

聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學對差異表達基因富集最多的苯丙烷代謝途徑進行分析,結(jié)果表明,苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脫氫酶基因(NtCAD)等結(jié)構(gòu)基因的表達量上調(diào);該途徑中差異代謝產(chǎn)物主要為酚酸類化合物,其中,對香豆醛(p-coumaraldehyde)、芥子酸(sinapic acid)、對香豆酸(p-coumaric acid)含量上調(diào)顯著,而肉桂酸(cinnamic acid)、反式-5-O-對香豆酰莽草酸[trans-5-O-(p-coumaroyl) shikimate]、5-O-對香豆酰奎寧酸(5-O-p-coumaroylquinic acid)含量下調(diào)幅度較大(圖4-C)。

2.4 苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵基因qRT-PCR分析

轉(zhuǎn)基因煙草根中,苯丙烷代謝通路中結(jié)構(gòu)基因表達水平顯著提高(圖5),與轉(zhuǎn)錄組學測序結(jié)果趨勢保持一致。苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脫氫酶基因(NtCAD)的相對表達量分別上調(diào)2.28、1.63、2.00、3.14、1.56倍,而肉桂酰輔酶A還原酶基因(NtCCR)、阿魏酸-5-羥化酶基因(NtF5H)的相對表達量則下調(diào)。

3 討論

3.1 AsMYB44參與調(diào)控當歸酚酸類化合物的積累

基于課題組前期的當歸不同組織部位轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從當歸中分離出1個與酚酸合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44。系統(tǒng)進化樹顯示,AsMYB44與AtMYB11(AF062863.1)、SmMYB97(KF059561.1)、AtMYB12 (AF062864.1)聚到一類,同源性較高。丹參中過表達SmMYB97能激活丹參毛狀根中酚酸化合物的積累,已證實該基因能激活PAL、C4H、4CL等結(jié)構(gòu)基因的表達量;擬南芥AtMYB11、AtMYB12等轉(zhuǎn)錄因子也能通過調(diào)控苯丙烷代謝途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達量,進而影響酚酸類化合物的合成代謝[35-38]。而酚酸類化合物是由苯丙氨酸作為底物,AsMYB44過表達轉(zhuǎn)基因煙草中苯丙氨酸途徑中的結(jié)構(gòu)基因表達上調(diào)也是關(guān)鍵證據(jù)之一,由此初步推測AsMYB44可能具備調(diào)控植物酚酸類化合物積累的功能。

3.2 過表達AsMYB44影響煙草根部化合物積累

轉(zhuǎn)錄組學測序分析表明,與野生型煙草相比,過表達AsMYB44煙草根中差異表達基因主要富集在苯丙烷代謝途徑,且該途徑中NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCOMT、NtCAD等結(jié)構(gòu)基因的表達量上調(diào)。廣泛靶向代謝組學的結(jié)果顯示,差異代謝產(chǎn)物主要為酚酸、脂質(zhì)、生物堿、黃酮類等化合物,這些化合物作為前體物質(zhì),主要參與氨基酸、黃酮類、苯丙氨酸等的合成代謝?？嗍w中,FtMYB1、FtMYB2的過表達能促進二氫黃酮醇還原酶(DFR)基因和抑制黃酮醇合酶(FLS)基因的表達量,促進花青素的積累[39];FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15、FtMYB16能調(diào)控蘆丁的代謝合成[40];FtMYB1通過降低黃酮醇合酶基因和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(RT)基因的表達量抑制黃酮醇的合成[41]。擬南芥中AtMYB111、AtMYB12和AtMYB11能通過促進黃酮醇合酶基因、黃烷酮-3-羥基轉(zhuǎn)移酶基因(F3H)、查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)和查爾酮合成酶基因(CHS)的表達量,調(diào)控黃酮醇的合成與積累[42-44]。苯丙烷代謝途徑在植物次生代謝產(chǎn)物的合成代謝中具有重要作用,通過調(diào)控苯丙烷代謝途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達量,進而調(diào)節(jié)相關(guān)代謝物的合成代謝[45]。

3.3 煙草中過表達AsMYB44激活苯丙烷代謝途徑

與野生型煙草相比,轉(zhuǎn)基因煙草T0代根組織中,苯丙烷代謝途徑的NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCOMT、NtCAD、NtCCR等結(jié)構(gòu)基因相對表達量有所提高,而NtF5H下調(diào),該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學測序結(jié)果趨勢保持一致。擬南芥中AtMYB11、AtMYB12通過提高PAL、CHS、FLS、C4H、4CL等基因的表達量,從而調(diào)控酚酸的合成代謝。丹參SmMYB52、SmMYB97、SmMYB1、SmMYB52、SmMYB111等轉(zhuǎn)錄因子通過正向調(diào)控苯丙烷代謝及其下游通路中的PAL、C4H、4CL、TAT、RAS等基因的表達量,以促進酚酸的合成和積累[46-50]。過表達SmMYB36會造成苯丙烷代謝途徑及其下游PAL、4CL、TAT等基因表達量降低,負調(diào)控酚酸的合成代謝[51]。本研究中AsMYB44功能驗證的結(jié)果與上述報道相似,AsMYB44轉(zhuǎn)錄因子通過正向調(diào)節(jié)苯丙烷代謝途徑中PAL、C4H、4CL、COMT、CAD等基因的表達量,進而影響酚酸等相關(guān)化合物的合成代謝;其中,對香豆醛、芥子酸、對香豆酸含量明顯上調(diào);肉桂酸、反式-5-O-對香豆酰莽草酸、5-O-對香豆?？鼘幩岷肯陆?。因此,本研究后續(xù)可進一步分析AsMYB44轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控當歸酚酸合成的機制。

4 結(jié)論

本研究從當歸中分離出1個與酚酸合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子AsMYB44,對其進行生物信息學分析,同時利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系在Samsun煙草中異源表達并進行多組學聯(lián)合分析,對其調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的功能進行了驗證。結(jié)果表明,AsMYB44能通過調(diào)控苯丙烷代謝途徑中PAL、C4H、4CL、COMT、CAD等基因的表達量,正向調(diào)控酚酸的合成代謝,這為當歸MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控酚酸等次生代謝物的合成代謝機制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。但仍然存在不足之處,后續(xù)還需對其更深層次的調(diào)控機制進行深入研究。