葡萄酒中生物胺的研究進(jìn)展

史學(xué)容，宋育陽,2,3，秦 義,2,3，劉延琳,2,3,*，姜 嬌,2,3,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西省葡萄與葡萄工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗(yàn)示范站，寧夏 永寧 750104）

葡萄酒口感復(fù)雜多樣，香氣優(yōu)雅濃郁，備受消費(fèi)者的青睞。其中微生物在葡萄酒質(zhì)量風(fēng)格塑造中發(fā)揮著極其重要的作用，如果發(fā)酵控制不當(dāng)，則會產(chǎn)生威脅葡萄酒飲用安全的不良代謝物，其長期過量攝入可能會觸發(fā)相關(guān)疾病。葡萄酒中不良代謝物主要包括氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）、生物胺（biogenic amines，BA）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）等[1]。近年來，葡萄酒的質(zhì)量安全問題逐漸成為食品行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)，我國先后出臺了GB 5009.223—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測定》[2]、GB 5009.208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》[3]、GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[4]3 項(xiàng)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，對葡萄酒等發(fā)酵食品中的EC、BA及OTA含量進(jìn)行了限定。

BA是一類含氨基的有機(jī)低分子化合物的總稱。微量的BA是生物體內(nèi)的正常活性成分，在活細(xì)胞中具有重要的生理功能，具備清除自由基等代謝活力，但過量攝入則會引起頭疼、腹部痙攣、嘔吐等不良生理反應(yīng)[5]。BA還是一些有害物質(zhì)的前體，如腐胺和尸胺與亞硝酸鹽反應(yīng)后會生成強(qiáng)致癌物亞硝胺，此外，精胺、亞精胺和胍丁胺等BA作為致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，超量攝入也可能會危及生命[6]。在葡萄酒釀造過程中，部分微生物具有較強(qiáng)的氨基酸脫羧酶（BA生物合成的關(guān)鍵酶）活性，會增加BA的積累及葡萄酒飲用風(fēng)險(xiǎn)[7]。盡管人體內(nèi)本身存在解毒酶系，可有效降解部分的BA，但葡萄酒的特殊環(huán)境及某些BA能削弱這些酶的功效。如有研究表明，胺氧化酶（amine oxidase，AOs）作為BA代謝中的關(guān)鍵酶，能夠?qū)A分解成相對安全的醛、氨氣和過氧化氫[8]，從而實(shí)現(xiàn)對BA的生物降解，以緩解其大量積累對機(jī)體帶來的毒害。其活性會受到乙醇、多酚或SO2的限制，隨著乙醇發(fā)酵（alcohol fermentation，AF）的進(jìn)行，高乙醇體積分?jǐn)?shù)會強(qiáng)烈抑制AOs的活性，體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇可抑制91% AOs的活性[7]，而葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)普遍在13%以上，這不僅增加了葡萄酒中BA降解的難度，還顯著增強(qiáng)了BA的毒性。腐胺和尸胺會抑制組胺的降解酶，從而增強(qiáng)其毒性，酪胺和色胺分別會影響單胺氧化酶和雙胺氧化酶的活性，β-苯乙胺會抑制雙胺氧化酶及組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)[9]。因此，對葡萄酒中BA含量的限定較其他發(fā)酵食品更為嚴(yán)苛，BA也成為了葡萄酒領(lǐng)域長期以來關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

近年來，我國雖加強(qiáng)了對葡萄酒中BA檢測方法和形成機(jī)理等方面的研究，但由于起步較晚，相關(guān)基礎(chǔ)性研究和風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)尚不完善。2013年，李志軍等[10]利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對國內(nèi)消費(fèi)市場葡萄酒中BA水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明國產(chǎn)及進(jìn)口葡萄酒中BA含量均較低，具有良好的安全性。3 年后該團(tuán)隊(duì)又對來自北京、天津、河北等20 個省市及產(chǎn)區(qū)的250 款國產(chǎn)葡萄酒產(chǎn)品中BA組成和含量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，全部葡萄酒樣品中的8 種BA含量均符合食品安全要求，具有較高的飲用安全性[11]。王瑞等[12]利用HPLC法對新疆天山北麓、焉耆盆地、吐哈盆地及伊犁河谷四大優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)60 個葡萄酒樣品中的總BA含量及8 種BA組分的含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)4 個產(chǎn)區(qū)的葡萄酒均具有較高安全性。同年，Ke Runhui等[13]對我國市售的456 個葡萄酒樣品進(jìn)行抽查分析，發(fā)現(xiàn)組胺的檢出率為59%，檢測值范圍為0～22 mg/L；酪胺的檢出率為89%，最高檢測含量21 mg/L；腐胺檢出率高達(dá)98.5%，這表明我國市售葡萄酒中仍存在BA含量超出國外標(biāo)準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)。2020年，劉睿等[14]利用HPLC法對國內(nèi)外葡萄酒中的9 種BA含量進(jìn)行檢測分析，也發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)葡萄酒中BA含量較國外稍高。因此，準(zhǔn)確分析及掌握葡萄酒中BA的組成和含量，對葡萄酒中各BA限量進(jìn)行進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)評估，能夠?yàn)榻窈笸晟破咸丫浦蠦A限量和管控葡萄酒質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 葡萄酒中主要的BA

目前葡萄酒中檢測出的BA共20余種，包括腐胺、組胺、酪胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺、甲胺、乙胺、異戊胺等[15]，其中組胺、酪胺和腐胺含量最高，相關(guān)研究也最為廣泛[13]。組胺是葡萄酒中公認(rèn)毒性最強(qiáng)的BA，許多國家對葡萄酒中組胺的含量已有明確限定（表1），其中德國和荷蘭最為嚴(yán)苛，限量為2 mg/L[16]。我國尚未明確對葡萄酒中BA的限量要求。在葡萄酒中，酪胺能促進(jìn)體內(nèi)去甲腎上腺素的釋放，其毒性僅次于組胺。適量的酪胺經(jīng)腸道吸收后被單胺氧化酶氧化和分解，過多攝入則會造成積累，從而引起偏頭痛等不良反應(yīng)[17]。腐胺是葡萄酒中最普遍存在的BA，幾乎在所有葡萄酒中都能夠檢測到，雖然其毒性較組胺而言更低，但其能抑制相關(guān)AOs活性，減少AOs對組胺、酪胺的分解，導(dǎo)致組胺和酪胺含量積累、毒性增強(qiáng)[18]。因此，腐胺的大量積累也會對機(jī)體造成間接損害，引起不適。同腐胺一樣，尸胺、精胺、亞精胺等BA盡管沒有直接毒性作用，但在一定條件下，它們的存在也能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)積累致癌物質(zhì)亞硝基胺[6]。因此，嚴(yán)格控制葡萄酒中BA種類與含量對于釀造健康的高品質(zhì)葡萄酒具有積極的作用。

表1 不同國家組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)[14]Table 1 Limits of histamine in different countries[14]

2 葡萄酒中BA的來源

葡萄酒中的BA主要來源于發(fā)酵過程中微生物的代謝[19]，微生物產(chǎn)生的底物特異性脫羧酶能催化相應(yīng)的前體氨基酸合成BA。這些前體氨基酸既可能來源于葡萄漿果[20]，又可能通過微生物在自身溶解酶的作用下釋放產(chǎn)生[21]。因此，葡萄酒中BA含量主要取決于原料中前體氨基酸含量組成及微生物對其的代謝能力[22]。此外，還有少數(shù)BA在葡萄生長過程中因應(yīng)對氮過量或缺乏等環(huán)境而產(chǎn)生，隨機(jī)械處理（除梗、破碎）后的原料進(jìn)入葡萄酒中。如葡萄酒中被廣泛報(bào)道的組胺、腐胺和酪胺，以及甲胺、乙胺、苯乙胺、異戊胺和尸胺均少量存在于葡萄汁（醪）中[23]。葡萄酒中BA信息及其來源總結(jié)見表2。

表2 葡萄酒中BA信息及其來源Table 2 Information and sources of BA in wine

3 葡萄酒中主要BA的生成及其調(diào)控機(jī)制

BA作為生理活性物質(zhì)，其合成及代謝受到嚴(yán)密調(diào)控，在生物體內(nèi)維持在微量水平，但在特殊刺激條件下，部分微生物會代謝合成大量BA，具有較高的風(fēng)險(xiǎn)。因此，掌握葡萄酒中BA的形成原因和合成代謝機(jī)理有助于更好地監(jiān)控葡萄酒中BA含量，為葡萄酒的飲用質(zhì)量提供保障。相關(guān)研究表明，微生物生成BA的主要原因有3 點(diǎn)：一是具有脫羧能力的微生物在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)及酸脅迫下，會代謝產(chǎn)生堿性的BA，改變基質(zhì)pH值以適應(yīng)環(huán)境，維持自身生長繁殖[24]；二是當(dāng)基質(zhì)中缺乏碳源時，氨基酸脫羧反應(yīng)和氨基酸/對應(yīng)胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)能產(chǎn)生質(zhì)子動力，為微生物代謝提供能量[25]；三是氮代謝物阻遏效應(yīng)的發(fā)生，即微生物優(yōu)先利用的氮源及其代謝產(chǎn)物能阻遏非優(yōu)先利用氮源相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，或從轉(zhuǎn)錄水平上抑制某些酶類的生成，使得次級氮源大量積累，只能代謝合成BA、EC等含氮的有害物質(zhì)[26]。

在葡萄酒釀造過程中，微生物合成、降解BA主要經(jīng)歷4 種酶反應(yīng)：1）脫羧；2）轉(zhuǎn)氨基；3）還原胺化；4）某些前體氨基化合物的降解[27]。脫羧作用為葡萄酒中BA的主要合成途徑，即相應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將前體氨基酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞基質(zhì)中，經(jīng)氨基酸脫羧酶脫羧后形成BA，最后再由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接分泌至胞外或經(jīng)胺氧化酶氧化為醛類，醛類物質(zhì)經(jīng)脫氫氧化后形成對應(yīng)酸，最后分解為CO2和H2O釋放到細(xì)胞外[25]。值得注意的是，脫羧途徑中前體氨基酸的吸收和產(chǎn)物的釋放屬于耦合反應(yīng)。組胺、酪胺和腐胺為葡萄酒中最主要的BA，分別由組氨酸脫羧酶（histidinede carboxylase，HDC）、酪氨酸脫羧酶（tyraminede carboxylase，TDC）、鳥氨酸脫羧酶（ornithinede carboxylase，ODC）催化相應(yīng)的前體氨基酸代謝產(chǎn)生，這3 種脫羧酶分別由組氨酸脫羧酶基因（hdc）、酪氨酸脫羧酶基因（tdc）和鳥氨酸脫羧酶基因（odc）編碼[28]。目前已發(fā)現(xiàn)具有hdc[29]、odc[30]、tdc[23]基因的乳酸菌在進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）時會增加酒液中組胺、酪胺和腐胺積累的風(fēng)險(xiǎn)。其中，有研究發(fā)現(xiàn)部分含有tdc基因的Oenococcus oeni不僅可以產(chǎn)生酪胺，還可以產(chǎn)生苯乙胺[31]。因此，準(zhǔn)確掌握BA的合成、降解途徑為利用生物手段控制葡萄酒中BA含量提供了理論依據(jù)。

組氨酸的脫羧過程是由組氨酸/組胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HdcP基因編碼）、HDC（HdcA基因編碼）和氨酰-tRNA合成酶（HdcRs基因編碼）3 個蛋白共同完成的[32]。胞外組氨酸經(jīng)過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)，在HDC作用下轉(zhuǎn)變成組胺，再隨組氨酸/組胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌至胞外。HDC作為目前關(guān)于組胺研究較為深入的酶，根據(jù)其輔酶的差異，可分為丙酮酰和磷酸吡哆醛依賴型兩類。與后者相比，前者具備無需外源輔助因子且高催化特異性的優(yōu)勢，且兩者在催化過程中均會發(fā)生底物依賴性失活現(xiàn)象[33]。真核細(xì)胞和革蘭氏陽性菌多以磷酸吡哆醛為輔酶；革蘭氏陰性菌多以丙酮酰為輔基[34]。此外，由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與的攝取底物和分泌產(chǎn)物是一個偶聯(lián)的過程，即氨基酸由胞外進(jìn)入到胞內(nèi)和相應(yīng)的BA分泌到胞內(nèi)是同時進(jìn)行的[35]。HDC的最適pH值為4.8，葡萄酒中L-乳酸也會抑制HDC的活性，相關(guān)研究表明，在葡萄酒中2 g/L的L-乳酸能抑制22%的HDC活性[36]。研究人員在比對了Raoultella planticola、Morganella morganill、Pseudomonas fluorescens中HDC蛋白的氨基酸序列后，設(shè)計(jì)了可用于多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）且特異性高的引物對106/107[37]，以檢測微生物是否具備合成BA的能力。作為葡萄酒中毒性最強(qiáng)的BA，組胺有3 種降解途徑：其既能在HDC催化下降解為乙醛和氨；也能在二胺氧化酶的作用下形成咪唑乙酸；除此之外，還可通過甲基化形成甲基組胺，經(jīng)胺氧化酶氧化形成醛，脫氫后形成相應(yīng)的酸[38]。

與組氨酸類似，酪氨酸的脫羧過程由TDC（tdc基因編碼）、酪胺酰-tRNA合成酶（tyrS基因編碼）與酪氨酸/酪胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（tyrP基因編碼）多個酶共同合作完成[8]。2002年研究人員首次確定了原核生物中的基因位點(diǎn)，并從Lactobacillus brevisIOEB 9809[39]和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）[40]中部分純化和表征得到了TDC。相關(guān)研究表明在tyrP上游存在一個能編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（nhaC-2）的開放閱讀框[41]。Coton等[42]設(shè)計(jì)了用于基因間隔序列PCR（internal transcript space-PCR，ITS-PCR）的TDrc1/TDrc2、TDrcl/TyrS2及用于常規(guī)PCR的TD5/TD2等引物檢測Carnobacterium divergens508中潛在編碼TDC的基因。在TDC催化下合成酪胺的降解途徑為：胺氧化酶催化酪胺降解為對羥基苯乙醛，對羥基苯乙醛氧化后形成對羥基苯乙酸[43]。

食品中腐胺的合成途徑有3 條：除精氨酸在精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）（speA編碼）作用下形成胍基丁胺，再由胍基丁胺酶（speB編碼）分解為尿素和腐胺[44]；精氨酸在精氨酸脫亞胺酶催化下脫亞胺產(chǎn)生瓜氨酸和氨，瓜氨酸又在轉(zhuǎn)氨甲酰酶的催化下得到N-氨甲酰腐胺，后轉(zhuǎn)化為腐胺[45]；瓜氨酸在鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的作用下降解為氨基甲酰磷酸和鳥氨酸，在ODC作用下合成腐胺（ADI途徑）[46]。無論是ADI途徑還是脫羧途徑，均涉及α-氨基甲酸激酶催化氨基甲酰磷酸鹽產(chǎn)生ATP、CO2和NH3[46]。不同的是，脫羧途徑是通過產(chǎn)生質(zhì)子動力堿化細(xì)胞質(zhì)，而ADI途徑以ATP的形式代謝能量并產(chǎn)生氨，二者均能實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞質(zhì)pH值的控制[47]。2008年，Liu Xiaoyan等[48]在Escherichia coliBL21中表達(dá)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的speA基因序列，對得到的speA蛋白晶體進(jìn)行X射線衍射，以確定ADC的三維結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步闡明其催化機(jī)理。劉艷敏等[49]對克隆得到B.subtilisBJ3-2的speA基因進(jìn)行序列對比后，證實(shí)了其編碼的蛋白為典型的III型磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）依賴型鳥氨酸/賴氨酸/ADC。需要明確的是，雖然在大多數(shù)發(fā)酵食品中腐胺既可在ODC作用下催化生成，也能通過胍氨酸脫亞胺酶（agmatine deiminase，AgDI）途徑合成，但在葡萄酒中尚鮮有報(bào)道依賴AgDI途徑產(chǎn)生腐胺。

葡萄酒中尸胺是賴氨酸在LDC的催化下脫羧得到的。賴氨酸脫羧途徑由編碼賴氨酸脫羧酶的cadA、編碼賴氨酸/尸胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cadB、調(diào)控基因cadC共同組成，并由cad基因座控制。其中cadC受到外界pH值和賴氨酸濃度的誘導(dǎo)，能夠調(diào)控cadA及cadB共同組成的cadBA操縱子的表達(dá)[50]。Kikuchi[51]和唐雪[52]等分別在E.coli和B.subtilis中發(fā)現(xiàn)了編碼LDC的ldc和yaaO基因。尸胺在AOs及脫氫酶的分別作用下最終降解為CO2和H2O排出體外[53]。色胺的合成和降解途徑與尸胺相似，即色氨酸在色氨酸脫羧酶的作用下合成色胺，在胺氧化酶的作用下形成吲哚乙醛，再經(jīng)氧化形成吲哚乙酸，后降解為CO2和H2O（圖1）。

圖1 葡萄酒中BA的合成及降解途徑Fig.1 Synthesis and degradation pathways of BA in wine

精胺和亞精胺的形成過程相對復(fù)雜，涉及到多重反應(yīng)。亞精胺的合成主要有兩條分支：精氨酸先經(jīng)speA編碼的ADC催化合成胍基丁胺，再在胍基丁胺脲水解酶（speB編碼）的催化下合成腐胺，腐胺在亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）（sms編碼）的作用下生成亞精胺，亞精胺在精胺合成酶的作用下形成精胺[54]，同時精胺在精胺氧化酶（spermine oxidase，SMO）的作用下轉(zhuǎn)變成亞精胺，亞精胺與精胺間的轉(zhuǎn)化是可逆的[55]。此外，L-甲硫氨酸和ATP在S-腺苷甲硫氨酸合成酶的催化下合成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosine methionine，SAM）。SAM作為氨丙基供體，經(jīng)S-腺苷蛋氨酸脫羧酶（speD編碼）脫羧后與腐胺結(jié)合，分別在SPDS和SMO的催化下形成精胺和亞精胺[55]。其中主要限速酶S-腺苷蛋氨酸脫羧酶只有結(jié)合了輔因子丙酮酰才具備催化活性。精胺和亞精胺通過反向轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行分解代謝，該途徑的分解酶主要有亞精胺/精胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶（spermineN-acetyltransferase，SSAT）、N-乙酰基多胺氧化酶（N-polyamine acetyl oxidase，PAOX/PAO）和精胺氧化酶（spermine oxidase，SMOX/SMO）。即亞精胺/亞精胺在SSAT和PAOX/PAO的共同作用下將精胺轉(zhuǎn)化為亞精胺，隨后將亞精胺轉(zhuǎn)化為腐胺[56]。同時，精胺在SMOX/SMO誘導(dǎo)下能夠直接轉(zhuǎn)化為亞精胺[57]、H2O2及3-乙酰氨基丙醛等，過氧化氫酶會迅速降解H2O2[57]。其中SSAT為分解代謝途徑的主要限速酶。

由此可見，BA的合成較為復(fù)雜，不僅涉及多個基因及操縱子的表達(dá)與調(diào)控，脫羧酶、胺氧化酶及脫氫酶等也起到十分關(guān)鍵的作用（圖1）。然而目前研究對葡萄酒中氨基酸脫羧酶的報(bào)道僅涉及個別關(guān)鍵基因，對于其在葡萄酒微生物中的研究還不夠深入和全面。

4 葡萄酒中參與合成BA的微生物

BA含量對葡萄酒的品質(zhì)及質(zhì)量安全的控制具有重要影響，因此，準(zhǔn)確了解葡萄酒中產(chǎn)生BA的微生物菌群及其分子檢測方法對科學(xué)監(jiān)控葡萄酒中BA的含量具有重要的指導(dǎo)意義。目前關(guān)于參與合成BA的葡萄酒微生物仍存在一定爭議，但葡萄酒中BA的產(chǎn)生與發(fā)酵微生物脫羧酶基因的存在與否具有較強(qiáng)的相關(guān)性，一般不含hdc、tdc和odc基因的菌株不具備產(chǎn)生組胺、酪胺、腐胺的能力，具有較高的安全性[58]。

4.1 酵母菌

關(guān)于AF期間酵母菌能否合成BA尚存爭議。以Delr等[59]為代表的絕大多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)AF結(jié)束后BA含量并無顯著變化。但也有少數(shù)研究指明一些酵母菌株在AF過程中能夠合成BA，且合成BA的能力存在菌株特異性。如Caruso等[60]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、檸檬克勒克酵母（Kloeckera apiculata）、星形假絲酵母（Candida stellata）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）都能夠產(chǎn)生微量的甲胺和胍基丁胺，S.cerevisiae還能產(chǎn)生一定濃度的乙醇胺，且較M.pulcherrima、C.krusei及K.apiculata合成的BA更豐富[61]。Bordiga等[62]研究了不同酵母菌株發(fā)酵葡萄酒時對BA含量及其相關(guān)前體氨基酸演變能力的影響，結(jié)果表明酵母菌也會參與葡萄酒中BA的合成，因此在進(jìn)行AF時謹(jǐn)慎選擇菌株和氮源十分重要。另外，Marcobal等[63]報(bào)道了酵母菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一定濃度的揮發(fā)性BA，但不影響葡萄酒的香氣成分及感官品質(zhì)。AF結(jié)束后，部分酵母菌在自身蛋白酶的酶解作用下發(fā)生自溶，釋放出游離氨基酸或多肽等BA合成的必需前體物質(zhì)，間接增加葡萄酒中BA的含量[21]。

4.2 乳酸菌

AF結(jié)束后，乳酸菌通常作為MLF的發(fā)酵劑分解L-蘋果酸，降低葡萄酒的酸澀感，在MLF完成后，葡萄酒中的BA水平普遍存在不同程度的升高。因此，目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為乳酸菌是葡萄酒中產(chǎn)生BA的主要微生物。迄今為止，在酒球菌屬（Oenococcussp.）、乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、明串珠菌屬（Leuconostocsp.）和片球菌屬（Pediococcussp.）等葡萄酒乳酸菌中普遍檢測出氨基酸脫羧酶活性[27]，且不同菌株在合成BA能力上存在顯著性差異。Landete等[64]發(fā)現(xiàn)Pediococcus parvulus和Lactobacillus hilgardii較O.oeni能產(chǎn)生更多的組胺，這可能是因?yàn)榍罢咄瑫r攜帶3 種編碼基因——hdc、odc和tdc的O.oeni菌株數(shù)量相對較少[65]。此外，值得注意的是，在一些產(chǎn)組胺和酪胺的乳酸菌中，其HDC和TDC活性由多個基因簇協(xié)同調(diào)控，進(jìn)而催化游離的氨基酸生成BA并分泌至胞外[66]。

4.3 其他微生物

葡萄酒釀造體系是一個極其復(fù)雜的混菌發(fā)酵系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除酵母和乳酸菌外，其他發(fā)酵微生物能否合成BA基本處于研究空白階段。芽孢桿菌（Bacillussp.）和巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）具備合成BA的能力，這在葡萄果醋的研究中得到證實(shí)[67]。然而利用從葡萄醪及葡萄酒中分離的40 株醋酸菌發(fā)酵模擬葡萄汁和葡萄汁，卻未能檢測出組胺、酪胺、腐胺等葡萄酒中常見的BA[65]。隨著葡萄酒微生物多樣性研究的不斷深入，探索其他真菌、細(xì)菌是否參與BA的合成對葡萄酒中BA的監(jiān)控是非常必要的。

4.4 葡萄酒中合成BA微生物的檢測

葡萄酒中的BA主要是通過脫羧途徑產(chǎn)生，故是否攜帶編碼氨基酸脫羧酶的基因是判斷該菌株是否能合成BA的重要依據(jù)。由于微生物在培養(yǎng)時，其新陳代謝容易產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì)，導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果，故傳統(tǒng)利用微生物方法對產(chǎn)BA菌的檢測復(fù)雜且不可靠。因此，目前采用分子生物學(xué)方法檢測微生物中是否存在編碼合成BA相關(guān)基因，以判斷其是否具有合成特定BA的潛力。設(shè)計(jì)脫羧酶基因序列相應(yīng)的引物，對被測菌株進(jìn)行PCR反應(yīng)，若能得到對應(yīng)產(chǎn)物，則證明該菌株具備合成BA的潛力[9]。Costantini等[68]對133 株從葡萄汁和葡萄酒中分離出的具有合成組胺、酪胺和腐胺能力的乳酸菌利用PCR法進(jìn)行氨基酸脫羧酶基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的陽性結(jié)果與對BA含量檢測的結(jié)果一致。Christine等[69]通過PCR擴(kuò)增技術(shù)比較了Lactobacillus30A、Clostridium perfringens和Lactobacillus buchneri的hdcA堿基序列和氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)引物JV16HC/JV17HC具有普適性，能夠?qū)崿F(xiàn)對攜帶hdc基因O.oeni的檢測。朱成龍等[70]利用PCR技術(shù)檢測40 株O.oeni產(chǎn)BA的能力，結(jié)果表明，40 株O.oeni均具有HDC、TDC、ODC活性，都可能代謝合成組胺、酪胺和腐胺，因此，不建議將上述菌株用作MLF的發(fā)酵劑。此方法具有快速、準(zhǔn)確可靠、易操作等優(yōu)點(diǎn)，可在BA合成前檢測出相關(guān)基因，分析其潛在危害，從分子生物學(xué)角度保證菌株的安全性[8]。

在此基礎(chǔ)上開發(fā)的多重PCR技術(shù)可同時檢測能合成多種BA的微生物。Coton等[71]采用以多個乳酸菌的hdc、tdc為目的基因的多重PCR技術(shù)，同時鑒定能產(chǎn)生組胺和酪胺的革蘭氏陽性菌。同年，Marcobal等[72]利用多重PCR以含有hdc、tdc和odc的基因片段為目的片段鑒定產(chǎn)生組胺、酪胺和腐胺的乳酸菌，隨后，將多重PCR的鑒定范圍優(yōu)化擴(kuò)展到革蘭氏陰性菌中，至此葡萄酒中常見的具有HDC、TDC和ODC活性的微生物均能通過多重PCR檢測。相比之下，該方法特異性強(qiáng)、成本低、耗時短、可同時擴(kuò)增多個DNA片段，能夠廣泛應(yīng)用于BA微生物溯源的檢測中。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和檢測技術(shù)的提高，利用實(shí)時定量PCR技術(shù)也能實(shí)現(xiàn)對BA微生物溯源的定量檢測[73]。

5 BA的檢測方法

葡萄酒中的BA含量是衡量葡萄酒質(zhì)量安全的重要指標(biāo)之一，開展葡萄酒中殘留BA及其代謝物的分離與檢測相關(guān)技術(shù)研究對BA快速檢測分析及葡萄酒的質(zhì)量安全具有重要的實(shí)踐意義。但由于BA本身缺少發(fā)色基團(tuán)，且不具備紫外吸收和熒光電化學(xué)活性，通常需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理，如提取、凈化、萃取、衍生等。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理不僅能夠減少基質(zhì)干擾，還能夠增加BA的信號強(qiáng)度，為次級分析奠定基礎(chǔ)[74]。傳統(tǒng)的預(yù)處理技術(shù)，如液-液萃?。╨iquid-liquid extractions，LLE）存在需要大量的危險(xiǎn)化學(xué)試劑、操作費(fèi)時、消耗樣品數(shù)量大等缺點(diǎn)。目前基于LLE發(fā)展出一些液相微萃?。╨iquid-phase micro-extraction，LPME）新技術(shù)，如鹽析輔助液液萃?。╯alting-out assisted liquid-liquid extraction,SALLE）、凝固-漂浮分散液液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplets，DLLME-SFO）、渦旋輔助表面活性劑增強(qiáng)乳化液液微萃?。╲ortex assisted surfactant-enhanced emulsification liquid-liquid microextraction，VSLLME）及分子印跡固相萃?。╩olecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）。MISPE是一種對葡萄酒中組胺具有特異性親和力的分子創(chuàng)新方法，具有較高的重復(fù)性和準(zhǔn)確性[75]。這些新技術(shù)不僅能夠避免傳統(tǒng)方法的弊端，還能夠有效提高預(yù)處理效果及降低BA檢出限[76-78]。

HPLC法是我國食品BA含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，其中使用C18反相柱的LC法具有高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)[79]，是目前檢測葡萄酒中BA含量的主要手段。此方法需要對樣品進(jìn)行衍生化，因?yàn)檠苌芙档虰A的極性，從而提高C18柱的分離率，使其對檢測器更為敏感[80]。樣品衍生化處理可在色譜柱前后進(jìn)行，但柱前衍生較柱后衍生更易受到矩陣效應(yīng)的影響[81]。此外，通常葡萄酒的pH值處于較低水平（pH 2.8～4.0）[82]，而大多數(shù)衍生化試劑的最佳反應(yīng)pH值均高于7.5，因此，需要使用緩沖液提升衍生化的效果[81]。葡萄酒中BA常用衍生化試劑有鄰酞醛（orthophthalaldehyde，OPA）、丹酰氯化物（dansyl chloride，DNS-Cl）、苯甲酰氯（benzoyl chloride，BZL-Cl）、6-氨基喹啉-羥基琥珀酰胺基氨基甲酸酯（6-aminoquinoline-hydroxysuccinamido carbamate，AQC）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、9-乙烯基氯甲酸甲酯、二乙基乙氧甲基丙醛酸鹽（diethylethoxymethyl propionate，DEEMM）和4-氯-3,5二硝基苯三氟等。OPA具有反應(yīng)快、耗時短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但其衍生物不穩(wěn)定，只能與初級BA反應(yīng)[83]，因此通常與巰基乙醇等其他試劑一起使用，以提高其衍生靈敏度和穩(wěn)定性[65]。DNS-Cl是BA檢測中應(yīng)用最廣泛的非特異性衍生化試劑，能與其他物質(zhì)如酚類或脂肪醇發(fā)生反應(yīng)[84]，具有穩(wěn)定性高、檢測范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，但其衍生化時間會隨溫度改變[85]。BZL-Cl是一種非特異性試劑，可以與其他基團(tuán)（酚類、脂肪族醇和一些糖）發(fā)生反應(yīng)[65]，具有廉價且衍生物穩(wěn)定[86]等諸多優(yōu)點(diǎn)，多用于衍生化反應(yīng)后的液體萃取。DEEMM能產(chǎn)生穩(wěn)定的衍生物[87]，但其操作復(fù)雜，衍生化反應(yīng)需在超聲浴中進(jìn)行30 min以上，還需要加熱2 h（70～80 ℃）使過量的DEEMM完全降解[88]。AQC是一種特異性試劑，其產(chǎn)生的化合物能穩(wěn)定保持1 周，但在使用紫外檢測器時過量的試劑峰（6-氨基喹啉）導(dǎo)致吸收率高而產(chǎn)生干擾，其檢測信號較小，因此該方法不能分離苯乙胺和亞精胺[89]。

近年來，將HPLC和毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）與紫外線（ultraviolet，UV）或熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）技術(shù)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對BA更高靈敏度的檢測。如HPLC-UV/FLD[74]、HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-evaporative light-scattering detector，HPLC-ELSD）[75]、HPLC-質(zhì)譜檢測器（HPLC-mass detector，HPLC-MSD）[76]等。在這些分析方法中，LC-MSD/MSD較為準(zhǔn)確和可靠，能夠快速分離并具有高靈敏度，發(fā)展前景廣闊。除此之外，薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、氣相色譜法（gas chromatography，GC）、離子色譜法（ion chromatography，IC）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、CE、BA傳感器法（Biosensors）等技術(shù)也能實(shí)現(xiàn)對BA含量的檢測[77]。CE目前可分為毛細(xì)管等速電流（capillary isotachophoresis，CITP）、毛細(xì)管等速泳-毛細(xì)管區(qū)電泳（apillary isotachophoresis-capillary zoneelectrophoresis，CITP-CZE）、非離子膠束電動色譜法（non-ionic micellar electrokinetic chromatography，MECK）等[30]。盡管遷移時間的重現(xiàn)性低于LC，但該技術(shù)具有快速、高效的優(yōu)勢，且成本低廉，被認(rèn)為是良好的測定發(fā)酵食品中BA的選擇[30]，其適用性取決于發(fā)酵飲料樣品中預(yù)期的BA水平。不同方法的精密度、線性范圍、檢出限、定量限、回收率、相關(guān)系數(shù)r等存在一定差異（表3），需結(jié)合待檢樣品的特點(diǎn)選擇可靠性優(yōu)、適用性強(qiáng)且高效準(zhǔn)確的方法。

表3 葡萄酒中BA的分析方法Table 3 Analytical methods for the detection of BA in wine

6 葡萄酒中BA的影響因素及其控制方法

在葡萄酒生產(chǎn)過程中，BA含量始終呈現(xiàn)動態(tài)變化。除少量存在于葡萄原料中的BA外，其主要形成于葡萄酒發(fā)酵和貯存階段。BA的形成一般需要3 個條件：一是游離的前體物質(zhì)；二是具備氨基酸脫羧酶的微生物；三是適宜的環(huán)境條件[74]。因此影響葡萄酒中BA含量的主要因素包括：1）葡萄原料，即游離氨基酸；2）葡萄酒微生物，即氨基酸脫羧酶及BA降解酶；3）工藝參數(shù)，即發(fā)酵工藝。發(fā)酵過程中，可根據(jù)葡萄酒中BA的相關(guān)影響因素，采取相應(yīng)的策略（圖2）來控制其含量。

圖2 葡萄酒釀造過程中BA的控制Fig.2 Control of BA during wine brewing

6.1 葡萄原料的優(yōu)選

葡萄原料中游離氨基酸蓄積量隨著品種、成熟度、產(chǎn)地、年份、氣候等多重因素的不同呈現(xiàn)顯著差異，進(jìn)而影響發(fā)酵后葡萄酒中BA的種類及組成[21,90-91]，從而影響最終葡萄酒中BA的含量。鄧玉杰等[92]對新疆不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中BA的含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，葡萄酒中BA的總量和種類因產(chǎn)地而異，即使是同一產(chǎn)區(qū)葡萄酒中BA含量也存在較大的差異。Wang Yaqin等[93]發(fā)現(xiàn)西北地區(qū)赤霞珠葡萄汁中BA包括腐胺、尸胺、苯乙胺、乙醇胺、亞精胺和酪胺6 種；Ortega-Heras等[94]比較了2008、2009、2010年份葡萄酒中的BA含量，發(fā)現(xiàn)2009年的葡萄酒中BA含量顯著高于其他兩個年份。值得說明的是并非所有影響葡萄原料的因素都會影響葡萄酒中BA含量，如干旱脅迫對葡萄原料中的BA組成及含量無顯著影響。

從反應(yīng)機(jī)制層面來說，減少底物供給能夠減少BA的生成，但若對葡萄漿果中的游離氨基酸含量進(jìn)行絕對的控制則會產(chǎn)生適得其反的效果。氮素對于酵母菌在葡萄酒環(huán)境中的生長代謝具有重要作用，當(dāng)葡萄汁/醪中的可同化氮含量低于140 mg/L時，酵母不僅難以順利完成AF，還會產(chǎn)生H2S，給葡萄酒的香氣帶來不良影響[95]。由此，選擇成熟度和衛(wèi)生狀況良好葡萄漿果，不僅能夠充分保障發(fā)酵的順利進(jìn)行，提高葡萄酒香氣的純凈度，還能減少具有合成BA潛力的雜菌侵染（圖2）。

6.2 葡萄酒微生物的選擇

微生物的選擇是影響葡萄酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，微生物代謝也是葡萄酒中BA的主要來源。葡萄酒中的BA主要由具有氨基酸脫羧酶的葡萄酒微生物代謝產(chǎn)生，不同菌株發(fā)酵的葡萄酒BA含量也存在差異，故在葡萄酒釀造過程中，接種不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶或具有AOs活性的菌株是降低產(chǎn)品中BA含量最有效的方式（圖2），前者可預(yù)防由葡萄酒微生物代謝導(dǎo)致的BA積累，后者能夠?qū)崿F(xiàn)對BA不同程度的降解。目前，具備此功能的乳酸菌已有相關(guān)報(bào)道，如Callejón等[96]從葡萄酒植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）J16和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）CECT中分離純化得到兩種AOs，能夠降解葡萄酒中部分組胺、酪胺和腐胺；Capozzi等[97]發(fā)現(xiàn)兩株L.plantarum能夠降解腐胺和酪胺。有學(xué)者探究了從葡萄酒中分離出的多種乳酸菌菌株對BA的降解能力，發(fā)現(xiàn)不同菌株對不同BA的降解能力存在顯著差異，其中干酪乳桿菌IFI-CA52因能產(chǎn)生胺氧化酶，具有較高的BA降解能力，其降解效果雖因乙醇、多酚、SO2的影響而有所下降，但仍具有降解葡萄酒中BA的潛力[98]。Cueva等[99]采用僅含有組胺、酪胺和腐胺為氮源的特定培養(yǎng)基對從土壤和葡萄藤中優(yōu)選出的真菌進(jìn)行培養(yǎng)，評價其對BA的降解潛力，結(jié)果表明，所有真菌都能降解至少兩種不同的胺類，具有較強(qiáng)的降解BA能力。牛天嬌[100]從乳酸菌中篩選具備產(chǎn)胺氧化酶能力的植物乳桿菌L.plantarumDN2，其在發(fā)酵黃酒時能夠降解高達(dá)50.3%的BA，且對成品酒的質(zhì)量和感官品質(zhì)無顯著影響。上述菌株在葡萄酒產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用性還將取決于它們的發(fā)酵特性，如MLF發(fā)酵性能、產(chǎn)香潛力等。

6.3 優(yōu)化發(fā)酵工藝

大量研究表明，葡萄酒中的BA主要來源于發(fā)酵過程，適宜的釀造工藝對于保證葡萄酒的安全性至關(guān)重要[101]。如前文所述，少量BA和大多BA生物合成的前體氨基酸均存在于葡萄漿果中，故對葡萄原料進(jìn)行除梗、破碎、壓榨、澄清等工藝處理必然會影響上述物質(zhì)在發(fā)酵基質(zhì)中的含量，最終影響酒體中BA的含量。因此，選擇合適的機(jī)械處理和澄清工藝可有效避免葡萄酒釀造過程中BA的積累。機(jī)械處理后，通常對葡萄醪進(jìn)行果膠酶處理以提高其出汁率，但果膠酶種類、添加時間、添加量等都會影響發(fā)酵基質(zhì)中氨基酸水平，從而進(jìn)一步對BA含量產(chǎn)生影響[102]。發(fā)酵溫度也是影響葡萄酒中BA含量的重要因素之一，研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒中BA生成速率通常隨MLF發(fā)酵溫度的升高而有所增加[103]，這是由于蛋白酶和氨基酸脫羧酶在較高溫度下酶活力更高，更利于BA的生成。此外，酸性環(huán)境有利于BA的生成，主要是因?yàn)榇蟛糠职被崦擊让傅幕盍υ趐H 4～5時較高，故當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)的pH值較高時有助于乳酸菌的快速繁殖，BA含量也會隨之增加[104]。綜上，在AF過程中，必須嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，如機(jī)械處理強(qiáng)度、發(fā)酵溫度和pH值，以減少這一過程中BA的積累。

MLF的啟動時間也對葡萄酒的BA水平存在影響。如Lonvaud等[105]對自發(fā)MLF、同時進(jìn)行AF與MLF、AF后進(jìn)行MLF 3 種處理后酒樣中的BA含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)AF結(jié)束后接種乳酸菌產(chǎn)生的BA最少，而自發(fā)MLF通常會導(dǎo)致最終葡萄酒中BA濃度的升高。因此，對于不進(jìn)行MLF的葡萄酒而言，可在AF結(jié)束后及時添加SO2、富馬酸等化學(xué)抑制劑抑制乳酸菌的生長；而對于陳釀型葡萄酒，在二次發(fā)酵MLF結(jié)束后，因酒液中pH值升高及SO2含量較低，發(fā)酵基質(zhì)中殘余的一些微生物如乳酸菌仍具備氨基酸脫羧能力，可采用倒罐轉(zhuǎn)罐、下膠、澄清或瞬時高溫滅菌處理，以及添加乳酸鏈球菌素、片球菌素等細(xì)菌素及溶菌酶等[106]及時清除乳酸菌，從而控制BA的含量（圖2）。陳釀階段的貯藏溫度和時間也是影響B(tài)A合成的重要因素[107]，由于酵母可通過自溶效應(yīng)釋放氨基酸，酒液與酒泥接觸過久也會增加BA積累的風(fēng)險(xiǎn)，因此在葡萄酒成熟時，應(yīng)適當(dāng)添加SO2、進(jìn)行滿罐低溫陳釀（圖2）。Jae-Young[108]和欒光輝[109]等分別探究了不同貯存溫度下韓國米酒和啤酒中的BA含量，結(jié)果表明貯存溫度與BA積累量呈負(fù)相關(guān)，然而Marco等[110]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒的貯藏溫度對BA濃度的影響較小。但為保證葡萄酒的飲用質(zhì)量，低溫貯存和運(yùn)輸仍是有效措施。

迄今為止，葡萄酒中BA一旦過量并無有效的方式去除。盡管極少數(shù)的葡萄酒微生物能夠合成AOs降解組胺、酪胺和腐胺等[8]，但這種微弱的自然降解并不能完全去除成品葡萄酒中的BA。因此，葡萄酒中BA控制的重點(diǎn)并非在于對已有BA的去除，而應(yīng)在于在葡萄酒釀造過程中多措并舉，及時控制BA的產(chǎn)生，確保葡萄酒的安全性。

7 結(jié)語

近年來，消費(fèi)者對于葡萄酒質(zhì)量安全的關(guān)注越來越多，BA含量對葡萄酒質(zhì)量的影響也是葡萄酒研究的前沿?zé)狳c(diǎn)之一，全球研究者以多個視角對葡萄酒中BA形成的機(jī)理展開研究，并獲得了一系列重要的認(rèn)知。目前普遍認(rèn)為葡萄酒中BA主要由大多數(shù)的乳酸菌和少數(shù)酵母菌代謝合成，其檢測主要依賴HPLC法，但該方法前處理繁瑣復(fù)雜，因此探索簡便快速、穩(wěn)定靈敏、可靠的檢測方法十分必要。葡萄酒中BA含量隨原料、微生物、工藝等因素的變化而變化，據(jù)此可實(shí)施相應(yīng)的葡萄酒工藝策略實(shí)現(xiàn)對BA含量的有效控制。其中合理使用菌株是控制葡萄酒中BA含量的重要手段，可采用多重PCR、實(shí)時定量PCR等分子生物學(xué)方法檢測發(fā)酵體系中是否存在乳酸菌等葡萄酒微生物。此外，由于葡萄酒發(fā)酵體系微生物的高度復(fù)雜性，當(dāng)前對除釀酒酵母與乳酸菌外的其他微生物，如非釀酒酵母、醋酸菌等是否參與BA的合成還缺乏全面的認(rèn)識，亟需進(jìn)一步的探索，為控制葡萄酒BA含量提供更多思路。同時我國葡萄酒生產(chǎn)商應(yīng)嚴(yán)格遵守相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，為消費(fèi)者提供安全健康的葡萄酒產(chǎn)品，促進(jìn)國產(chǎn)葡萄酒實(shí)現(xiàn)“量質(zhì)并重”的戰(zhàn)略轉(zhuǎn)型。