黃芪多糖介導(dǎo)Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路促進(jìn)大鼠難愈創(chuàng)面的愈合

徐燕婷 李哲明 范麗娜

[摘要]?目的?研究黃芪多糖對(duì)創(chuàng)面難愈合大鼠創(chuàng)面的促愈合作用及對(duì)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear?factor erythroid?2?related?factor?2，Nrf2）-血紅素氧合酶1（heme?oxygenase-1，HO-1）/NADPH醌氧化還原酶1（NADPH?quinone?oxidoreductase?1，NQO1）信號(hào)通路表達(dá)的影響。方法?18只SD大鼠用于構(gòu)建慢性難愈合創(chuàng)面模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組、黃芪多糖組、京萬紅軟膏組，另6只大鼠納入空白對(duì)照組，藥物涂抹創(chuàng)面21d，期間分析大鼠創(chuàng)面愈合情況。蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠創(chuàng)面組織病理變化情況，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6水平；蛋白質(zhì)免疫印跡（Western?blot）檢測(cè)大鼠創(chuàng)面組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果?與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的創(chuàng)面組織病理改變明顯，血清SOD、GSH-Px活性下降，而MDA、TNF-α、IL-1β及IL-6水平上升（P<0.01），Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。與模型組相比，黃芪多糖組和京萬紅軟膏組大鼠治療第7、14、21d的創(chuàng)面愈合率均顯著提高，創(chuàng)面組織病理改變均明顯減輕，血清SOD與GSH-Px活性均提高，而MDA、TNF-α、IL-1β及IL-6水平均下降（P<0.01），Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05）。結(jié)論?黃芪多糖可通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)促進(jìn)大鼠難愈創(chuàng)面的愈合，并進(jìn)一步激活組織Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]?黃芪多糖；氧化應(yīng)激；炎癥；Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)]?R96??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.009

Astragalus?polysaccharide?mediates?Nrf2-HO-1/NQO1?signaling?pathway?to?promote?the?healing?of?refractory?wounds?in?rats

XU?Yanting1，?LI?Zheming2，?FAN?Lina3

1.Department?of?Pharmacy，?Hangzhou?Fuyang?Traditional?Chinese?Medicine?Orthopedic?Hospital，?Hangzhou?311400，?Zhejiang，?China;?2.Pharmacy?School?of?Hangzhou?Medical?College，?Hangzhou?310050，?Zhejiang，?China;?3.Department?of?Dermatology，?Yuhang?Maternal?and?Child?Health?Hospital?of?Hangzhou，?Hangzhou?311100，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?healing?promoting?effect?of?astragalus?polysaccharide?on?wound?in?rats?with?chronic?wound?healing?and?its?impact?on?nuclear?factor erythroid?2?related?factor?2?（Nrf2）-heme?oxygenase-1?（HO-1）/?NADPH?quinone?oxidoreductase?1?（NQO1）?pathway.?Methods?18?SD?rats?were?used?to?eatablish?chronic?refractory?wound?model，?then?rats?were?randomly?divided?into?model?group，?astragalus?polysaccharide?group，?and?Jingwanhong?ointment?group，?another?6?rats?were?divided?into?blank?control?group，?drug?applied?for?21?days?and?analyzed?wound?healing?rates?during?period.?Haematoxylin-eosin?staining?was?used?to?observe?the?pathological?changes?of?the?wound?tissue，?automatic?biochemical?analyzer?was?used?to?detect?serum?superoxide?dismutase?（SOD），?glutathione?peroxidase?（GSH-Px）?and?malondialdehyde?（MDA）?levels，?enzyme?linked?immunosorbent?assay?（ELISA）?was?used?to?detect?serum?tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α），?interleukin?（IL）-1β，?and?IL-6?levels，?and?Western?blot?was?used?to?detect?Nrf2，?HO-1，?NQO1?protein?expression?in?wound?tissue.?Results?Compared?to?blank?control?group，?the?pathological?changes?in?wound?tissue?of?model?group?rats?were?obvious，?serum?SOD?and?GSH-Px?activities?were?decreased，?the?MDA，?TNF-α，?IL-1β?and?IL-6?levels?were?increased?（P<0.01），?protein?expression?of?Nrf2，?HO-1，?NQO1?were?increased?（P<0.05）.?Compared?to?the?model?group，?the?healing?rates?of?astragalus?polysaccharide?group?and?Jingwanhong?ointment?group?were?significantly?increased?on?7，?14，?21?days，?the?pathological?changes?of?wound?tissue?were?remarkably?alleviated，?serum?SOD?and?GSH-Px?activities?were?increased，?while?the?levels?of?MDA，?TNF-α，?IL-1β?and?IL-6?decreased?（P<0.01），?protein?expression?of?Nrf2，?NQO1，?HO-1?were?increased?（P<0.05）.?Conclusion?Astragalus?polysaccharide?promoted?the?healing?of?refractory?wounds?in?rats?by?inhibiting?oxidative?stress?and?inflammation，?and?further?activated?the?expression?of?Nrf2-HO-1/NQO1?signaling?pathway?in?tissue.

[Key?words]?Astragalus?polysaccharide;?Oxidative?stress;?Inflammation;?Nrf2-HO-1/NQO1?signaling?pathway

慢性難愈合創(chuàng)傷可由多種急、慢性創(chuàng)傷等經(jīng)久不愈所致，并具有合并復(fù)雜基礎(chǔ)疾病的特點(diǎn)，是臨床治療過程中急需關(guān)注的棘手難題[1-2]。目前，慢性創(chuàng)面的治療方式有藥物治療、手術(shù)清創(chuàng)聯(lián)合引流及各類細(xì)胞生長(zhǎng)因子制劑治療等[3-4]。慢性創(chuàng)面治療所面臨的長(zhǎng)期復(fù)雜療程和昂貴費(fèi)用會(huì)對(duì)患者的生理、心理和家庭經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重影響，因此尋求簡(jiǎn)單、有效的治療藥物對(duì)患者具有積極意義。

中醫(yī)利用中藥方劑治療皮膚創(chuàng)傷由來已久，中藥效用成分能通過改善創(chuàng)面微環(huán)境，達(dá)到祛腐生肌、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果，具有方便、有效的優(yōu)點(diǎn)[5]。中藥黃芪（Astragalus?membranaceus）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其功效以排膿治癰為主，可用于治療瘡瘍久潰[6]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，可通過降低炎癥因子水平，起到改善組織損傷的作用[7-9]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear?factor erythroid?2?related?factor?2，Nrf2）-血紅素氧合酶1（heme?oxygenase-1，HO-1）/NADPH醌氧化還原酶1（NADPH?quinone?oxidoreductase?1，NQO1）信號(hào)通路可通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮創(chuàng)面的促愈合作用[10]。本研究通過建立慢性難愈合創(chuàng)傷大鼠模型，探究黃芪多糖對(duì)難愈創(chuàng)面的改善作用及對(duì)Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1??材料及方法

1.1??實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠24只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0008]，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動(dòng)物中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2020-0024]，飼養(yǎng)環(huán)境室溫（22±2）°C，相對(duì)濕度50%～75%。實(shí)驗(yàn)經(jīng)杭州鷹旸生物醫(yī)藥研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過（倫理審批號(hào)：EYOUNG-20210304-02）。

1.2??實(shí)驗(yàn)試劑

黃芪多糖（生產(chǎn)單位：上海源葉生物科技公司，生產(chǎn)批號(hào)：H15J52S137204，規(guī)格：25g、純度60%），京萬紅軟膏（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z12020440，生產(chǎn)單位：天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)，規(guī)格：50g/支），蘇木精–伊紅染液（生產(chǎn)單位：武漢塞維爾生物科技公司，生產(chǎn)批號(hào)：202012），BCA蛋白定量試劑盒（生產(chǎn)單位：北京索萊寶科技公司，生產(chǎn)批號(hào)：20201226），Nrf2、HO-1、NQO1（生產(chǎn)單位：美國(guó)Affinity抗體公司，生產(chǎn)批號(hào)：86e7450、24l5591、12C5034），大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）試劑盒（生產(chǎn)單位：江蘇酶免公司，生產(chǎn)批號(hào)：202101、202103、202101）。

1.3??實(shí)驗(yàn)儀器

Nikon?Eclipse?E100型正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），610020-9Q型化學(xué)發(fā)光儀（上海勤翔公司），CMaxPlus酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司），C16000型全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（美國(guó)雅培公司），Image-ProPlus（IPP）6.0圖像分析軟件。

1.4??慢性難愈創(chuàng)傷大鼠造模和實(shí)驗(yàn)分組

24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、黃芪多糖組和京萬紅軟膏組，每組6只。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，在無菌環(huán)境下剃毛，裸露脊柱兩側(cè)腰椎部位皮膚，標(biāo)記1.5cm直徑的造模區(qū)域。除空白對(duì)照組大鼠外，其余組大鼠根據(jù)標(biāo)記部位制備直達(dá)筋膜的開放性傷口，并注射醋酸氫化可的松（6mg/100g）建立慢性難愈合創(chuàng)面模型[11]。

1.5??藥物制備及給藥

在完成造模給藥前，觀察造模大鼠創(chuàng)面?zhèn)?，?duì)已有愈合跡象的傷口進(jìn)行輕度撕裂，防止實(shí)驗(yàn)開始前傷口已出現(xiàn)愈合。根據(jù)分組對(duì)大鼠傷口涂抹藥物：黃芪多糖組在創(chuàng)面部位涂抹0.5g黃芪多糖藥物（藥物成分：黃芪多糖∶凡士林∶十二烷基硫酸鈉∶水=2∶60∶2∶65）；京萬紅軟膏組在創(chuàng)面部位給予京萬紅軟膏涂抹（0.6g）；模型組大鼠在創(chuàng)面部位涂抹等量凡士林（成分：生理鹽水∶凡士林∶十二烷基硫酸鈉∶水=2∶60∶2∶65）；空白對(duì)照組則在剃毛部位給予等量生理鹽水涂抹。每天給藥1次，連續(xù)3周。

1.6??大鼠創(chuàng)面愈合情況分析

給藥期間于7、14、21d，用IPP?6.0圖像分析軟件分析大鼠的創(chuàng)傷面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。

1.7??血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

給藥結(jié)束24h后，二氧化碳安樂死大鼠，采集血樣分離得到血清。全自動(dòng)生物化學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.8??血清炎性細(xì)胞因子檢測(cè)

取大鼠的血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作，測(cè)定TNF-α、IL-1β與IL-6含量。

1.9??蘇木精-伊紅染色

切取大鼠創(chuàng)面組織皮膚置入4%多聚甲醛溶液中固定，在脫水、包埋、切片后用蘇木精–伊紅染色，脫水并用中性樹脂封固后，顯微鏡觀察組織病理改變和各類炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.10??Western?blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

100mg大鼠創(chuàng)面組織樣品，勻碎提取組織蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)膜，清洗。封閉后，加入含Nrf2、NQO1、HO-1抗體的稀釋液，4℃孵育過夜。吸棄一抗，清洗，加二抗，室溫下?lián)u床振蕩反應(yīng)1～2?h，清洗。以β-actin蛋白為內(nèi)參，用化學(xué)發(fā)光儀顯影，chemi?capture軟件分析圖像，測(cè)定各組大鼠創(chuàng)面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD分析。方差不齊者采用Kruskal-?Wallis?H檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??黃芪多糖對(duì)創(chuàng)面難愈合大鼠創(chuàng)面愈合的影響

各組大鼠的創(chuàng)面隨時(shí)間逐漸愈合，愈合率逐漸升高。在給藥的7、14、21d，黃芪多糖組與京萬紅軟膏組大鼠傷口愈合率均顯著高于模型組（P<0.01），見圖1。

2.2??黃芪多糖對(duì)創(chuàng)面難愈合大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中的SOD、GSH-Px活性顯著下降（P<0.01），MDA含量顯著上升（P<0.01）。與模型組相比，黃芪多糖和京萬紅軟膏組大鼠的SOD、GSH-Px活性顯著上升（P<0.01），MDA含量顯著降低（P<0.01），見圖2。

2.3??黃芪多糖對(duì)創(chuàng)面難愈合大鼠創(chuàng)面組織病理變化的影響

空白對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常。模型組大鼠創(chuàng)面組織出現(xiàn)紅腫炎癥，各類炎性細(xì)胞聚集明顯（圖3箭頭），形成的新生肉芽組織較薄。與模型組相比，黃芪多糖組和京萬紅軟膏組大鼠創(chuàng)面組織的紅腫程度明顯減輕，少量炎性細(xì)胞聚集（圖3箭頭），新生肉芽組織形成較良好，見圖3。

2.4??黃芪多糖對(duì)創(chuàng)面難愈合大鼠炎癥反應(yīng)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠血清的TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著增加（P<0.01）；與模型組相比，黃芪多糖組與京萬紅軟膏組大鼠血清中的TNF-α、IL-1β與IL-6含量顯著降低（P<0.01），見圖4。

2.5??黃芪多糖對(duì)創(chuàng)面難愈合大鼠創(chuàng)面組織中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組和京萬紅軟膏組大鼠創(chuàng)面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見圖5。

3??討論

皮膚創(chuàng)傷愈合是體內(nèi)及組織中許多因子發(fā)生相應(yīng)調(diào)節(jié)、修復(fù)損傷組織的過程[12]。損傷后創(chuàng)面愈合可分為止血后炎癥、增殖及組織重塑三個(gè)階段。在愈合微環(huán)境改變的過程中，損傷刺激持續(xù)存在、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)增加均能影響創(chuàng)面的正常愈合，導(dǎo)致創(chuàng)面難愈[10]。炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面損傷最重要的反應(yīng)，過度炎癥反應(yīng)可激發(fā)細(xì)胞進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，干擾創(chuàng)面修復(fù)[13]。

大量研究表明，中藥外用制劑可通過調(diào)控細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合[1]；黃芪多糖可通過下調(diào)重癥燒傷患者全身炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平促進(jìn)創(chuàng)面愈合[7]。SOD、GSH-Px是存儲(chǔ)于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化酶，兩者發(fā)揮清除自由基、保護(hù)組織的作用；而MDA為脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，在創(chuàng)面組織中水平增高[14-15]。本研究結(jié)果顯示，黃芪多糖可顯著降低MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高創(chuàng)面難愈大鼠血清的SOD、GSH-Px活性，提示黃芪多糖具有抑制慢性創(chuàng)面難愈大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的作用，同時(shí)大鼠使用黃芪多糖后的第7、14、21d創(chuàng)面愈合率均顯著升高，損傷組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低，新生肉芽組織增生增加，提示黃芪多糖通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)促進(jìn)大鼠難愈創(chuàng)面的愈合。

Nrf2的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞抗氧化酶的分泌及活性，且研究發(fā)現(xiàn)Nrf2相關(guān)通路的激活可減輕急性損傷引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[13，16-18]。研究顯示Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路激活可增強(qiáng)糖尿病小鼠潰瘍皮膚的抗氧化功能并減弱炎癥反應(yīng)，提示其對(duì)傷口愈合具有積極作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠難愈創(chuàng)面組織的Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，而黃芪多糖則能進(jìn)一步促進(jìn)大鼠創(chuàng)面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)水平，推測(cè)黃芪多糖通過促進(jìn)Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)，抑制創(chuàng)面氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)大鼠難愈創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示外用黃芪多糖對(duì)創(chuàng)面難愈合大鼠的創(chuàng)面愈合起促進(jìn)作用，其作用可能是通過促進(jìn)Nrf2-HO-1/NQO1信號(hào)通路表達(dá)，上調(diào)氧活性、下調(diào)炎癥因子水平實(shí)現(xiàn)。

[參考文獻(xiàn)][1] 楊露，?張永萍，?彭麗華.?中藥及其外用制劑調(diào)控細(xì)胞因子促創(chuàng)面愈合的研究進(jìn)展[J].?中國(guó)中藥雜志，?2021，?46（20）：?5173–5184.