楊松花,石貴陽,王晶琴,陳 竹

(貴州大學 農學院,貴州 貴陽 550025)

大豆[Glycinemax(L.) Merr.]含有豐富的優(yōu)質蛋白、不飽和脂肪酸和鈣,是膳食中優(yōu)質蛋白質的重要來源,營養(yǎng)價值高,栽培廣泛,是喜磷作物之一。無機磷含量在大部分土壤中占有主導地位,其中絕大部分以吸附態(tài)和固體礦物態(tài)存在,導致植物難以吸收利用。土壤全磷含量不低,但可被大豆利用的有效磷含量并不高。有研究表明,在酸性和石灰性土壤中,缺磷更可能成為大豆高產的重要限制因素之一[1]。增加磷肥的施入量是緩解土壤磷與農作物生長矛盾的傳統(tǒng)方法,但磷易被土壤固定,施入土壤的磷肥在酸性環(huán)境土壤中主要以難溶性鐵磷(Fe-P)、鋁磷(Al-P)和閉蓄態(tài)磷(O-P)形式被固定,在堿性土壤中主要以鈣磷(Ca-P)形式被固定,降低磷肥的利用率,不能有效解決作物缺磷問題,反而增加了農業(yè)成本。另一方面,磷肥被淋洗進入水體后,易造成環(huán)境污染,加重環(huán)境污染負擔[2]。近年來,為解決作物缺磷的關鍵問題,國內外研究紛紛致力于挖掘作物自身對磷的利用潛力和提高土壤中難溶態(tài)磷的生物有效性。

根系分泌物中的有機酸、磷酸酶等對活化土壤中的難溶性磷具有重要作用[3]。研究發(fā)現,白羽扇豆[4-5]、木豆[6-7]、菜豆[8-9]、紫云英[10]和蠶豆[11]等豆科植物的根系分泌物能提高土壤磷素的有效性,進而提高作物對難溶性磷酸鹽的活化。這主要是因為缺磷脅迫能增加豆科植物根系分泌物中有機酸的分泌量,顯著提高對難溶性磷的活化效果。楊利寧等[12]的研究發(fā)現,缺磷條件下苜蓿根系分泌物對土壤中難溶性磷的活化效果高于供磷條件下。降低根際pH值,促進難溶性磷的溶解,提高磷的生物有效性,是有機酸活化土壤難溶性磷的機制之一;有機酸通過螯合Fe、Al、Ca等,促進難溶性磷酸鹽的溶解,釋放出磷酸根離子,同時,也可以通過競爭土壤表面吸附位點,來降低土壤對磷酸根的吸附。研究發(fā)現,外加低分子量的有機酸能促進大豆植株磷的吸收積累,活化土壤中難溶性無機磷[13]。研究大豆根系分泌物對土壤中難溶性磷的活化作用,對如何改善土壤中磷素利用率,增加大豆吸磷量,充分挖掘磷素這一養(yǎng)分庫以提高大豆產量和品質,對促進我國農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。基于此,本試驗選擇10種大豆品種,在低磷脅迫條件下收集根系分泌物,測定有機酸組分及分泌量,并用分泌物進行土壤培養(yǎng),旨在探明大豆根系分泌物對土壤中難溶性磷的活化效果,為今后篩選磷高效大豆品種、提高土壤中難溶性磷利用率的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大豆品種為鐵豆40號(Td)、川豆14(Cd)、黔豆11號(Qd11)、鐵豐31號(Tf)、滇86-4(Dd)、矮選(Ax)、晉豆23號(Jd23)、冀豆12號(Jd12)、汾豆62號(Fd)和黔豆7號(Qd7),供試材料均由課題組老師提供。供試大豆品種的特征如下：鐵豆40號,有限結莢習性,百粒重23.8 g,屬中熟品種, 生育期132 d左右;川豆14,直立生長,株形收斂,有限結莢習性,百粒重24 g,春播大豆,生育期110 d左右;黔豆11號,有限結莢習性,百粒重18～22 g,春播大豆,生育期116.3 d;鐵豐31號,株形收斂,有限結莢習性,百粒重18～22 g,屬中晚熟春大豆品種,生育期133 d左右;滇86-4,直立有限結莢習性,百粒重19.1 g,中早熟品種,生育期122 d左右;矮選,株形開張,百粒重13～15 g,生育期110 d左右;晉豆23號,株形收斂,無限結莢習性,百粒重21.0～23.5 g,春大豆,生育期128～133 d左右;冀豆12號,株形呈塔形,有限結莢習性,百粒重22～24 g,黃淮夏中早熟品種,生育期100 d左右;汾豆62號,植株直立,株形開張,無限結莢習性,百粒重17 g,屬晚熟品種,生育期139 d;黔豆7號,株形收斂,有限結莢習性,百粒重15.9 g,南方春、夏大豆,生育期平均116 d。

供試有機酸標準品為乙酸、乳酸、延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、草酸、酒石酸。這8種有機酸在植物根系分泌物中占有重要比例,其中檸檬酸、蘋果酸和草酸等的研究報道較多。基于此,本研究選擇測定這8種有機酸,探究低磷脅迫下其分泌量的變化。

1.2 試驗方法

試驗設正常供磷的對照處理(0.5 mmol·L-1KH2PO4,NP)和低磷脅迫處理(0.02 mmol·L-1KH2PO4,LP),每個處理重復6次。選取大小均勻的大豆種子,1%次氯酸鈉浸泡5 min后用無菌水洗凈,避光發(fā)芽。幼苗發(fā)芽后先移入滅菌基質中栽培,待子葉展開后,移入光照培養(yǎng)箱,營養(yǎng)液水培,每小時向營養(yǎng)液通氣15 min,每3 d用0.1 mol·L-1的KOH 或HCl調節(jié)營養(yǎng)液pH值至5.9～6.0。供試營養(yǎng)液配方如下：硝酸鉀1.5 mmol·L-1、硝酸鈣1.2 mmol·L-1、硝酸銨0.4 mmol·L-1、硫酸鉀0.3 mmol·L-1、硫酸鎂0.5 mmol·L-1、氯化鎂0.025 mmol·L-1、硫酸錳0.001 5 mmol·L-1、硫酸銨0.3 mmol·L-1、硫酸鋅0.001 5 mmol·L-1、硫酸銅0.000 5 mmol·L-1、鉬酸銨0.000 15 mmol·L-1、硼酸鈉0.002 5 mmol·L-1、氯化鈷0.000 1 mmol·L-1、EDTA-鐵鹽0.04 mmol·L-1、磷酸二氫鉀0.5 mmol·L-1。缺素處理12 d后收獲植株,測定根系分泌物中的有機酸含量,并將分泌物倒入土壤中進行培養(yǎng)。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 根系分泌物的收集

用去離子水將根系沖洗干凈后,以250 mL的CaCl2(0.5 mmol·L-1)溶液作為收集液,并向收集液中加入3滴百里酚(20 g·L-1)作為微生物抑制劑,將根系浸入收集液中,根部避光培養(yǎng)5 h后,取出根系,所得到的溶液即為根系分泌物收集液,每個處理重復6次,3個用于測定其組分和含量,另外3個用于培養(yǎng)土壤試驗,用濾紙過濾后移入-20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 有機酸的測定

使用冷凍干燥機將根系分泌物收集液濃縮至10 mL,過0.22 μm濾膜后使用Agilent LC1260型號高效液相色譜儀測定有機酸濃度,并計算有機酸分泌量。

標準曲線的繪制：分別準確稱取色譜純的標準樣品草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、延胡索酸、琥珀酸,用超純水配成濃度為200 mg·L-1的標準樣品儲備液,過0.22 μm濾膜后,保存于4 ℃冰箱中備用。將8個酸的儲備液按0.5∶2.5∶5∶10∶5∶5∶0.05∶10的比例配制成混酸標樣,然后再分別稀釋0、2、4、6、8、10倍,以配置標準曲線。

具體色譜條件如下：色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250mm 5-Micron);流動相為0.01 mol·L-1KH2PO4(pH值1.70)和CH3OH(體積比為97∶3),檢測波長為210 nm,流速為0.5 mL·min-1,柱溫25 ℃,進樣量為10 μL,采用外標法定量。

1.3.3 土壤培養(yǎng)

準確稱取過100目篩的風干土10 g于小燒杯中,分別加入濃縮后的根系分泌物 10 mL,以加入10 mL 去離子水為對照。每個處理重復3次。于恒溫培養(yǎng)箱(25 ℃)中培養(yǎng) 10 d。

1.3.4 難溶性磷的測定

用0.5 mol·L-1NH4F提取Al-P;用0.1 mol·L-1NaOH提取Fe-P;用0.3 mol·L-1檸檬酸鈉和連二亞硫酸鈉混合溶液提取O-P;用0.25 mol·L-1H2SO4提取Ca-P。利用不同化學浸提劑將土壤中的無機磷酸鹽逐級分離后,用鉬銻抗比色法測定,參考酸性土壤無機磷形態(tài)的分級測定方法[14]。供試土壤的基本理化性質如下：pH值為5.35,有機質含量為16.08 mg·kg-1,有效磷含量為4.1 mg·kg-1,Al-P含量為224 mg·kg-1,Fe-P含量為133.91 mg·kg-1,O-P含量為266.71 mg·kg-1,Ca-P含量為17.89 mg·kg-1?；罨蕿榕囵B(yǎng)前后磷含量差值與培養(yǎng)前磷含量的比值。

1.4 數據處理

采用WPS表格軟件整理數據,用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析,用Origin 2018軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫對大豆根系分泌物中有機酸含量的影響

對根系分泌物有機酸含量進行方差分析(表1)發(fā)現,不同大豆品種、磷水平以及品種與磷水平之間的交互效應對有機酸的含量均有影響,不同品種之間的有機酸含量均達到極顯著,磷水平對乙酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、蘋果酸和總酸含量的影響達到極顯著,品種與磷水平間的交互效應對各有機酸組分和總酸含量的影響均達到極顯著。上述結果表明,低磷脅迫影響有機酸的分泌量。

表1 根系分泌有機酸含量的雙因素分析

低磷脅迫下不同品種有總機酸分泌量如圖1所示,與正常供磷相比,Qd11、Ax、Jd12和Fd的總有機酸分泌量在低磷脅迫下增加,達到極顯著差異,Jd23達到顯著差異,其余品種總有機酸分泌量未增加。低磷脅迫條件下,各品種的總有機酸分泌量表現為Cd>Jd23>Qd11>Ax>Jd12>Dd>Td>Fd>Tf>Qd7,其中Cd、Jd23、Qd11的分泌量分別為32.996、22.893、17.896 mg·h-1·g-1。

2.2 低磷脅迫不同大豆品種根系分泌物中有機酸不同組分分泌量的影響

不同磷水平處理的大豆根系分泌物中有機酸組分測定結果見表2,不同大豆品種無論在正常磷或是低磷條件下,均檢測到乙酸、乳酸、延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、草酸和酒石酸共8種有機酸。低磷脅迫影響了有機酸的含量,不同大豆品種根系分泌的有機酸組分在數量上存在差異,Td、Cd、Qd11、Tf、Dd和Qd7以分泌草酸為主,Ax、Jd23、Jd12和Fd以分泌酒石酸為主。低磷脅迫下,Qd11的檸檬酸、蘋果酸和草酸的分泌量顯著增加,是正常磷的3.1、2.4和5.3倍,Dd的琥珀酸和草酸的分泌量是正常磷的3.4和2.3倍,Ax的蘋果酸和酒石酸的分泌量是正常磷的3.2和5.8倍,Jd12的琥珀酸和酒石酸的分泌量是正常磷的2.2和2.5倍。琥珀酸(除了Qd11)和蘋果酸(除了Td、Cd和Dd)是大多數品種缺磷處理下有增多趨勢的有機酸,從不同大豆品種的琥珀酸分泌量來看,在低磷條件下,Dd的分泌量最高,為3.030 mg·h-1·g-1,Fd的分泌量低,為0.638 mg·h-1·g-1。從不同基因型大豆蘋果酸分泌量來看,Qd7的分泌量最高,為1.047 mg·h-1·g-1,其他各品種分泌的量較少,分泌量在0.082～0.510 mg·h-1·g-1。結果表明,不同大豆品種分泌的主要有機酸不同。

表2 不同磷水平下大豆根系有機酸分泌量

2.3 根系分泌物對難溶性無機磷的活化作用

2.3.1 不同大豆品種根系分泌物對土壤Al-P的活化效果

各大豆品種根系分泌物對土壤中難溶性磷有不同程度的活化作用(圖2-A),磷水平對Al-P活化率的影響不顯著,但品種以及品種與磷水平的交互作用對Al-P的活化率的影響達到極顯著水平。蒸餾水(CK)的活化率為11.4%,無論是正常磷還是低磷脅迫下,各大豆品種根系分泌物對土壤難溶性Al-P的活化效果均高于CK,其中Td、Cd、Jd23和Fd這4個品種在低磷處理下收集的根系分泌物對Al-P的活化效果高于正常供磷處理;低磷處理下,各大豆品種的活化效果表現為Jd23>Jd12>Cd>Qd11>Td>Tf>Ax>Fd>Dd>Qd7,Jd23根系分泌物的活化率達32.39%;活化效果最弱的是Qd7,活化率為12.55%。上述結果說明,大豆根系分泌物對土壤中Al-P有活化效果。

圖2 各大豆品種根系分泌物對Al-P和Fe-P的活化Fig.2 Activation of Al-P and Fe-P by root exudates of soybean varieties

2.3.2 不同大豆品種根系分泌物對土壤Fe-P的活化效果

不同大豆品種根系分泌物對Fe-P的活化效果見圖2-B,品種和磷水平及其交互作用對Fe-P的活化率的影響均達到極顯著水平。CK的活化率為13.9%,大豆根系分泌物對土壤難溶性Fe-P活化的同時,也存在吸附作用,各品種的活化效果均不如CK;不同品種間根系分泌物對Fe-P的活化效果存在顯著性差異,在低磷脅迫下,除了Cd、Tf和Dd,其他品種分泌物的活化效果提高,其中Qd7的活化效果最好,活化率為12.60%,其次是Qd11,活化率為11.81%。

2.3.3 不同大豆品種根系分泌物對土壤O-P的活化效果

如圖3-A所示,品種和磷水平及其交互作用對O-P的活化率的影響均達到極顯著水平。CK對土壤中O-P的活化率為11.2%,除低磷處理下Cd的活化效果低于CK外,其他處理的各品種根系分泌物對O-P的活化效果均高于CK。相比正常磷處理,在低磷處理下,除了Cd和Dd外,其他品種的分泌物對難溶性磷的活化率均有提高,說明低磷能促進大豆根系分泌物對土壤O-P的活化作用,其中,Qd11表現最好,極顯著高于正常磷處理,活化率為32.69%,其次是汾豆62號,活化率為28.18%,低磷脅迫下,各大豆品種活化效果表現為Qd11>Fd>Qd7>Tf>Jd23>Dd>Ax>Jd12>Td>Cd。

圖3 各大豆品種根系分泌物對O-P和Ca-P的活化Fig.3 Activation of O-P and Ca-P by root exudates of soybean genotypes

2.3.4 不同大豆品種根系分泌物對土壤Ca-P的活化效果

不同品種根系分泌物對Ca-P的活化效果見圖3-B,品種和磷水平及其交互作用對Ca-P的活化率的影響均達到極顯著水平。CK的活化率為19.42%,除了Cd和正常磷處理下的Jd23,其余各大豆品種的分泌物對Ca-P的活化率均高于CK。低磷處理下,除了Tf和Ax,其他大豆品種分泌物的活化率均高于正常磷處理,說明低磷能促進大豆根系分泌物對土壤Ca-P的活化作用?？偟膩碚f,活化效果表現為Qd11>Fd>Dd>Ax>Qd7>Jd12>Jd23>Td>Tf>Cd14,Qd11的活化率為41.73%。

比較不同品種對于4種難溶性磷的活化效果差異,整體上Ca-P的活化效果最佳,其次是O-P和Al-P,最弱的是Fe-P;大部分品種在低磷處理下的根系分泌物對土壤難溶性無機磷的活化效果要高于正常供磷處理,說明低磷脅迫下大豆根系的分泌物對難溶性磷有一定的活化作用。不同品種大豆對不同難溶性無機磷的活化效果不同,整體來說,Qd11和Qd7的根系分泌物對4種難溶性磷的活化效果較好。

2.3.5 不同大豆品種根系分泌物對土壤總無機磷的活化效果

不同大豆品種根系分泌物對無機磷總含量的活化效果見圖4,無論在正常磷還是低磷處理,添加大豆分泌物對土壤中無機磷總量的活化有促進作用,均減少了無機磷在土壤中的含量。相比正常磷處理,在低磷脅迫下,Td、Qd11、Jd23、Fd和Qd7的根系分泌物加入到土壤中后,顯著減少了無機磷含量,但Cd、Tf和Dd的無機磷含量增加,而Ax和Jd12的無機磷總量在培養(yǎng)前后無顯著差異。

圖4 各大豆根系分泌物培養(yǎng)前后總無機磷的變化量Fig.4 Changes of total inorganic phosphorus in soybean root exudates before and after culture

2.4 有機酸對土壤中難溶性磷的影響

對8種有機酸的分泌量和4種難溶性磷的活化率進行相關性分析發(fā)現,草酸的分泌量與Ca-P的溶解量有相關性,P值為0.091,酒石酸的分泌量與Al-P的溶解量有相關性,P值為0.098,蘋果酸的分泌量與Fe-P的溶解量達到顯著相關,P值為0.012,琥珀酸分泌量與鈣磷的溶解量呈顯著正相關,P值為0.023。

3 結論與討論

磷在土壤中的移動性極弱,缺磷是植物生長的重要限制因子,為了獲取磷,磷高效植物進化出了一系列機制。其中,增加低分子量的有機酸,如草酸、檸檬酸、蘋果酸和酒石酸的分泌,對改善植物磷營養(yǎng)具有十分重要的作用。有機酸可以與磷酸鐵、磷酸鋁、磷酸鈣等難溶性無機磷發(fā)生絡合反應,生成移動性強的磷酸二氫根離子,促進植物對難溶性磷的吸收。分泌能力強的植物,可以將25%的光合同化產物以根系分泌物的形式排放到根際,改善根際環(huán)境。本研究表明：無論是否受到低磷脅迫,所有大豆品種都會向根系外分泌有機酸,占其總生物量的2%～15%(圖1)。低磷脅迫下,Qd11、Ax、Jd23、Jd12和Fd的有機酸分泌量顯著增加,這表明分泌有機酸是這些品種的重要耐低磷機制。除了分泌有機酸外,植物還可以通過增加根冠比,與菌根共生等機制改善磷營養(yǎng)狀況。在本研究中,與正常供磷處理相比,Cd、Tf、Dd在低磷脅迫下有機酸分泌量沒有顯著性差異,而Td和Qd的有機酸分泌率甚至顯著降低,表明這些品種可能采取其他策略。例如,在土壤容重更低的環(huán)境下,植物可能通過擴大根系體積來獲取磷,而菌根真菌豐富的環(huán)境下,與菌根共生更有利于植物對磷的吸收。

在缺磷脅迫下,植物通過增加低分子量有機酸的分泌,來促進自身對土壤中難溶性含磷化合物的利用,改善其體內磷營養(yǎng)狀況[15]。本研究發(fā)現,低磷脅迫對大豆有機酸的分泌有影響,這與紫云英[10]、菜豆[8]、大豆[16-17]等豆科植物的研究結果一致。Qd11在低磷脅迫下,檸檬酸、蘋果酸和草酸的分泌率顯著增加,分別是正常磷的3.1、2.4和5.3倍。這與張振海等[18]的研究結果一樣,他指出耐低磷基因型大豆相比敏感型分泌出更多的有機酸,且差異顯著。王美麗等[19]的研究也發(fā)現,大豆在磷脅迫時草酸的分泌量高于供磷處理。本研究結果顯示,低磷脅迫下,Ax、Jd23、Jd12和Fd主要增加酒石酸的分泌。田中民等[20]的研究結果表明,缺磷條件下白羽扇豆根系分泌的有機酸為蘋果酸、檸檬酸和反丁烯二酸。束良佐[21]指出,白羽扇豆在低磷條件下形成的排根能大量釋放檸檬酸,以活化土壤中難溶性的磷。秦麗鳳[22]的結果顯示,低磷脅迫下,木豆根系分泌蘋果酸。由此可見,不同作物或者不同品種根分泌的優(yōu)勢有機酸不同。

有機酸向根際的釋放受有機酸陰離子蛋白的調控,缺磷脅迫下根系有機酸的釋放與植物體內有機酸代謝酶有關,如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、檸檬酸合成酶的活性升高,有機酸分泌主要靠質膜上的轉運蛋白,如ALMT蛋白負責轉運蘋果酸,MATE蛋白負責檸檬酸陰離子的分泌[23]。李嬌嬌等[24]對磷高效大豆的研究表明,低磷脅迫顯著增加三羧酸循環(huán)中間產物蘋果酸的分泌,并克隆了蘋果酸轉運酶GmALMT基因,暗示低磷可能通過調控蘋果酸轉運子基因的表達或其蛋白活性來促進蘋果酸的分泌。草酸在根系中的合成前體可能是檸檬酸或草酰乙酸,但目前沒有大豆乙醇酸氧化酶或草酰乙酸裂解酶的相關研究。下一步研究中可以結合大豆全基因組測序結果,探索不同大豆品種有機酸分泌對低磷脅迫響應的分子機制。

不同有機酸組分對土壤難溶性磷的活化效果有較大差異。我們的研究表明,草酸與Ca-P的活化量呈正相關關系(P=0.091,r=0.423),這與Strom等[32]和劉慧等[33]的研究一致。草酸根能與Ca2+形成草酸鈣沉淀,促使Ca-P的釋放。蘋果酸與Fe-P(P=0.012,r=0.581)活化量呈正相關關系,分泌到土壤中的這些有機酸可以通過氫離子的酸效應和陰離子的絡合效應來促進磷的活化,且隨著有機酸濃度增大,其氫離子的酸效應和陰離子的絡合效應也增強。但總有機酸與總無機磷活化量之間相關性較差,出現較多與總體趨勢不一致的異常品種。例如Tf31和Qd7在低磷處理中總有機酸分泌量分別為2.67 mg·h-1和2.79 mg·h-1,但他們對難溶無機磷的活化量達105.02 mg·kg-1和111.80 mg·kg-1,而Cd14在低磷處理中總有機酸分泌量高,但它對難溶無機磷的活化量僅為61.77 mg·kg-1。這可能有兩方面的原因：一方面,大豆根系能合成磷高效轉運蛋白GmPHT1,GmPHT1在吸收磷的過程中,會與H+-ATPase協同,促使后者向根系中分泌H+,降低土壤pH值,促進難溶磷的溶解;另一方面,Tf31和Qd7可能合成了某些未知的對難溶磷有很強活化效果的有機酸。

本研究結果顯示,貴州本地育成品種Qd11和Qd7受低磷脅迫后,其根系分泌物對土壤難溶性無機磷的活化效果顯著高于正常供磷處理。本實驗所用的土壤為極端貧瘠的貴州黃壤,其有效磷僅為4.1 mg·kg-1,說明本地品種對黃壤具有更強的適應性。