裸燕麥麩皮提取物和低頻脈沖刺激干預(yù)PFD 大鼠對(duì)ArfGAP3 通路的影響

李碧慧，王悅棠，劉完美，時(shí)歡，徐賽群，何嫻婕

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410219）

盆底功能障礙（PFD）系盆底肌肉、筋膜、韌帶損 傷而引發(fā)的盆腔臟器移位或機(jī)能減退，其典型表現(xiàn)為尿失禁、排尿困難、排便障礙等，臨床現(xiàn)有不同療法相關(guān)報(bào)道效果不一[1]。PFD 疾病初始病位在于脾腎，而病機(jī)則與腎氣不固、脾胃虛弱、中氣下陷密切相關(guān)，基于此機(jī)制有研究嘗試應(yīng)用裸燕麥麩皮提取物進(jìn)行調(diào)理，取得了較為理想的效果。低頻脈沖刺激作為近年來(lái)常見(jiàn)的物理療法，旨在通過(guò)刺激病灶局部特定的肌肉群，從而逐步恢復(fù)肌肉力量[2]。既有相關(guān)研究對(duì)上述兩種療法干預(yù)PFD 的效果均予以確認(rèn)，但尚未相關(guān)研究對(duì)兩種療法進(jìn)行比較研究，本文對(duì)其進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究可補(bǔ)充相關(guān)理論[3-4]。

1 材料與方法

1.1 研究動(dòng)物

2022 年10—12 月，對(duì)30 只成功造模的Wistar品系PFD 疾病大鼠進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由湖南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（SPF 級(jí)），飼養(yǎng)在恒濕55%±5%、（22±2）℃的環(huán)境中，保持晝夜節(jié)律，動(dòng)物自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑

UV-9000S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋，無(wú)錫瑪瑞特科技有限公司；BX-Y2426 離心沉淀機(jī)，北信未來(lái)物聯(lián)技術(shù)有限公司；JNT-DC 大小鼠體重秤，北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司；P36 生物刺激反饋儀，武漢康貝諾醫(yī)療設(shè)備有限公司。

裸燕麥麩皮，河北省張北縣燕北綠色保健食品廠；氫氧化鈉（1310-73-2UN），試劑純，天津鵬坤化工有限公司；鹽酸（H44020344），試劑純，合肥旭日化工有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑（6104-58-1），試劑純，長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司；石油醚（8032-32-4），試劑純，南京巨吉石化有限責(zé)任公司。

1.3 造模方法

參照《大鼠慢性肌筋膜疼痛觸發(fā)點(diǎn)的電生理和病理組織學(xué)研究》所用方法對(duì)大鼠造模，即觸摸鈍性打擊點(diǎn)肌肉有明顯的緊張帶，在緊張帶上尋找膨大結(jié)節(jié)，用電極插入膨大結(jié)節(jié)內(nèi)能引發(fā)局部抽搐反應(yīng)[5]。

1.4 干預(yù)方法

將成功造模的30 只PFD 大鼠均分為3 組，模型組不予其他干預(yù)，藥物干預(yù)組和物理干預(yù)組的干預(yù)周期均為15 d。

（1）藥物干預(yù)組（裸燕麥麩皮提取物灌胃）：裸燕麥麩皮經(jīng)碾磨、篩分、烘干、脫脂等處理，而后經(jīng)過(guò)濾、真空濃縮、低溫沉淀、真空干燥等操作獲得裸燕麥苷。建立裸燕麥苷-甲醇標(biāo)準(zhǔn)液（5 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以溶劑為空白對(duì)照，于561 nm 處測(cè)吸光值。得到裸燕麥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.300 7x+0.001 5。按照大鼠體重調(diào)整為100 μg/kg 劑量用于灌胃處理，灌胃頻率1 次/d[6]。

（2）物理干預(yù)組（低頻脈沖刺激）：用生物反饋電刺激療法對(duì)PFD 大鼠激痛點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，1 次/2 d，每次10 min。

1.5 數(shù)據(jù)采集

干預(yù)結(jié)束后頸椎脫臼法處死大鼠，取盆底病灶（恥尾肌周?chē)鷧^(qū)域）組織研磨后高速離心（3 000 r/min），加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，IPP 軟件分析各條帶灰度值。檢測(cè)指標(biāo)包括ArfGAP3、透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型膠原蛋白（TypeⅣ collagen，Ⅳ-C）含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0 分析，計(jì)量資料（±s）組間比較采用F/t檢驗(yàn)，HA、LN、Ⅳ-C 和ArfGAP3 含量的關(guān)聯(lián)用回歸模型分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組別蛋白含量的比較

不同組別PFD 大鼠的ArfGAP3、HA、LN、Ⅳ-C含量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明裸燕麥麩皮提取物灌胃及低頻脈沖刺激均能激活模型大鼠病灶局部的ArfGAP3 信號(hào)通路，猜測(cè)干預(yù)后的PFD 大鼠其局部衛(wèi)星細(xì)胞所介導(dǎo)的信號(hào)傳遞有所增強(qiáng)，對(duì)應(yīng)由多種分子參與的網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將開(kāi)啟并加速病灶肌肉的損傷修復(fù)。藥物干預(yù)組和物理干預(yù)組PFD 大鼠盆底組織中ArfGAP3、HA、Ⅳ-C 含量均高于模型組，而LN 含量均低于模型組。其中HA 作為酸性粘多糖，具有多種特性及重要的生理作用，其高水平表達(dá)不僅有利于組織再生，還有助于局部炎癥反應(yīng)作用的發(fā)揮。同時(shí)，HA 還將嵌入筋膜組織內(nèi)部，從而有效增強(qiáng)鄰近肌肉結(jié)締組織的滑動(dòng)能力，繼而減小局部病灶肌肉組織的繼發(fā)損傷程度。非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白LN 作為基底膜核心成分，其含量改變一般與肝臟纖維化改變相關(guān)。

表1 不同組別大鼠ArfGAP3、HA、LN、Ⅳ-C 含量的比較（±s，mg/L）

表1 不同組別大鼠ArfGAP3、HA、LN、Ⅳ-C 含量的比較（±s，mg/L）

注：a 表示藥物干預(yù)組與模型組差異顯著（P ＜0.05）；b 表示物理干預(yù)組與模型組差異顯著（P ＜0.05）；c 表示物理干預(yù)組與藥物干預(yù)組差異顯著（P ＜0.05）。

組別 ArfGAP3 HA LN Ⅳ-C模型組（n=10） 67.41±4.96 15.57±1.59 55.70±4.05 7.99±1.08藥物干預(yù)組（n=10） 74.09±5.81a 18.74±1.44a 20.41±1.30a 11.40±1.19a物理干預(yù)組（n=10） 94.65±7.19bc 24.74±3.05bc 18.42±1.55bc 19.34±2.31bc

2.2 物理干預(yù)組蛋白含量的回歸分析

基于表1 研究結(jié)果，選擇干預(yù)效果較為顯著的物理干預(yù)組大鼠進(jìn)行進(jìn)一步分析。數(shù)據(jù)顯示，以病灶組織中ArfGAP3 含量為因變量，以HA、LN、Ⅳ-C 含量為自變量，擬合的回歸方程（ArfGAP3 含量=1.45+0.41×HA 含量+0.50×LN 含量+0.89×IV-C 含量）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HA、LN 和Ⅳ-C 對(duì)因變量的影響程度（OR值）分別為5.77、6.16 和4.66，說(shuō)明ArfGAP3 信號(hào)通路激活后相應(yīng)ArfGAP3 蛋白表達(dá)有所增加，同時(shí)會(huì)不同程度影響病灶局部HA、LN、Ⅳ-C 含量，因此通過(guò)相關(guān)常用指標(biāo)監(jiān)測(cè)也可評(píng)估或預(yù)測(cè)不同干預(yù)措施的效果。

3 討論與結(jié)論

PFD 的發(fā)生機(jī)制包括神經(jīng)肌肉損傷、基質(zhì)組分改變、信號(hào)網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)激活等，無(wú)論何種機(jī)制，均與細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)信號(hào)分子存在一定關(guān)聯(lián)，因此越來(lái)越多基礎(chǔ)研究將關(guān)注重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至信號(hào)分子蛋白，ArfGAP3 成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。基于上述研究結(jié)果，本課題組猜測(cè)LN 同樣參與了PFD 模型大鼠病灶的修復(fù)過(guò)程，具體機(jī)制或原因尚需后續(xù)深入探究。細(xì)胞外間質(zhì)基底膜中Ⅳ-C 含量的增加在維持肌肉彈性的同時(shí)，能快速增加肌肉量，繼而可能降低局部疼痛感并提升病患阻力訓(xùn)練的效果。除此之外，物理干預(yù)組PFD 大鼠Ⅳ-C 蛋白含量的高水平表達(dá)間接證實(shí)其干預(yù)措施對(duì)原發(fā)病灶的修復(fù)效果更佳，低頻脈沖刺激能更有效地將構(gòu)建肌肉的肌原纖維傳遞至整個(gè)肌肉纖維，從而保持病灶局部肌肉群較好發(fā)揮正常功能[5]。

綜上可知，低頻脈沖刺激和裸燕麥麩皮提取物雖然均能對(duì)PFD 大鼠病灶局部ArfGAP3 通路產(chǎn)生激活作用，但低頻脈沖刺激物理治療方式能更為快捷且顯著地降低LN 蛋白表達(dá)，增加HA、Ⅳ-C 蛋白表達(dá)，可能對(duì)病灶局部肌功能恢復(fù)有更好促進(jìn)作用。