酶聯(lián)免疫吸附試驗在獸藥殘留檢測應(yīng)用中的體會

□文/李漢中

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是當(dāng)前應(yīng)用廣泛的一項定性/半定量檢測抗體（抗原）的免疫酶檢測技術(shù)。其基本原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，將待測物質(zhì)（違禁物或獸藥小分子）作為抗原與其特異性抗體反應(yīng)，再利用酶的高效催化性將此反應(yīng)效果放大，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，存在一定的線性相關(guān)關(guān)系，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。目前，已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測、生物毒素檢測、農(nóng)藥殘留檢測、微生物檢測、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測等多個領(lǐng)域。

ELISA 作為一種快速檢測方法由于其操作簡單，能得到定量檢測結(jié)果，廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域。與我們生活息息相關(guān)的肉、蛋、奶以及常見的水產(chǎn)品如魚，蝦中的違禁藥物，像大家熟知的“瘦肉精”“蘇丹紅”“三聚氰胺”“黃曲霉M1”以及常見的抗生素都有技術(shù)成熟的試劑盒。

本人從事獸藥殘留檢測多年，發(fā)現(xiàn)關(guān)于ELISA 的科學(xué)研究方面的文章比較多，本文著重討論多年來使用ELISA 檢測試劑盒進行獸藥殘留檢測的經(jīng)驗和教訓(xùn)，以期與各檢測單位一線工作者分享。

一、酶聯(lián)免疫吸附試驗的地位

酶聯(lián)免疫吸附試驗自20 世紀70 年代問世以來經(jīng)過了近幾十年的快速發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。雖然其有假陽性率高、反應(yīng)過程對外界環(huán)境要求較高、反應(yīng)時間較長（相對于膠體金快檢卡而言）等缺點，但由于其費用低廉、前處理簡單、儀器設(shè)備便于操作、結(jié)果定量化、安全性好、污染小，在今后相當(dāng)長的一段時間內(nèi)仍會在相關(guān)企業(yè)、基層檢測機構(gòu)扮演重要角色。

二、影響酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果的幾個方面

（一）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的選擇

由于酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理，因此不同企業(yè)生產(chǎn)的抗體的特異性，穩(wěn)定性的好壞對整個試劑盒的檢測結(jié)果影響較大。結(jié)合本人多年以來的工作經(jīng)驗而言，采購試劑盒時一定要慎重選擇其生產(chǎn)企業(yè)，要購買那些技術(shù)研發(fā)實力雄厚的企業(yè)的產(chǎn)品，建議可參考農(nóng)業(yè)部備案的廠家目錄。因其技術(shù)水平相對較高，產(chǎn)品相對較穩(wěn)定。十幾年前本人使用過一些不知名企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒，在使用過程中出現(xiàn)了假陽性率過高，標準曲線不成線性等問題。

（二）酶標儀的選擇

酶聯(lián)免疫吸附試驗除了用到檢測試劑盒之外，在整個試驗過程中還有一個重要的儀器設(shè)備那就是酶標儀。其用來測量加完終止液后酶標孔中液體的吸光度。利用其中某種物質(zhì)含量與其吸光度之間的函數(shù)關(guān)系，來反推待測物濃度，因此不同廠家、不同型號之間的質(zhì)量也存在差異，在選購之前要認真考慮。

（三）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用過程中需要注意的問題

1.樣品的前處理

一般來講酶聯(lián)免疫吸附試劑盒中待檢樣品的前處理需要經(jīng)過樣品稱量、目標物提取等步驟。具體操作就是在稱量好的樣品中加入某種試劑，振蕩混勻，然后離心，離心后有的直接取上清液若干量，再加上復(fù)溶工作液若干量，混勻后即可用于檢測；有的上清液需要再50～60℃氮氣吹干后，加入一定量的正己烷，混勻一定時間，再加入一定量的復(fù)溶工作液，混勻、振蕩、離心后取下層水相直接用于檢測。本人認為在這些環(huán)節(jié)中，樣品的稱量很關(guān)鍵，首先要根據(jù)稱量準確選擇精確度符合要求的天平。其次振蕩、離心這兩個環(huán)節(jié)對試驗結(jié)果也有影響，要認真規(guī)范操作，不可隨意縮短振蕩時間。

2.點板過程

酶聯(lián)免疫吸附試驗最主要的試驗操作就是點板，即使用單道移液器或多道移液器向試劑盒的96孔板的U 型孔中添加各種試劑。因此能否正確使用此器具對試驗結(jié)果是否準確至關(guān)重要。怎么保證其正確使用呢？首先，如果條件允許，最好定期找有資質(zhì)的機構(gòu)對其進行檢定或校準，保證其自身質(zhì)量沒問題。如果條件不允許可在使用前使用純水，電子天平，自檢一下使其風(fēng)險可控。其次要會正確使用。其常規(guī)的使用方法為“吸一打二”。其中的“一二”指的是移液器控制按鈕下壓的兩個檔位，下壓遇到阻力時為第1 檔，繼續(xù)加大力度壓至按不動為第2 檔，所謂的“吸一打二”就是指吸取液體的時候，用拇指按住頂端的控制按鈕至第1 檔，而向外釋放液體的時候用拇指按住頂端的控制按鈕至按不動為止。后來又有人提出了“吸二打一”的使用方法。要注意的是實際操作時，如果將移液器調(diào)至一固定量程，需要反復(fù)多吸幾次，只有在第一次吸取時是“吸二打一”，此后再吸再打時均是“吸一打一”。在這里還有一點需要注意，就是“吸二打一”的量程不能超過移液器的最大量程。舉例說明，如果移液器的量程為20～200 微升，如果采用“吸二打一”的吸取方式，最好吸取量不要超過100微升。因此洗板時不能采用“吸二打一”。個人認為無論是“吸一打二”還是“吸二打一”只要操作規(guī)范都可以準確量取。切忌使用過程中吸打動作太快，這樣容易引起吸取液體時，因為有氣泡可能導(dǎo)致液體接觸到移液器的頭部，污染液體，或釋放液體時太快，液體濺到目標U 型孔外面，影響試驗結(jié)果。當(dāng)吸取黏性較大，泡沫較多濃度較小的目標液時如酶標二抗工作液，抗體工作液、低濃度的標準品時可以考慮采用“吸二打一”的操作。當(dāng)吸取黏性較小的目標液體時，如底物A、底物B、動物尿液樣本，可以采用“吸一打二”的操作。因為整個試驗過程不可避免的要使用八道移液器，在此著重說一下八道移液器使用的注意事項。八道移液器使用過程中首先要確定每一個槍頭都安裝到位，擰緊了，其次要保證使用過程中槍頭要垂直懸空于目標微孔之上，盡量不要接觸微孔壁，再次一定要注意使用過程中觀察八個槍頭中的液面高度是否一致，如若差別太大，則證明吸量不準確，就會影響試驗結(jié)果，尤其是量取酶標二抗和抗體工作液以及洗板時要注意。

3.其他可能影響試驗結(jié)果的方面

整個檢測試劑盒內(nèi)的試劑，提前包被好抗原或抗體的96孔板，包括處理好的待檢樣品在點板之前一定要回復(fù)至室溫，實踐證明檢測過程中的環(huán)境溫度對結(jié)果影響較大，溫度不宜過低。所有試劑尤其是各個濃度的標準品、酶標二抗、抗體工作液、底物A、底物B 在使用前一定要混勻，混勻動作不可太粗暴，搖晃不可太劇烈，否則會產(chǎn)生大量氣泡，影響結(jié)果。

整個實驗過程一定要認真按照說明書的要求操作，不能靠記憶去操作。因為雖然原理一樣，但由于不同檢測項目用到的ELISA 有直接ELISA、間接ELISA、競爭ELISA 等區(qū)別，所以在點板過程中會存在一些差異，如酶標二抗和抗體工作液的添加順序，酶標二抗工作液的配制，底物A、底物B 的添加順序添加量，洗板次數(shù)，避光反應(yīng)時間長短等。

三、實驗結(jié)果的計算

很多酶標儀都帶有自己的計算軟件，但是96孔板的布板模式相對來說比較死板不夠靈活，就是說標準品和樣品的位置相對固定，不可以根據(jù)每一次實驗的實際情況靈活布板。因此，建議用酶標儀只進行吸光度的檢測，得到吸光度后，再利用專業(yè)的計算軟件去計算。

以上就是我作為一個長期使用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進行獸藥殘留檢測工作的一些經(jīng)驗、教訓(xùn)和體會，以便給使用試劑盒的工作人員提供參考，使大家少走彎路，得到準確的實驗結(jié)果。