董靜 史雨婷 潘麗萍 張宗德

深入了解結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染后宿主的免疫應答機制對尋找結核病的免疫治療靶標具有重要意義。隨著基因圖譜研究的深入及高通量檢測深度和廣度的增加,越來越多的研究人員開始關注非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)介導的宿主免疫應答。其中,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)約占ncRNA的80%。既往研究提示,lncRNA在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學功能[1-2]。筆者對既往lncRNA分子參與MTB感染和結核病發(fā)病后宿主免疫調控的研究進行綜述,以期為結核病的免疫治療提供新的思路。

lncRNA的定義和分類

lncRNA是一種由超過200個核苷酸組成的不具備蛋白質編碼能力的RNA[3-4],參與了包括結核病在內的多種疾病的發(fā)生發(fā)展。根據lncRNA與蛋白質編碼區(qū)(sequence coding for aminoacids in protein,CDS)的相對位置和功能,通常將lncRNA分為5類：(1)正義鏈lncRNA：lncRNA與編碼基因的一個或多個外顯子重疊,且轉錄方向相同;(2)反義鏈lncRNA：lncRNA與編碼基因轉錄方向相反;(3)基因內lncRNA：由基因的內含子產生,既可以是獨立轉錄,也可以是前體mRNA(pre-mRNA)加工的副產物;(4)雙向lncRNA：lncRNA與蛋白質編碼基因共用相同的啟動子,但轉錄方向相反;(5)基因間lncRNA：由位于蛋白質編碼基因之間的序列獨立轉錄的lncRNA[3,5-6]。

與大多數mRNA相似,lncRNA在5′處有一個特殊的帽子結構,在3′處有聚腺苷酸[7-8]。最早研究者認為其序列中沒有開放閱讀框(open reading frame,ORF);但隨著研究的深入,發(fā)現一些lncRNA 具有小型ORF,可編碼具有特殊生物學功能的短肽[9-10]。與具有編碼能力的mRNA相比,lncRNA的表達水平通常較低,但在不同組織中特異性較高。近年來,研究人員廣泛開展了對各類疾病的臨床研究隊列,進行l(wèi)ncRNA疾病生物標志物鑒定的相關研究。隨著研究的深入,越來越多的研究者發(fā)現lncRNA 參與包括細胞增殖、分化、凋亡在內的多種生物學過程[3, 11]。

lncRNA的生物學功能

隨著生物信息學分析和分子生物學實驗技術的發(fā)展,已有更多的方法從不同維度進行RNA的研究,但人們對各種lncRNA發(fā)揮調控功能的機制仍知之甚少[12-14]。結核病研究領域現有研究多為驗證結核病患者中特異性異常表達的lncRNA,對其發(fā)病機制的相關研究不足。總結既往其他疾病方面的研究發(fā)現,lncRNA發(fā)揮調控作用和定位有一定的聯系,其調控功能主要是通過與DNA、RNA和蛋白質在內的生物大分子相互作用,轉錄為生物活性因子或短肽片段,在轉錄、轉錄后和翻譯階段發(fā)揮作用。此外,lncRNA的功能還與細胞的類型和細胞發(fā)育分化階段的特異性刺激有關[15-16]。

一、轉錄調控

lncRNA在細胞核中可與DNA產生三螺旋體或R環(huán)等復雜結構來招募蛋白質復合物,從而影響染色質轉錄[17]。既往研究顯示,lncRNA-DNA三螺旋體可以通過甲基化介導基因沉默[18],未來進一步研究可能會發(fā)現更多的lncRNA-DNA復合物作為分子信標來招募蛋白質,最終形成相互作用網絡。此外,定位于細胞核內的lncRNA也可通過影響染色質調控蛋白或與蛋白質相互作用參與基因轉錄,從而抑制特定基因組位點或增強蛋白的功能[19]。除了與生物大分子相互作用,lncRNA也可作為轉錄因子或增強子在細胞的轉錄網絡中發(fā)揮作用[1]。

二、轉錄后調控

lncRNA作為微RNA(miRNA)海綿進行轉錄后調控是目前主要發(fā)現的作用模式,既往一些研究均闡明了lncRNA-miRNA的調控關系。此外,一個lncRNA可以通過不同的靶miRNA來調控不同的通路,如lncRNA肺癌相關轉錄本1在膽囊癌和腎癌中,分別靶向miR-363-3p和miR-200s發(fā)揮調控作用[20-21]。lncRNA除了與miRNA相互作用外,還可以參與和調控mRNA的生成。既往研究指出,lncRNA可以與同源性較高的mRNA進行結合,從而競爭性地減少miRNA與其3′UTR的結合;此外還可以通過參與pre-mRNA剪接、調控mRNA的穩(wěn)定性或使mRNA降解來調控基因表達[3]。

三、翻譯調控及其他

研究顯示,lncRNA發(fā)揮生物學功能除了參與轉錄及轉錄后調控外,還可以激活或抑制翻譯水平。2015年,關于lncRNA的功能研究出現突破性進展,即發(fā)現lncRNA以短ORF編碼特定多肽發(fā)揮調控作用[22],并且在多種癌癥中已有相關報道。研究顯示,lncRNA HOXB-AS3編碼的短肽可以改善結腸癌患者的預后,lncRNA 00908編碼的短肽可以調控STAT3/血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路,從而抑制乳腺癌的發(fā)展[23-24]。但是,lncRNA編碼的短肽在MTB感染免疫中的作用尚未見報道,一方面由于結核病領域關于lncRNA的研究起步較晚;另一方面由于既往ORF預測算法將大小臨界值設為300 nt,即翻譯100個氨基酸殘基,而lncRNA中的ORF較短,導致lncRNA基因注釋中存在大量被忽視的短肽,未來可能通過計算機預測和實驗結合的方式,闡明lncRNA 編碼的短肽在MTB感染免疫中發(fā)揮的調控作用[25-27]。

lncRNA在MTB感染免疫中的研究進展

一、lncRNA在宿主固有免疫應答中的研究進展

在MTB感染過程中,宿主和病原體接觸后激活非特異性的固有免疫反應,動員包括巨噬細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)和中性粒細胞在內的固有免疫細胞發(fā)揮吞噬作用,調節(jié)炎癥反應,最終殺傷MTB或使MTB滯留。

(一)lncRNA在巨噬細胞介導的免疫應答中的研究進展

巨噬細胞是宿主抵抗MTB感染的第一道防線。近年來,研究者除了重點關注巨噬細胞在MTB感染后lncRNA表達譜的變化外,還力圖解析特異性lncRNA的功能及作用機制。如早在2018年就有研究發(fā)現lncRNA NEAT1具有抑制MTB增殖的作用[28]。

1.lncRNA通過內源競爭RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)機制發(fā)揮調控作用：進一步探究lncRNA參與宿主免疫調控的具體途徑是近年來的主要研究方向。lncRNA通常通過靶基因或靶蛋白發(fā)揮調控作用,在結核病領域中研究較多的靶基因類型主要是miRNA。研究發(fā)現,MTB標準株H37Rv感染會導致巨噬細胞中l(wèi)ncRNA GAS5表達下調,并通過靶向miR-18a-5p增強巨噬細胞活力[29];而lncRNA NORAD和lncRNA SNHG16在感染后表達水平增加,并負向調控其各自的靶基因miR-618和miR-140-5p[30-31]。以上研究均提示,lncRNA可以靶向miRNA實現對巨噬細胞增殖和炎癥反應的調控,從而影響MTB感染的結局。眾所周知,miRNA常通過與靶mRNA的3′-UTR不完全互補配對結合抑制下游基因的表達,而包括lncRNA在內的ncRNA可以與miRNA結合,從而實現基因表達。這種轉錄后調控機制被稱為ceRNA調控,其在生物體的生理和病理過程中扮演著重要角色[1,32]。既往研究提示,細胞自噬和凋亡可以促進MTB吞噬體的酸化和成熟,清除MTB賴以生存的生理環(huán)境并且抑制MTB在巨噬細胞中的生存,是巨噬細胞抵抗MTB感染的重要手段[33],而lncRNA也可以通過靶向miRNA調控巨噬細胞自噬/凋亡從而影響MTB生長。研究發(fā)現,lncRNA PCED1B-AS1作為miRNA海綿結合miR-155而上調FOXO3/Rheb[33],參與MTB感染后的固有免疫反應。此外,另一項研究結果顯示,卡介苗(BCG)感染后高表達的lncRNA MIAT也可以作為miR-665的海綿靶向ULK1,最終調控巨噬細胞的自噬和凋亡,在抗結核免疫和抗菌過程中發(fā)揮調控作用[34]。在一項負壓治療結核病的研究中,發(fā)現負壓治療能夠緩解MTB感染導致的lncRNA-XIST表達水平增加,進而上調miR-125b-5,活化NF-κB通路,促進巨噬細胞M1極化和炎性因子的釋放[35]。這項研究提示,lncRNA有望作為輔助治療結核病的靶標,為結核病治療新策略提供了新的方向和可能性;而隨著RNA測序和ceRNA測序等高通量測序技術的不斷完善和發(fā)展,已經積累了大量的轉錄組數據,也為系統(tǒng)性地認識與研究ceRNA調控網絡在疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的功能提供了潛在的可能。

2.lncRNA通過與RNA結合蛋白相互作用發(fā)揮調控作用：lncRNA除了靶向miRNA參與基因表達調控外,還可以通過與RNA結合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)相互作用,在固有免疫中發(fā)揮功能。RBP是一類可以與RNA特殊結構域結合的蛋白質的總稱,在RNA合成、修飾、轉運等方面發(fā)揮重要作用[36]。近年來,在結核病研究領域也逐漸發(fā)現lncRNA可與靶蛋白結合共同調控免疫反應的作用方式。轉錄因子是一類可以與基因啟動子區(qū)域DNA序列結合來控制基因轉錄的蛋白,是真核細胞內多種信號通路的關鍵調節(jié)因子。既往在其他疾病的研究也提示lncRNA可以與轉錄因子相互作用實現基因表達調控,同時,RNA pull down實驗的不斷優(yōu)化及質譜鑒定的發(fā)展為尋找包括轉錄因子在內的RNA結合蛋白提供了保障。2022年的一項研究證實,轉錄因子FUBP3可以作為RNA結合蛋白,與lncRNA EST12相互作用抑制白細胞介素(IL)-1β、IL-6等細胞因子的表達,促進MTB的增殖[37]。Gcanga等[38]證實lncRNA MIR99AHG可與RNA結合蛋白hnRNPA2/B1相互作用,促進巨噬細胞極化并激活宿主固有免疫應答。此外,在其他疾病領域的研究結果提示上述lncRNA MIR99AHG除了與蛋白結合外,還可以與miRNA相互作用共同調控基因功能[39]。這種同一個lncRNA 可以與多種大分子相互作用而形成龐大的調控網絡的現象,進一步體現了lncRNA的功能與基因表達調控網絡的復雜性。

3.lncRNA通過啟動信號通路發(fā)揮調控作用：lncRNA可以啟動不同信號通路參與宿主固有免疫。研究發(fā)現,lncRNA Cox2可能通過活化NF-κB和Stat3來調節(jié)炎癥反應[40],而lncRNA EPS在MTB感染后表達下調,同時通過JNK/MAPK信號通路抑制巨噬細胞凋亡并促進其自噬[41]。這提示某些lncRNA在發(fā)揮功能時,可能同時出現抑制巨噬細胞凋亡并促進其自噬(或相反)的調控。這可能是由于lncRNA具有多個功能區(qū)域或形成不同的二級和三級結構,能夠與不同功能的蛋白質或核酸作用形成新的結合位點,一方面實現了基因表達的精準調控,另一方面可以平衡免疫反應造成的細胞損傷,同時為lncRNA通過不同途徑調控細胞免疫反應提供了理論基礎[42]。

現階段普遍認為,MTB感染后,巨噬細胞凋亡、自噬及炎癥因子釋放等在宿主抗結核免疫或MTB逃避免疫應答中具有重要的意義;而深入研究lncRNA通過不同途徑參與免疫反應有利于進一步全面了解調控網絡,將為尋找結核病免疫治療新靶點提供思路。

(二)lncRNA在樹突狀細胞介導的免疫應答中的研究進展

除巨噬細胞外,lncRNA可以調控其他類固有免疫細胞參與抗結核免疫應答。雖然現階段在結核病領域中尚未發(fā)現相關研究,但是在炎癥和免疫領域有一定的研究。既往研究顯示,lncRNA Dpf3可抑制缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的活性從而減弱CC趨化因子受體7(CC-chemokine receptor 7,CCR7)介導的樹突狀細胞的遷移;lncRNA樹突狀細胞可以通過調控樹突狀細胞分化來間接參與免疫反應[43-44]。這些研究結果提示,lncRNA對于MTB感染后宿主調控樹突狀細胞參與免疫應答反應具有可探索的潛力。

(三)lncRNA在NK細胞介導的免疫應答中的研究進展

與樹突狀細胞類似,既往有研究證實lncRNA參與NK細胞釋放細胞因子及激活T細胞介導的適應性免疫應答從而殺傷受到外源性感染的細胞[45-46]。如lncRNA 49a正向調控NK細胞CD49a表達,抑制細胞因子γ-干擾素(IFN-γ)的表達從而參與細胞的免疫功能調控[47]。但到目前為止,lncRNA 在NK細胞中具體的調控作用研究仍然非常少,未來需要進一步挖掘。

除上述細胞外,lncRNA可能也介導其他類別固有免疫細胞發(fā)揮作用。研究表明,中性粒細胞也是抵御外源性感染的重要防線。既往針對中性粒細胞表達譜的分析結果顯示,有多個lncRNA通過ceRNA調控網絡參與細胞凋亡過程[48]。雖然在結核病領域還未見相關報道,但不能否認其在非特異性免疫反應中的可能功能。

綜上所述,關于lncRNA在固有免疫中的調控作用及機制仍需要進一步完善。一方面,需要深入挖掘和解析lncRNA在MTB感染免疫中的作用模式和分子機制;另一方面,要加強對于lncRNA參與其他類型細胞(樹突狀細胞、NK細胞和中性粒細胞等)介導的固有免疫應答的作用和機制探討。

二、lncRNA在宿主適應性免疫應答中的研究進展

(一)lncRNA在T細胞介導的免疫應答中的研究進展

目前已證實,宿主應對MTB感染的適應性免疫以T細胞介導的細胞免疫應答為主,主要包括CD4+T細胞和CD8+T細胞,通過特異性識別主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ類或Ⅱ類分子抗原分化成效應T細胞發(fā)揮殺傷作用,在抗MTB感染的適應性免疫應答中起到重要的作用。其中,lncRNA介導DNA表觀遺傳修飾是其重要的調控機制之一[49]。

Agresta等[50]發(fā)現CD244分子通過維持lncRNA CD244位點的染色質狀態(tài)來調控lncRNA CD244的表達,并將多梳蛋白家族中的果蠅zeste基因增強子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)引入到infg/tnfa啟動子區(qū),抑制組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化,從而抑制CD8+T細胞中IFN-γ和腫瘤壞死因子ɑ的表達,提示lncRNA 可通過調控表觀遺傳修飾來參與T細胞介導的適應性免疫功能[44, 51-52]。2017年,一項研究發(fā)現活動性結核病患者CD8+T細胞中血紅素加氧酶1表達下調,與其染色體相近位置的lncRNA XLOC_014219的表達上調具有相關性;CD8+T細胞中l(wèi)ncRNA 00229的上調,與其附近的蛋白編碼基因ARHGAP8的上調也存在相關性,故研究人員推測lncRNA的異常表達可能與其鄰近的蛋白編碼基因相關,lncRNA可能通過正向或負向調控附近基因的表達來參與MTB感染后宿主的免疫應答[53]。但是,lncRNA與鄰近編碼基因的調控關系及具體作用機制還需深入研究。

目前來看,lncRNA參與MTB感染后宿主CD4+T細胞介導的免疫應答的相關研究較少。2014年,研究初次揭示了活動性結核病患者和結核分枝桿菌潛伏感染者CD4+T細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜變化。2022年,Hong等[54]基于相關性分析和ceRNA網絡機制分析了GSE37250數據,推測包括CD4+T細胞在內的多種T細胞亞群參與調控MTB感染后宿主適應性免疫應答,并構建lncRNA-miRNA共表達調控網絡和PPI模型篩選出MIR60OHG/hsa-mir-21-5p軸可能介導T細胞激活,從而參與MTB感染后的適應性免疫。既往研究中并沒有關于CD4+T細胞中特異lncRNA作用機制或作用途徑的相關研究。

2022年的一項研究提示腸道菌群通過lncRNA-CGB負調控H3K27三甲基化(H3K27Me3)從而刺激IFN-γ的產生,并在T細胞中證實lncRNA-CGB通過與EZH2相互作用參與表觀遺傳修飾[55]。這是首篇將結核病與腸道菌群聯系,進一步豐富了lncRNA參與結核病免疫調控的研究。此外, Wang等[56]推測在活動性結核病患者外周血單核細胞中LINC00870可能通過JAK/STAT信號通路調控Th1/Th2平衡參與MTB感染后的免疫應答反應,但具體的調控機制還需要進一步驗正。

現有關于T細胞中l(wèi)ncRNA的研究,多關注整體lncRNA表達譜或通過生物信息學分析調控網絡找到理論上與MTB感染相關的理論靶標,而lncRNA 的具體功能和調控機制及l(fā)ncRNA與mRNA、miRNA和蛋白等生物大分子的調控網絡還有待進一步明確。未來還需要結合具體的實驗驗證生物信息學預測結果,闡明lncRNA在T細胞介導的MTB感染適應性免疫中的具體作用。

(二)B細胞中l(wèi)ncRNA參與免疫反應的研究進展

宿主特異性體液免疫應答主要由B細胞介導,在機體抗結核免疫保護中也發(fā)揮重要作用。有研究對活動性結核病患者B細胞中l(wèi)ncRNA表達譜進行了分析,發(fā)現lncRNA XLOC_012582與其臨近的編碼基因SOCS3呈協同表達,這與既往在CD8+T細胞中得到的結論類似,即異常表達的lncRNA與其周圍鄰近基因的異常表達呈現出一定的相關性[53, 57],推測這些lncRNA可能作為順式作用元件對其周圍的編碼基因發(fā)揮調控作用。

總之,雖然既往發(fā)表的研究已經發(fā)現并證實了一些在活動性結核病患者T細胞和B細胞中表達異常的lncRNA,結合生物信息學預測了其功能,但lncRNA在MTB感染后的宿主適應性免疫應答中的作用機制并未完全明確。因此,未來更進一步的研究也需要集中在參與活動性結核病發(fā)病過程中宿主適應性免疫相關的lncRNA具體功能和分子機制研究方面,以闡明lncRNA在抗MTB感染適應性免疫中的作用機制和途徑,同時也為結核病免疫治療提供理論基礎。

展 望

現階段結核病防治形勢仍然十分嚴峻。隨著lncRNA參與各類宿主免疫細胞介導MTB感染免疫應答的機制研究日益增多,證實lncRNA在炎癥、表觀遺傳修飾、代謝、自噬和凋亡等多方面發(fā)揮調控作用,提示lncRNA作為藥物開發(fā)靶點的潛在可行性。但MTB感染和結核病發(fā)病的免疫應答機制尚未完全闡明。隨著高通量技術的廣泛應用,更多的研究者發(fā)現包括miRNA、lncRNA和circRNA在內的多種非編碼RNA參與了MTB感染和結核病發(fā)病過程。但是,目前在結核病領域,有關lncRNA的機制研究主要集中在細胞水平的表型研究,現有的一些機制探討研究也多聚焦于ceRNA調控機制,對其他調控方式和作用機制的研究較少。此外,現有大部分研究主要關注lncRNA參與巨噬細胞介導的免疫應答的功能和機制,而對其參與其他固有免疫細胞應答或適應性免疫應答的研究比較缺乏。再者,基于目前有限的研究,尚不能揭示lncRNA對于染色質調控及其在抗MTB感染免疫應答中的全景調控網絡,提示對lncRNA在結核病中的具體作用及調控方式的認識還相當有限,未來需要進一步分析其在MTB感染和結核病發(fā)病中的作用,并解析具體的作用機制,明確其相互作用網絡。盡管如此,現有的研究表明,lncRNA有望作為輔助治療結核病的靶標,這為結核病治療新策略提供了新的方向和可能性。因此,靶向lncRNA的相關研究仍然需要繼續(xù)并更加深入,以期為研究結核病免疫治療和免疫預防提供靶點和理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻董靜：實施研究、起草文章;史雨婷：實施研究; 潘麗萍和張宗德：對文章的知識性內容作批評性審閱、指導