劉宇昕 段清川 張杰

國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(北京 100045）

兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京 100045）

在毛細(xì)胞體系中，非哺乳動(dòng)物的毛細(xì)胞損傷死亡后可以再生，而哺乳動(dòng)物的毛細(xì)胞損傷后無(wú)法再生[1]，往往會(huì)造成聽(tīng)力障礙或永久性聽(tīng)力缺失，對(duì)于了解耳蝸毛細(xì)胞的發(fā)育、是否可以再生、再生機(jī)制、基因調(diào)控、是否存在靶點(diǎn)治療途徑，成為一直以來(lái)的熱點(diǎn)。已有研究顯示內(nèi)耳發(fā)育和毛細(xì)胞再生是由多條信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)，Wnt 信號(hào)通路、FGF 信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、BMP 信號(hào)通路等交互作用[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)ATOH1（Atonal homolog 1）在毛細(xì)胞損傷時(shí)表達(dá)上調(diào)[4]，受多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是其中最為活躍的基因，在多種器官中的細(xì)胞再生中都起著重要作用，但這種多通道性也使得ATOH1表達(dá)不夠?qū)Ｒ?，這種多通道調(diào)控表達(dá)模式仍需研究探討，本文就ATOH1與其他基因共同表達(dá)時(shí)的毛細(xì)胞再生進(jìn)展進(jìn)行討論。

1 ATOH1的多通道調(diào)控

ATOH1基因表達(dá)產(chǎn)物是一種螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，又叫作MATH1基因，1999年研究顯示胚胎ATOH1缺失小鼠未能產(chǎn)生耳蝸和前庭毛細(xì)胞，因此，ATOH1基因是毛細(xì)胞發(fā)生的必須基因[5]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)質(zhì)?；蛘呦俨《镜茸鳛檩d體的ATOH1過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)耳蝸感覺(jué)上皮和非感覺(jué)上皮的毛細(xì)胞再生[6-9]。在多個(gè)系統(tǒng)中，ATOH1都與細(xì)胞再生有關(guān)，結(jié)腸中Lgr5+干細(xì)胞損傷后，ATOH1分泌祖細(xì)胞不僅可以參與Lgr5+干細(xì)胞的生成來(lái)修復(fù)損傷的結(jié)腸，且能夠不依賴于Lgr5+干細(xì)胞生成途徑而促進(jìn)細(xì)胞再生恢復(fù)損傷的結(jié)腸[10]；而且ATOH1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)程中，在很多區(qū)域它的表達(dá)都很活躍，ATOH1缺失小鼠會(huì)缺乏某種有助于本體感覺(jué)和前庭、聽(tīng)力功能以及呼吸功能的某種表達(dá)因子，可能與Shh 信號(hào)、Notch 信號(hào)與ATOH1交叉調(diào)控有關(guān)[11，12]。ATOH1在機(jī)體的表達(dá)過(guò)程中是由多通道調(diào)控的，研究ATOH1在各個(gè)系統(tǒng)中的作用機(jī)制有助于研究ATOH1在毛細(xì)胞的表達(dá)及作用，為毛細(xì)胞再生提示新思路。

ATOH1在毛細(xì)胞發(fā)育分化中同樣受多種信號(hào)通路調(diào)控，例如BMP 信號(hào)通路、FGF 信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路等[13]。研究表明BMP 通路主要是通過(guò)調(diào)節(jié)IDS基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控ATOH1，IDS 蛋白與ATOH1表達(dá)的b-HLH 結(jié)合阻止功能二聚體的形成從而抑制ATOH1功能作用[14，15]。Notch信號(hào)通路則是通過(guò)抑制ATOH1的表達(dá)來(lái)阻止前體細(xì)胞分化為毛細(xì)胞，轉(zhuǎn)而分化為支持細(xì)胞。研究表明Hes/Hey 結(jié)合在ATOH1啟動(dòng)子上能及時(shí)抑制ATOH1的表達(dá),前體細(xì)胞最終向支持細(xì)胞方向分化[16]。腺病毒介導(dǎo)的ATOH1過(guò)度表達(dá)使大鼠小上皮嵴誘導(dǎo)異位毛細(xì)胞再生，但毛細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率低，而當(dāng)Notch 抑制劑DAPT 和ATOH1基因表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)降低Hes1和Hes5水平而增加ATOH1表達(dá)水平，使毛細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率較前增加，表明抑制Notch信號(hào)通路可增加前體細(xì)胞向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)導(dǎo)率[17]。Wnt信號(hào)通路和ATOH1協(xié)同作用，Wnt信號(hào)通路刺激能增加ATOH1基因的表達(dá)，當(dāng)Wnt 被抑制時(shí)，ATOH1表達(dá)水平下降[18]。而β-catenin 通過(guò)與其3'增強(qiáng)子結(jié)合，激活A(yù)TOH1的表達(dá)，并可進(jìn)一步被Wnt 途徑促進(jìn)，Wnt 信號(hào)存在時(shí)，β-catenin 積聚，而Notch 通路通過(guò)降低β-catenin，也可以降低ATOH1轉(zhuǎn)錄水平[19]。FGF信號(hào)通路可以通過(guò)激活MEKK4-ERK 通路來(lái)增加ATOH1基因的表達(dá)，且有文獻(xiàn)推測(cè)通過(guò)抑制LSD1使FGF信號(hào)通路中的信號(hào)分子下調(diào)從而抑制毛細(xì)胞再生[19,20]，多種信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控，信號(hào)通路之間相互調(diào)控的還需要更深入的研究，對(duì)毛細(xì)胞再生甚至耳聾的發(fā)生機(jī)制及治療都極為重要。

2 ATOH1 的相關(guān)調(diào)控因子相互作用調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育

ATOH1是毛細(xì)胞再生過(guò)程中必不可少的基因，過(guò)表達(dá)ATOH1可以產(chǎn)生毛細(xì)胞樣細(xì)胞，但毛細(xì)胞是一種具有接收機(jī)械信號(hào)并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的感覺(jué)細(xì)胞，因此，毛細(xì)胞再生需要具有機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通道功能的毛束再生且存活。目前的毛細(xì)胞再生研究大多都只是通過(guò)激活相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生毛細(xì)胞樣細(xì)胞，但卻不能接收淋巴液的機(jī)械刺激產(chǎn)生電信號(hào)，由于ATOH1的多通道調(diào)控機(jī)制，單一基因或途徑可以導(dǎo)致毛細(xì)胞的再生，但具有正常生理功能的毛細(xì)胞可能需要操縱多種基因和途徑的表達(dá)，目前對(duì)毛細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育重要的細(xì)胞通路和基因的研究仍需不斷深入，多種基因與ATOH1互相作用共同表達(dá)，可能是未來(lái)毛細(xì)胞再生治療感應(yīng)神經(jīng)性耳聾的重要手段。

2.1 ATOH1與E2F轉(zhuǎn)錄因子

已知非哺乳動(dòng)物在毛細(xì)胞損傷時(shí)可以產(chǎn)生新的毛細(xì)胞，這是由于前毛細(xì)胞Atoh1 激活再次表達(dá)[21]。之前的研究表明，ATOH1表達(dá)很大程度上依賴于兩種下游順式調(diào)節(jié)增強(qiáng)子，增強(qiáng)子A 和增強(qiáng)子B[22]。目前通過(guò)基因位點(diǎn)的比較分析，發(fā)現(xiàn)了之前推測(cè)的增強(qiáng)子C，其序列和位置在禽類中高度保守，但該序列目前未在小鼠和人類基因組中發(fā)現(xiàn)。通過(guò)結(jié)合生物信息學(xué)分析、EMSA 和報(bào)告基因分析，我們確定了ATOH1基因座與E2F（腺病毒早期基因2 結(jié)合因子）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之間的新相互作用，E2F 是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[23]。E2F1-3因子通過(guò)直接結(jié)合增強(qiáng)子C 內(nèi)的一個(gè)調(diào)節(jié)元件來(lái)使禽類的Atoh1 表達(dá)增加，并且在耳毒性誘導(dǎo)的毛細(xì)胞再生過(guò)程中E2F1 的核質(zhì)定位發(fā)生變化，這與Atoh1 的重新激活相一致，所以研究結(jié)果表明增強(qiáng)子C在毛細(xì)胞損傷后Atoh1表達(dá)重新激活毛細(xì)胞再生的過(guò)程中有著重要作用[24]?？赡苡捎诓溉閯?dòng)物中增強(qiáng)子C 的缺失，哺乳動(dòng)物該毛細(xì)胞ATOH1自主激活再生機(jī)制已喪失，所以未來(lái)是否可以通過(guò)改變哺乳動(dòng)物ATOH1激活表達(dá)的途徑來(lái)完成毛細(xì)胞再生是一可能治療方式。

2.2 ATOH1與Gfi1轉(zhuǎn)錄因子

獨(dú)立生長(zhǎng)因子1(growth factor independent 1,Gfi1)，一種已知對(duì)造血干細(xì)胞自我更新和植入重要的鋅轉(zhuǎn)錄阻遏物。GFI1 基因是ATOH1的下游靶點(diǎn)，也是POU4F3的下游靶點(diǎn)，POU4F3是另一個(gè)ATOH1調(diào)節(jié)的基因，對(duì)毛細(xì)胞的存活和成熟起著重要作用[6，25]。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞中同時(shí)過(guò)度表達(dá)Gfi1、Pou4f3和Atoh1可顯著誘導(dǎo)卵巢蛋白中毛細(xì)胞樣細(xì)胞的有效分化[26]。在內(nèi)耳，Gfi1 因子在ATOH1表達(dá)后不久在毛細(xì)胞中產(chǎn)生，是毛細(xì)胞正常發(fā)育存活所必需的因子。Gfi1 基因缺陷小鼠最初形成耳蝸毛細(xì)胞，但形成的毛細(xì)胞功能障礙，并最終死亡，這表明Gfi1 因子對(duì)毛細(xì)胞的存活很重要。雖然ATOH1是毛細(xì)胞再生過(guò)程中的必須基因，但其在成年哺乳動(dòng)物耳朵中的轉(zhuǎn)導(dǎo)率較低，且存活時(shí)間較短，所以嘗試通過(guò)補(bǔ)充Gfi1來(lái)促進(jìn)毛細(xì)胞的再生。在成熟的Pou4f3DTR小鼠中進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)注射白喉病毒進(jìn)行消融完全清除其毛細(xì)胞。耳蝸支持細(xì)胞中分別使用Atoh1或Atoh1+Gfi1的腺病毒表達(dá)誘導(dǎo)毛細(xì)胞樣細(xì)胞的出現(xiàn)，與Atoh1單獨(dú)表達(dá)相比，Atoh1+Gfi1表達(dá)在4周后新的毛細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)量增加6.2 倍，且能夠存活至8 周，在新生兒耳蝸外植體中的數(shù)量同樣增加[27]。因此，ATOH1和GFI1聯(lián)合誘導(dǎo)表達(dá)的新方法可能是成年哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞成功再生的重要進(jìn)展。

2.3 ATOH1與Ikzf2調(diào)節(jié)因子

Ikzf2(Helios)是外毛細(xì)胞基因的一個(gè)候選調(diào)節(jié)因子，Ikzf2 因子在內(nèi)毛細(xì)胞中的異位表達(dá)誘導(dǎo)了外毛細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，降低了典型內(nèi)毛細(xì)胞基因的表達(dá)，并賦予了內(nèi)毛細(xì)胞外毛細(xì)胞的電性，這表明Ikzf2 因子能夠部分地將內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組向外毛細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變[28]。之前的實(shí)驗(yàn)表明，可以通過(guò)分析細(xì)胞類型的特異性基因的啟動(dòng)子來(lái)發(fā)現(xiàn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，用以識(shí)別統(tǒng)計(jì)過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序[29]。通過(guò)對(duì)外毛細(xì)胞標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序分析最終發(fā)現(xiàn)只有Ikzf2 在外毛細(xì)胞中所有時(shí)間點(diǎn)均富集[30]。種種數(shù)據(jù)表明Ikzf2在外毛細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中都發(fā)揮著重要作用。在之前的研究中，從耳蝸支持細(xì)胞中再生新的外毛細(xì)胞均缺乏外毛細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白Prestin 的表達(dá)，Prestin 運(yùn)動(dòng)蛋白是外毛細(xì)胞功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而最新的研究報(bào)告成年小鼠耳蝸支持細(xì)胞通過(guò)同時(shí)誘導(dǎo)Atoh1 和Ikzf2 兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，成功轉(zhuǎn)化為有Prestin表達(dá)的外毛細(xì)胞樣細(xì)胞，成功建立了一種具有部分功能結(jié)構(gòu)的外毛細(xì)胞再生方法[31]。

2.4 ATOH1與BARHL1 3’增強(qiáng)子

Barhl1是果蠅BarH 類同源框基因的小鼠同源基因，在內(nèi)耳內(nèi)高度表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)聽(tīng)覺(jué)和平衡的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞的長(zhǎng)期維持至關(guān)重要[32]。BARHL1是ATOH1的直接靶基因，而其中BARHL13'增強(qiáng)子中的一個(gè)E 盒（E3）對(duì)ATOH1表達(dá)的b-HLH 介導(dǎo)的BARHL1激活至關(guān)重要。破壞E3位點(diǎn)，會(huì)導(dǎo)致BARHL1表達(dá)顯著缺失，誘導(dǎo)的毛細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)量顯著減少，但是對(duì)早期原始外胚層樣細(xì)胞和耳祖細(xì)胞的分化并沒(méi)有影響，所以研究證明對(duì)于體外毛細(xì)胞樣細(xì)胞再生、分化，BARHL13'增強(qiáng)子必不可少[33]。ATOH1通過(guò)與特定E3盒結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)BARHL1的表達(dá)，BARHL1作為ATOH1的下游基因，當(dāng)E3 盒基因突變時(shí)則會(huì)影響毛細(xì)胞的分化，研究相應(yīng)的耳聾發(fā)病機(jī)制能有效推進(jìn)治療研究進(jìn)展。

2.5 ATOH1與TUB、ZNF532轉(zhuǎn)錄因子

研究發(fā)現(xiàn)耳蝸外側(cè)大上皮嵴內(nèi)的Sox2+祖細(xì)胞進(jìn)行電穿孔感染，對(duì)細(xì)胞損傷小，用電穿孔方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染來(lái)研究ATOH1與其他基因共同表達(dá)時(shí)的HC 轉(zhuǎn)化效果可能更好[34]。Isl1 促進(jìn)HC 的轉(zhuǎn)化，而轉(zhuǎn)錄因子TUB、ZNF532是Isl1的下游靶點(diǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物，美國(guó)一項(xiàng)研究將Atoh1與在HC 中高度表達(dá)的16 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子單獨(dú)或共同進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，并在過(guò)程中不斷進(jìn)行電穿孔方法的優(yōu)化，測(cè)試電穿孔的電流和質(zhì)粒濃度，最終發(fā)現(xiàn)TUB、ZNF532 轉(zhuǎn)錄因子與Atoh1 基因產(chǎn)物被共同表達(dá)時(shí)會(huì)提高Atoh1的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，大上皮嵴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成毛細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)目明顯提升[35]。在今后的實(shí)驗(yàn)中可以采用電穿孔方式來(lái)研究ATOH1與多個(gè)相關(guān)基因的再生作用，可能轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用促進(jìn)ATOH1介導(dǎo)的HC轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

人類和其他哺乳類動(dòng)物均喪失了自我再生毛細(xì)胞的能力，臨床上毛細(xì)胞損傷最終會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的聽(tīng)力損傷。ATOH1是耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的一個(gè)重要基因。ATOH1與其他基因聯(lián)合表達(dá)來(lái)治療毛細(xì)胞損傷導(dǎo)致的感應(yīng)神經(jīng)性耳聾是一個(gè)值得研究的問(wèn)題?？梢詮牡鞍妆磉_(dá)層面分析毛細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)的活躍表達(dá)基因，但活躍基因與ATOH1共同表達(dá)未促進(jìn)HC轉(zhuǎn)化也可能是因?yàn)樵摶驗(yàn)槟匙饔没虻南掠伟悬c(diǎn)，所以可能要多個(gè)基因共同表達(dá)來(lái)研究相關(guān)基因在再生過(guò)程中的作用，然后聯(lián)合表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)化基因嘗試毛細(xì)胞再生，想得到完整且具有功能的毛細(xì)胞,仍是一個(gè)漫長(zhǎng)的研究過(guò)程。